纳豆是日本传统的发酵食品之一，起源于我国的豆豉[1]。唐朝时期，鉴真和尚东渡日本将豆豉带到了那里，逐渐演变成为纳豆[2-3]。在我国，李时珍的《本草纲目》中就已经有豆豉可以入药的记载[4]；在日本民间，纳豆长期应用于治疗伤寒、痢疾等疾病[5-6]。20世纪日本研究者须见洋行首次从纳豆中分离出一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），并发现其产生的纳豆激酶具有良好的溶解血栓的功能[7]。1905年，SAUMUR从纳豆中分离出一株γ-聚谷氨酸生产菌，命名为B.natto Sawamura[8]，后来FUJI等学者又证明纳豆中含有γ-聚谷氨酸[9]。
γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamate acid，γ-PGA）是一种由微生物发酵合成的氨基酸聚合物，通过谷氨酸的α-NH2和γ-COOH以酰胺键结合形成[10]。γ-PGA主链上存在大量肽键，在自然界或人体内可生物降解成短肽小分子和氨基酸单体，不产生毒副作用[11]，分子链上具有大量的活性较高的游离侧链羧基（-COOH），易于和一些药物结合生成稳定的复合物[12]，具有优良的生物兼容性和生物降解性，是理想的可生物吸收的医药用高分子材料[13]。本试验选取从纳豆中分离的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）TK-2菌株，通过微生物发酵生产γ-聚谷氨酸，具有容易操作和控制，生产成本较低，产率较高的特点。γ-PGA对环境无污染，为绿色生物产品，被广泛应用于医药制造，食品加工，蔬菜、水果、海产品的防冻、保鲜及植物种子保护等许多领域，是一种具有极大开发价值和广阔应用前景的多功能新型生物制品[14]。本研究通过单因素以及正交试验对Bacillus natto TK-2产γ-PGA的发酵工艺进行优化，并对其发酵产物进行高效液相色谱（high performance liquid chromatogramphy，HPLC）分析，为γ-PGA的综合开发利用提供理论支撑依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与试剂
Bacillus natto TK-2菌种：学校食品工程实验室提供；蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、味精等（均为食品级）、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸铵、尿素、乙醇、硝酸钠、氢氧化钠、柠檬酸、硝酸钾等（均为分析纯）：北京百灵威科技有限公司。
1.1.2 培养基
肉汤培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，琼脂2%，pH 7.2，121 ℃，0.1 MPa，灭菌15 min。种子液培养基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，MgSO4·7H2O 0.05%，K2HPO4·3H2O 0.26%，pH 7.2，121 ℃，0.1MPa，灭菌20min。发酵培养基：碳源2.5%，味精2%，氮源3%，MgSO4·7H2O 0.05%，K2HPO4·3H2O 0.26%，pH 7.2，分装于250 mL的摇瓶中，每瓶装液50 mL，121 ℃，0.1 MPa，灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
CX43光学显微镜：日本OLYMPUS公司；LRH250C生化培养箱：广东省医疗器材厂；冷冻干燥机：美国KENDRO公司；756型紫外/可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；PHSJ-4A型pH计：上海雷磁公司；AvantiJXN-30型高效离心机：BECKMAN COULTER公司；LC-100PHP型高效液相色谱仪：杭州俊升科学器材有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌种的培养
将菌株TK-2接种于肉汤培养基，37 ℃活化培养1 d，再接种于种子培养基中，37 ℃、170 r/min培养12 h，按一定接种量接种于发酵培养基，37 ℃、140 r/min条件下培养。
1.3.2 纳豆芽孢杆菌TK-2生长曲线的测定
利用分光光度法测定[15]。取29 mL空白液再加入1 mL发酵液，混合均匀，倒入比色皿中，在波长660 nm处测定OD660nm值，每隔2 h测定1次，直至菌种由生长期进入到衰退期。
1.3.3 γ-聚谷氨酸的纯化
（1）菌体的分离
将发酵液12 000 r/min、4 ℃条件下离心30 min，取上清液备用。
（2）乙醇沉淀
在上清液中缓慢加入3倍体积的体积分数95%乙醇提取，加入后出现蛋清状的物质，缓慢旋转摇瓶，使蛋清状物质慢慢成团聚集，最后用镊子夹出，用去离子水洗涤沉淀物[16]。
（3）丙酮沉淀
将乙醇沉淀后的粗样品溶解在0.015 mol/L、pH 7.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，加入4倍体积的丙酮，缓慢旋转摇瓶，使蛋清状物质慢慢成团聚集，最后用镊子夹出，用去离子水洗涤沉淀物[17]。
（4）透析除盐
把丙酮沉淀提取的沉淀物倒入截流分子质量8 000～12 000 Da的透析袋内，每隔2 h换1次水，4 ℃冰箱中保存，透析6 h，取出进行冷冻干燥称其质量[18]。
1.3.4 γ-聚谷氨酸产量的测定
将纯化后的γ-聚谷氨酸冷冻干燥后称质量，计算其产量。
式中：M为制备的γ-聚谷氨酸质量，g；V为发酵液的体积，L。
1.3.5 HPLC分析
称取谷氨酸标准样0.1 g，用蒸馏水定容至10 mL，取1 mL为待测谷氨酸标准样溶液。称取提纯的γ-聚谷氨酸0.1 g，用蒸馏水定容到10 mL，在封闭的磨口水解管中加入1 mL γ-聚谷氨酸溶液和10 mL的6 mol/L的盐酸，37 ℃，水解24 h，12 000 r/min离心30 min，取上清液1 mL为待测γ-聚谷氨酸水解液。
HPLC条件：荧光检测器；HydrosphereC18分析柱（4.6mm×25mm）；流动相：体积比为6∶4的乙腈水溶液；流速：0.5mL/min；检测波长：发射波长350 nm，激发波长450 nm；用0.45 μm的滤膜将样品过滤除去杂质；进样量20 μL。
1.3.6 发酵培养基配方优化单因素试验
（1）碳源种类及添加量的选择
选取葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、苹果酸、乙酸、麦芽糖、可溶性淀粉、柠檬酸、甘油等10种碳源，按2%水平分别加入到发酵培养基中，发酵培养，测定γ-PGA产量，确定最佳碳源。选取最佳碳源，按1%～8%的水平分别加入到发酵培养基中，发酵培养，测定γ-PGA产量，确定碳源最佳添加量。
（2）氮源种类及添加量的选择
选取酵母浸粉、玉米浆、蛋白胨、牛肉膏、NH4Cl、尿素、KNO3、NaNO3、（NH4）2SO4、NH4NO310种氮源，按2.5%水平分别加入发酵培养基中，发酵培养，测定γ-PGA产量，确定最佳氮源。选取最佳氮源，按0.5%～4.0%的水平分别加入发酵培养基中，发酵培养，测定γ-PGA产量，确定氮源最佳添加量。
（3）味精添加量的选择
味精按1%～7%的水平分别加入发酵培养基中，发酵培养，测定γ-PGA含量，确定最佳味精添加量。
（4）初始pH值的选择
选取发酵培养基初始pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的发酵培养，测定γ-PGA产量，确定最佳初始pH值。
1.3.7 发酵培养基配方优化正交试验设计
在单因素试验的基础上，选取碳源、氮源、味精的添加量3个因素，以γ-PGA产量为评价指标，按表1进行正交试验[19]。
表1 发酵培养基配方优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation medium formula optimization
1.3.8 发酵工艺条件优化单因素试验
（1）装液量的选择
选取装液量分别为30 mL/250 mL、40 mL/250 mL、50mL/250mL、60mL/250mL、70mL/250mL、80mL/250mL、90 mL/250 mL，接种量2%，37 ℃、140 r/min振荡培养24 h，测定γ-PGA含量，确定最佳的装液量。
（2）接种量的选择
装液量为70mL/250 mL，接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，37 ℃、140 r/min振荡培养24 h，测定γ-PGA产量，确定最佳接种量。
（3）培养温度的选择
装液量为70 mL/250 mL，接种量2%，培养温度分别为28 ℃、32 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃，140 r/min振荡培养24 h，测定γ-PGA产量，确定最佳培养温度。
（4）转速的选择
装液量为70 mL/250 mL，接种量2%，37 ℃，转速分别为80 r/min、110 r/min、140 r/min、170 r/min、200 r/min振荡培养24 h，测定γ-PGA产量，确定最佳的转速。
1.3.9 发酵动态曲线的绘制
在优化的最佳培养基和最佳发酵培养条件下进行摇瓶发酵实验，发酵培养30 h，每隔3 h从摇床上取下一瓶，测定发酵液的γ-PGA产量及其在波长660 nm处的OD660nm值，绘制Bacillus natto TK-2的发酵动态曲线[20]。
2 结果与分析
2.1 纳豆芽孢杆菌TK-2的生长曲线
每隔2 h测定波长660 nm处种子的OD660nm值，测定30 h菌种的生长状态，直至菌种由生长期进入到衰退期，生长曲线如图1。
图1 纳豆芽孢杆菌TK-2生长曲线
Fig.1 Growth curve of Bacillus natto TK-2
由图1可以看出，纳豆菌生长6 h开始进入对数生长期，12 h进入对数生长的中期，在12 h时把种子液接种到发酵液中。
2.2 发酵培养基配方的优化
2.2.1 碳源种类及添加量的确定
装液量为70 mL/250 mL，接种量2%，37 ℃、140 r/min振荡培养24 h。不同的碳源对γ-PGA产量的影响如图2，碳源添加量对γ-PGA产量的影响结果见图3。
图2 不同碳源对γ-聚谷氨酸产量的影响
Fig.2 Effect of different carbon sources on γ-polyglutamic acid yield
由图2可以看出，葡萄糖和蔗糖做为碳源的γ-PGA的产量比麦芽糖等其他碳源相对较好，可能是葡萄糖和蔗糖作为培养基的碳源比较有利于菌体的发酵反应。结合经济条件考虑，选择葡萄糖为最佳碳源比较合适。
图3 葡萄糖添加量对γ-聚谷氨酸产量的影响
Fig.3 Effect of glucose addition on γ-polyglutamic acid yield
由图3可以看出，随着葡萄糖添加量的增加，发酵液中的γ-PGA产量逐渐增大，当葡萄糖添加量为2%时，γ-PGA产量最高。再增加葡萄糖添加量，γ-PGA产量逐渐降低。这是因为当葡萄糖添加量太低时，不够菌体生长所需；而当葡萄糖添加量过大时，对菌体的生长及γ-PGA的生成有抑制作用。综合分析，选择葡萄糖添加量为2%比较合适。
2.2.2 氮源种类及添加量的确定
装液量为70 mL/250 mL，接种量2%，37 ℃、140 r/min振荡培养24 h。不同的氮源对γ-PGA产量的影响如图4，氮源添加量对γ-PGA产量的影响结果见图5。
图4 不同氮源对γ-聚谷氨酸产量的影响
Fig.4 Effect of different nitrogen sources on γ-polyglutamic acid yield
由图4可以看出，蛋白胨、牛肉膏等有机氮源对发酵液中生成γ-PGA产量比氯化铵、硫酸铵等无机氮源高。而有机氮源中蛋白胨对发酵液的γ-PGA产量的效果要优于其他的有机氮源，可能是蛋白胨做为培养基中的有机氮源更有利于菌体的发酵反应。综合分析，选择蛋白胨为最优氮源。
图5 蛋白胨添加量对γ-聚谷氨酸产量的影响
Fig.5 Effect of peptone addition on γ-polyglutamic acid yield
由图5可以看出，随着蛋白胨添加量逐渐增大，发酵液中的γ-PGA产量逐渐增大，当蛋白胨添加量为2.5%时，发酵液中γ-PGA产量最高，而再增加蛋白胨添加量，γ-PGA产量逐渐降低。这是由于发酵反应初期，菌体的浓度比较大，随着蛋白胨添加量的加大，菌体与蛋白胨接触比较充分，发酵反应比较充分，随着反应的进行，菌体逐渐消耗，即使增大蛋白胨添加量，发酵反应程度也会降低。综合分析，选择蛋白胨添加量为2.5%比较合适。
2.2.3 味精添加量的确定
装液量为70 mL/250 mL，接种量2%，37 ℃、140r/min振荡培养24h。味精不同添加量对γ-PGA产量的影响结果见图6。
由图6可以看出，随着味精添加量的增加，发酵液中γ-PGA产量逐渐增大，当味精添加量为2%时，发酵液中γ-PGA产量最高。再增加味精添加量，γ-PGA产量逐渐降低。这是由于发酵反应初期，菌体的浓度比较大，随着味精添加量的加大，菌体与味精接触比较充分，发酵反应比较充分，随着反应的进行，菌体逐渐消耗，浓度降低，即使增大味精添加量，发酵反应程度也会降低。综合分析，选择味精添加量为2%比较合适。
图6 味精添加量对γ-聚谷氨酸产量的影响
Fig.6 Effect of monosodium glutamate addition on γ-polyglutamic acid yield
2.2.4 初始pH值的确定
装液量为70 mL/250 mL，接种量2%，37 ℃、140r/min振荡培养24 h。不同初始pH值对γ-PGA产量的影响结果见图7。
图7 初始pH值对γ-聚谷氨酸产量的影响
Fig.7 Effect of initial pH on γ-polyglutamic acid yield
由图7可以看出，随着初始pH值的增大，发酵液中的γ-PGA产量逐渐增大，当初始pH值为7.5时，发酵液中γ-PGA产量最大。再增大初始pH值，γ-PGA产量显著降低。这是因为发酵过程中，初始pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，影响培养基中营养物质的离子化程度和微生物对营养物质的吸收，过酸性或过碱性环境都不利于菌种的发酵生长，初始pH值为7.5时比较有利于发酵反应的进行。综合分析，选择初始pH值为7.5比较合适。
2.3 发酵培养基配方优化正交试验结果
在单因素试验的基础上，选取葡萄糖添加量、蛋白胨添加量和味精添加量3个因素，设计正交试验，优化发酵培养基条件。正交试验结果见表2、方差分析结果见表3。
由表2和表3可以看出，最佳培养基配方为A3B2C2，即葡萄糖添加量2.5%，蛋白胨添加量2.5%，味精添加量2%。葡萄糖添加量、蛋白胨添加量和味精添加量对γ-PGA产量的影响因素大小为：A＞C＞B，即葡萄糖添加量＞味精添加量＞蛋白胨添加量，葡萄糖添加量具有显著性的影响（P＜0.05），蛋白胨添加量和味精添加量均无显著性的影响（P＞0.05）。
表2 发酵培养基配方优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation medium formula optimization
表3 方差分析结果
Table 3 Results of variance analysis
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
综上所述，根据单因素试验及正交试验优化，发酵培养基最佳配方为：葡萄糖2.5%，蛋白胨2.5%，味精2%，pH 7.5。
2.4 发酵培养条件优化单因素试验
2.4.1 装液量的确定
图9 装液量对γ-聚谷氨酸产量的影响
Fig.9 Effect of loading volume on γ-polyglutamic acid yield
不同装液量对γ-PGA产量的影响如图8。由图8可以看出，随着装液量的增加，γ-PGA产量逐渐增大，当装液量达到70 mL/250 mL时，γ-PGA产量最高。再增大装液量，γ-PGA产量有较大幅度降低。综合分析，选择装液量为70mL/250mL比较合适。
2.4.2 接种量的确定
不同接种量对γ-PGA产量的影响如图9。由图9可以看出，随着接种量的增加，发酵液中的γ-PGA产量逐渐增大，当接种量为2%时，发酵液γ-PGA产量最大。再增加接种量，γ-PGA产量缓慢降低。这是因为发酵反应初期，菌体的浓度比较大，随着接种量的加大，菌体与种子接触比较充分，发酵反应比较充分，随着反应的进行，菌体逐渐消耗，浓度降低，即使增大接种量，发酵反应程度也会降低。综合分析，选择接种量为2%比较合适。
图9 接种量对γ-聚谷氨酸产量的影响
Fig.9 Effect of inoculum on γ-polyglutamic acid production
2.4.3 发酵温度的确定
不同温度对γ-PGA产量的影响如图10。由图10可以看出，随着培养温度的升高，发酵液中的γ-PGA产量逐渐增大，当培养温度达到37 ℃时，γ-PGA产量最大。再升高培养温度，γ-PGA产量显著降低。这是因为发酵反应初期，菌体的浓度比较大，升高温度可以加快发酵反应速度，随着反应的进行，菌体逐渐消耗，浓度降低，发酵反应程度也会降低。综合分析，选择培养温度为37 ℃比较合适。
图10 发酵温度对γ-聚谷氨酸产量的影响
Fig.10 Effect of fermentation temperature on γ-polyglutamic acid yield
2.4.4 转速的确定
不同转速对γ-PGA产量的影响如图11。由图11可以看出，随着转速的加大，发酵液中的γ-PGA产量逐渐增大，当转速达到140 r/min时，γ-PGA产量最大。再加大转速，γ-PGA产量开始降低。这是因为发酵反应初期，菌体的浓度比较大，加大转速可以加快发酵反应速度，随着反应的进行，菌体逐渐消耗，浓度降低，发酵反应程度也会降低。综合分析，选择转速为140 r/min比较合适。综上所述，最佳发酵培养条件：装液量70 mL/250 mL，接种量2%，培养温度37 ℃，转速140 r/min，振荡培养24 h，在此条件下进行验证试验，γ-PGA产量为11.48 g/L，产量提高了57.2%。
图11 转速对γ-聚谷氨酸产量的影响
Fig.11 Effect of shaking speed on γ-polyglutamic acid yield
2.5 发酵动态曲线
在优化的最佳培养基和最佳发酵培养条件下进行摇瓶发酵30 h，每隔3 h从摇床上取下一瓶，测定波长660 nm处的OD660nm值，绘制Bacillus natto TK-2的发酵动态曲线如图12，γ-PGA的产量动态曲线如图13。
图12 Bacillus natto TK-2的发酵动态曲线
Fig.12 Fermentation dynamic curve of Bacillus natto TK-2
由图12、图13可以看出，菌体在最佳发酵条件下能够快速的生长，经过3 h很快进入对数生长期，在21 h菌体进入平稳期。γ-聚谷氨酸的生成基本上与菌体的生长同步，从0～12 h生产γ-聚谷氨酸是缓慢的，在12～24 h能够较快速度地生成γ-PGA。之后随着发酵培养基营养物质的消耗，γ-PGA的产量趋于稳定并且有下降的趋势。
图13 γ-PGA的产量动态曲线
Fig.13 Dynamic curve of γ-PGA yield
2.6 HPLC分析
谷氨酸标准溶液和γ-PGA水解溶液的高效液相色谱图如图14所示。
图14 谷氨酸标准溶液（A）以及γ-聚谷氨酸水解溶液（B）的高效液相色谱图
Fig.14 HPLC chromatogram of glutamate acid standard (A) and γ-polyglutamic acid hydrolytic solution (B)
由图14可以看出，γ-PGA水解产物只有一种氨基酸，并且与谷氨酸标准溶液的出峰时间基本相同，初步证明了γ-PGA为谷氨酸的一种聚合物，水解样与标准样比对基本一致。
3 结论
通过单因素试验及正交试验优化确定Bacillus natto TK-2发酵产γ-PGA的最佳培养基配方：葡萄糖2.5%，蛋白胨2.5%，味精2%，pH7.5；最佳发酵培养条件：装液量70mL/250mL，接种量2%，培养温度37 ℃，转速140 r/min；在此条件下进行验证试验，γ-PGA产量为11.48 g/L，产量提高了57.2%。
采用HPLC测定分析，γ-PGA是谷氨酸的一种聚合物，其水解产物只有一种氨基酸，并且与谷氨酸标准溶液的出峰时间基本相同。本研究成果为γ-PGA的综合开发利用提供理论支撑依据。
[1]高瑞萍，刘辉，刘嘉，等.纳豆的研究进展[J].食品与发酵科技，2011，47（1）：23-26.
[2]孙婕，刘宁.纳豆的保健功效[J].中国调味品，2007，31（7）：14-16，67.
[3]JOERG M B,ARGYRIOS M.Microbial biosynthesis of polyglutamic acid biopolymer and applications in the biopharmaceutical,biomedical and food industries[J].Crit Rev Biotech,2007,27(1):1-19.
[4]孙清荣.纳豆食品生产状况调研[J].食品工程，2010，38（4）：16-18.
[5]付文静，王家林，张杰.中国纳豆生产工艺的研究现状及展望[J].食品工业，2018，39（3）：230-233.
[6]齐凤元，李欢欢，杨利，等.响应面法优化花生纳豆的发酵工艺[J].中国粮油学报，2012，27（10）：87-91，97.
[7]慕琦，向凌云，赵艳岭，等.纳豆红曲胶囊活性成分及其保健功能研究进展[J].河南科学，2018，36（10）：1562-1568.
[8]ZHENG Z L,YE M Q,ZUO Z Y,et al.Probing the importance of hydrogen bonds in the active site of the subtilisin nattokinase by site-directed mutagenesis and molecular dynamics simulation[J].Biochem J,2006,395(5):509-515.
[9]王萌，许孝瑞. γ-聚谷氨酸在农业应用中的研究进展[J].黑龙江农业科学，2014，37（10）：161-163.
[10]WU S,FENG C,ZHONG J,et al.Roles of S3 site residues of nattokinase on its activity and substrate specificity[J].J Biol Chem,2007,142(3):357-364.
[11]彭英云，张涛，缪铭，等. γ-聚谷氨酸的合成、性质和应用[J].食品与发酵工业，2012，38（6）：133-138.
[12]曹名锋，金映虹，解慧，等.γ-聚谷氨酸的微生物合成相关基因及应用展望[J].微生物学通报，2011，38（3）：388-395.
[13]吴高峰，黄占旺，刘宛玲，等.纳豆菌制剂及纳豆冻干粉成分比较分析[J].食品工业科技，2015，36（22）：121-124.
[14]孙廷丽，施庆珊，欧阳友生，等.聚谷氨酸在医药领域的应用[J].生物技术进展，2012，02（1）：34-38.
[15]张文，张树清，王学江. γ-聚谷氨酸的微生物合成及其在农业生产中的应用[J].中国农学通报，2014，30（6）：40-45.
[16]徐虹，欧阳平凯.生物高分子：微生物合成的原理与实践[M].北京：化学工业出版社，2010：20-58.
[17]张艳丽，高华，于兹东，等.纳豆菌的分离及其发酵条件的优化[J].化学与生物工程，2008，25（10）：68-72.
[18]李珣，周存宇，田春元，等.枯草芽孢杆菌中多聚-γ-谷氨酸的生物合成及其调控机制[J].应用与环境生物学报，2013，19（4）：575-580.
[19]张文，张树清，马晓彤，等.纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）发酵生产γ-聚谷氨酸过程中培养基组分的优化[J].中国生物工程杂志，2013，33（11）：44-50.
[20]朱丹，邹水洋，康建雄，等.纳豆芽孢杆菌液态发酵生产γ-聚谷氨酸[J].食品工业，2012，33（17）：151-154.