菠萝（Ananas comosus）是仅次于香蕉和柑橘类水果的第三大热带水果，原产于南美洲热带和亚热带地区，我国的广东、广西、福建、台湾等均有广泛种植。目前全球共有85个国家种植菠萝，种植面积约占全球热带水果的1/3[1]。菠萝有着独特的风味和丰富的营养价值，是许多食谱的重要组成部分，受到国内外广大消费者的青睐，在食品行业中具有无可估量的价值。研究表明，菠萝中除含有丰富的维生素C、无机盐、有机酸外，还含有蛋白酶、粗纤维、白藜芦醇、酚类等营养成分，具有很高的食用价值[2]。米酒是由蒸熟的糯米或江米，拌上酒曲发酵而成的。作为我国传统特色饮品，其历史悠久，营养丰富，广受喜爱。
菠萝皮渣是菠萝产品加工所产生的副产品，主要由果皮和果渣组成，约占果实质量的25%～35%左右[3]。研究表明，菠萝皮渣主要由膳食纤维、黄酮类、果胶、糖类及多酚类[4]组成。为了增加菠萝的附加值，减少菠萝皮渣资源浪费，国内外学者对菠萝皮渣的开发利用进行了大量的研究[5-8]，其中发酵菠萝果酒是研究利用的重要途径[9-10]。目前，国内外研究菠萝皮渣主要集中在其功能成分（如多糖、纤维素、多酚和黄酮类物质）的提取，也出现了菠萝皮渣发酵酒的相关发研究。但菠萝皮渣发酵酒颜色灰暗、口感粗糙、香气稀少，为解决这一系列问题，提升其感官品质，结合相关文献研究，开发菠萝皮渣糯米酒。本实验室利用菠萝皮渣和糯米酒联合发酵，开发菠萝皮渣糯米酒。采用相关国标检测方法、液相色谱（liquid chromatography，LC）及气相色谱质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法测定发酵过程中可溶性固形物、酒精度、有机酸、挥发酸和香气成分等成分变化。通过研究果酒发酵过程中物质变化规律，加强对菠萝皮渣糯米果酒生产的控制，为菠萝皮渣的利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料和菌种
菠萝（卡因品种）：广东省湛江市；白砂糖（食品级）：湛江华资农垦糖业发展有限公司广丰分公司；QA23酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（简称Q）：上海杰兔工贸有限公司；糯米酒（酒精度12%vol，糖度7.3°Bx）：本实验室自酿。
1.1.2 化学试剂
氢氧化钠（分析纯）：广东省化学试剂工程技术研究开发中心；磷酸盐缓冲溶液：国药集团化学试剂有限公司；有机酸混标：美国Sigma-Aldrich公司；挥发酸混标：北京坛墨质检科技有限公司。
1.2 仪器与设备
PAL-3糖度计：日本ATAGO公司；BSA4202S电子天平、CPA225D十万分之一分析天平：德国塞多利斯公司；QP-2020SE气相色谱质谱联用仪、LC-20A高效液相色谱仪：日本岛津公司；JYZ-D68榨汁机：九阳股份有限公司；25 L发酵罐：石家庄恒昌食品机械包装公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菠萝皮渣糯米果酒发酵工艺流程及操作要点
菠萝→清洗→削皮→菠萝皮渣榨汁→糖度调配→杀菌→冷却→接种发酵→主发酵→过滤→加入糯米酒后陈酿发酵→过滤→澄清→罐装→菠萝皮渣糯米果酒
操作要点：
清洗、削皮：选择八、九成熟新鲜菠萝，用清水冲洗菠萝，晾干，将菠萝皮和肉切开分离。
榨汁：将菠萝皮渣用榨汁机榨汁，条件为12 000 r/min、3 min。
糖度调配：菠萝皮渣汁中加入白砂糖，调整糖度至20°Bx。
杀菌、冷却：将菠萝皮渣汁100 ℃杀菌30 min，然后冷却至室温。
接种发酵：菠萝皮渣汁与蒸馏水按1∶1（V/V）混合，在菠萝皮渣醪中接入5%活化酵母。
主发酵：在28 ℃条件下进行主发酵，发酵7 d结束。实时监测发酵汁残糖含量，24 h内残糖含量若不发生变化，则主发酵结束。
过滤：发酵第8天，采用8层纱布过滤酒醪，取清液。
陈酿发酵：菠萝皮渣酒中加入20%的糯米酒，移入20 L新的发酵罐，充氧量为5%，静置发酵，于20 ℃条件下发酵60 d。实时监测其残糖含量，24 h内残糖含量不再发生变化时，视作发酵结束。
澄清：菠萝皮渣糯米果酒20 ℃条件下静置24 h。
灌装：用750 mL棕色葡萄酒瓶灌装菠萝皮渣糯米果酒。
1.3.2 菠萝皮渣糯米酒基本理化指标测定
可溶性固形物含量（糖度）：利用糖度计进行测定；酒精度：参照国标GB/T 13662—2008《黄酒》中方法进行测定；总酸含量：采用滴定法进行测定。
1.3.3 有机酸含量
有机酸含量采用反相高效液相色谱（reversed phase highperformance liquid chromatography，RP-HPLC）法进行测定[11]。
样品前处理：吸取5.00 mL的待测样品，高速离心（5 000 r/min、5 min），取1.00 mL上清液，用1%磷酸溶液（pH 3.60）稀释10倍，用0.22 μm尼龙膜过滤，滤液上机分析。
色谱条件：BP-OA色谱柱（300 mm×7.8 mm）；BP-OA H+Guard保护柱（50 mm×4.6 mm）；流动相A（超纯水）∶B（1%磷酸溶液）=20∶80（V/V），等度洗脱，流速0.5 mL/min；柱温30 ℃；紫外检测器，检测波长210 nm；进样量10.00 μL。
定性定量方法：分别精密称取5.00 mg草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸和乙酸置于5 mL容量瓶中，用流动相B定容至刻度线，得到质量浓度为1.00 mg/mL的有机酸母液，进一步通过梯度稀释制备质量浓度为0.80 mg/mL、0.60 mg/mL、0.40 mg/mL、0.20 mg/mL的标准品工作液，以各标准品质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。按照标准曲线回归方程计算各物质的质量浓度。
1.3.4 挥发酸含量的测定
挥发酸的测定采用高效液相色谱法，其色谱条件如下：Thermo C18色谱柱（4.6 mm×250 mm）；紫外检测器；流动相：A为50 mmol/L磷酸二氢钾（pH 2.70），B为甲醇，A∶B=97∶3（V/V）；洗脱模式：等度洗脱；流速：0.8mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：210 nm；进样量：2 μL。
定性定量方法：配制各标准品母液，梯度稀释母液，0.22滤膜过滤，进样量5 μL。以标准品质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。稀释样品至样品中待测有机酸的质量浓度介于上下检测限之间，0.22 μm滤膜过滤，进样量5 μL。按照标准曲线回归方程计算各挥发酸的含量。
1.3.5 香气成分的测定
挥发性香气成分采用气质联用法，其检测条件如下：
样品前处理：将菠萝皮渣糯米果酒用0.22 μm的有机系滤头，取0.5 mL过滤后的酒样，加入15 mL顶空瓶中，加盖密封。
气相色谱条件：VF-Wax毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.2 μm）；程序升温：初始温度45 ℃，保留2 min，以5 ℃/min的速率升至180 ℃，再以20 ℃/min的速率升至240 ℃，保留2 min；进样口温度250 ℃；载气为高纯度氦气（He），流速1 mL/min；不分流进样。质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度250 ℃，全扫描模式，扫描范围35～500 m/z，溶剂延迟3.5 min。
定性定量方法：质谱结果经Wiley.lib数据库和美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）14.lib谱库检索，仅对匹配值（similarity index，SI）＞90（最大匹配值为100）的鉴定结果予以报道。采用峰面积归一化法计算菠萝皮渣糯米果酒中各挥发性成分的相对含量。
2 结果与分析
2.1 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程基本理化指标的分析
2.1.1 糖度和酒精度的变化
菠萝皮渣糯米果酒发酵过程糖度和酒精度的变化结果如图1所示。
图1 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中糖度和酒精度的变化
Fig.1 Changes of sugar content and alcohol content in the fermentation process of pineapple peel and glutinous rice wine
由图1可知，初始糖度为20°Bx，在主发酵发酵0～4 d，糖度迅速下降至6.81°Bx，发酵4～8d，糖度变化不大，说明主发酵结束。第8天陈酿发酵，因为加入的糯米酒糖度高于主发酵后的菠萝皮渣酒，导致糖度有所上升后下降，然后趋于平稳。酒精度在主发酵0～8 d上升，第8 天酒精度达8.30%vol，陈酿发酵8～15 d酒精度上升至11.37%vol后趋于稳定，可能是因为糯米酒的加入，增加了发酵醪中糖含量，酵母再次利用糖转化为乙醇，使酒精度升高。发酵前期，酵母菌对糖的消耗较快，转化成酒精的速度也较快，随着发酵的进行，发酵汁中残糖的含量降低，能被利用的糖已被利用，后期酒精度逐渐升高，可能是因为增加了发酵醪中糖含量，糖度降低的趋势和酒精度增加的趋势基本一致，因为酒精发酵就是把发酵糖转化成酒精的过程，酿酒原料的糖酸比直接决定了酒的酒精度以及酒的口感平衡度。
2.1.2 pH和总酸含量的变化
菠萝皮渣糯米果酒发酵过程pH和总酸含量的变化结果见图2。由图2可知，果酒发酵过程中pH在3.80～3.50之间，主发酵0～8 d时pH值下降，陈酿发酵第10天时，pH值最低，为3.57，然后逐渐上升至3.70。总酸含量在主发酵0～8 d内总体呈上升趋势，在第6天稍微有些下降，可能发酵过程中酵母分解菠萝皮渣，使酸性物质溶出。8～15 d内总酸含量呈上升趋势，可能是酵母代谢使苹果酸转化成其他有机酸，使酸度增加明显。陈酿阶段15 d之后，总酸含量下降，可能由于在低温高酒精度下，菠萝皮渣糯米果酒中的酸与醇类结合生成酯类、醛类等芳香物质，增加果酒香气，改善品质[12]。总酸含量是直接影响酒中pH的主要因素，总酸含量增加，pH值下降，呈负相关关系。
图2 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中pH值（A）和总酸含量（B）变化
Fig.2 Changes of pH (A) and total acid content (B) in the fermentation process of pineapple peel and glutinous rice wine
2.2 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程有机酸含量的变化
有机酸对果酒的口感和风味都具有重要的调节作用。菠萝皮渣糯米果酒发酵过程有机酸含量的变化结果见表1。由表1可知，菠萝皮渣糯米果酒发酵过程一共检出8种有机酸，主要是柠檬酸和苹果酸。有机酸在主发酵和后陈酿发酵过程中品种和含量变化较大，主发酵8 d之后，草酸未检出；前10 d丙酮酸含量降低了0.12 g/L，乙酸含量升高了0.18 g/L，从第10 天乙酸含量开始减少，到第60 天时降低了0.05 g/L，因为一些乙酸被激活以形成乙酰-辅酶A（acetylcoenzyme A，CoA），可以进入三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）或产生脂肪酸或与醇反应生成乙酸酯[13]。第10天时琥珀酸含量升高了0.11 g/L，苹果酸含量不断降低，第60天时降低了2.26 g/L，因为DL-苹果酸可进入酵母细胞[14]。发酵结束后与菠萝汁相比，乳酸含量升高0.49 g/L，丙酮酸和乙酸变化较小，其他有机酸含量降低，其中柠檬酸和苹果酸含量降低较多，分别为10.85 g/L和4.34 g/L。菠萝皮渣糯米果酒中柠檬酸含量最高，第60天时为3.51 g/L，是果酒酸味的主要来源，较高的乳酸含量增加口感的柔和性。
表1 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中有机酸含量变化
Table 1 Change of the organic acid content in the fermentation process of pineapple peel and glutinous rice wine
注：“-”表示未检出。
2.3 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程挥发酸含量变化
挥发酸作为果酒品质的一项重要指标，在国家标准中有明确的的限量要求（果酒中挥发酸含量应≤1.2 g/L）。挥发酸含量过高表示酒样酸败，酒样颜色灰暗浑浊、能闻到刺鼻的酸味，口感过酸失衡。采用高效液相色谱测定菠萝皮渣糯米果酒发酵过程挥发酸含量变化，结果见表2。由表2可知，果酒挥发酸主要是甲酸和乙酸。在发酵前期，甲酸、乙酸含量较高，在第2天时甲酸和乙酸含量分别达1.41 g/L和0.71 g/L，随着发酵的进行，挥发酸含量逐渐降低，第60天时甲酸和乙酸含量分别降低了1.11 g/L和0.45 g/L，可能是果酒在微氧的条件下贮藏，挥发酸可与醇类结合产生酯类，如乙酸与乙醇可生产乙酸乙酯，增加果酒香气[15]。农业行业标准NY/T 1508—2007《绿色食品果酒》中规定果酒中挥发酸含量＜1.50 g/L，陈酿60 d时菠萝皮渣糯米果酒挥发酸含量为0.56 g/L，满足要求。
表2 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程挥发酸含量变化
Table 2 Change of volatile acid content in the fermentation process of pineapple peel and glutinous rice wine
注：“-”表示未检出。
2.4 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程香气成分变化
采用气质联用法测定菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中挥发性香气成分变化，结果见表3。由表3可知，菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中共检出88种挥发性香气成分，其中主要有41种酯类、22种醇类、10种酸类和15种其他类。菠萝主要香气成分是酯类和萜烯类物质[16]，己酸乙酯、异丁酸乙酯、菠萝乙酯、丁酸乙酯、3-己烯酸乙酯和呋喃酮（dimethyl hydantoin formaldehyde resin，DMHF）、癸醛等是菠萝的主要香气成分[17]。
如表3所示，酯类物质发酵过程中呈现先上升后下降的变化趋势。酯类含量发酵前是39.27%，发酵至10 d，上升至59.24%，从第10天到第60天，酯类物质含量下降，最终降至47.19%，其中第4天和第10天最高，分别为55.42%和59.24%，在第8天时加入糯米酒，糯米酒与菠萝醪经过两天融合，香气更加突出，在第10天，酯类含量达到最高，在10～40 d酯类含量呈下降趋势；从40～60 d，乙酸异戊酯和葵酸乙酯含量呈现微量上升。
醇类是酒的主体成分，少量高级醇嗅觉阈值较低，赋予果酒较高的香气值，也促进其他香气物质的溶解，对酒体丰满起着不可忽视的作用[18]。由表3可知，菠萝醇是果酒特有的香气成分，在发酵过程中呈先升后降的变化趋势，在第8天时，达到最大，相对含量为0.77%，在第8天后加入糯米酒，高级醇含量增多，促进酯化反应的发生，使酯类含量在第10天达到最高。糯米酒中糖含量较高，微量的酵母利用新加入糯米酒中的糖，继续生长，产生醇类，使醇类含量缓慢上升，第25天时，达到最大，相对含量为25.92%。整个过程中苯乙醇含量都较高，第40天时，达到最大，为21.33%，苯乙醇香气值很高，对果酒浓郁优雅风味的形成具有重要作用[19]。
酸类物质是果酒的重要呈香物质，其中不饱和酮酸对果酒风味影响最大[20]，发酵过程中不断变化。第8天时，酸类物质相对含量达14.43%，且成分较多，发酵第8天时，己酸、辛酸、壬酸和癸酸含量变化较大，分别为1.84%、7.95%、3.04%、1.49%，加入糯米酒与菠萝皮渣混合，部分有机酸含量变化。发酵第60天时己酸和辛酸含量较高，分别为0.7%和3.28%，为果酒的主要酸类物质，增加菠萝皮渣糯米果酒的柔和感。
表3 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中挥发性香气成分相对含量测定结果
Table 3 Determination results of relative contents of volatile aroma compounds in the fermentation process of pineapple peel and glutinous rice wine%
续表
注：“-”表示未检出。
3 结论
通过采用国标检测方法、液相色谱及气相色谱质谱联合法，研究菠萝皮渣糯米果酒在发酵过程中可溶性固形物、酒精度、有机酸、挥发酸和香气成分等成分变化。结果表明，菠萝皮渣糯米果酒在发酵过程中，糖度下降，总酸含量下降，酒度上升，有机酸含量总体下降，香气含量增加。在发酵过程中，菠萝皮渣糯米果酒中共检测出88种香气成分，其中41种酯类、22种醇类、10种酸类和15种其他类。本研究通过将菠萝皮渣发酵汁与糯米酒混合发酵，有效降低了菠萝皮渣发酵酒中有机酸和挥发酸的含量，使酒样口感更圆润柔和，酸度协调，研究结果为开发利用菠萝皮渣提供一种利用途径，并具有广阔的应用价值。
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