乳清是生产干酪和干酪素的副产物，含有乳中近一半的营养成分，其中干物质约含6%～8%，粗蛋白质1%，粗脂肪0.3%～0.4%，总糖3%～5%（乳糖占99.8%）[1]。目前乳清处理方式不能有效促进乳清再利用产业的发展[2-3]。因此，利用乳清或其干燥产物生产乳清干酪[4]、浓缩乳清蛋白[5]、乳清蛋白酶解产物[6-8]、乳糖和乳清饮料等高附加值的产品是未来的主要发展方向[9]。
黑枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）为茄科枸杞属多棘刺灌木，在我国主要分布于青海、宁夏、新疆、甘肃、西藏等省区[10]，以其花青素含量丰富而著名[11]。黑枸杞除花青素外还含有脂肪、蛋白质、糖类、氨基酸、有机酸、微量元素以及维生素等多种营养成分[12]，具有抗氧化、抗疲劳、降压、抗心血管疾病等功能，具备广阔的应用前景，是近年来食品研究与开发的热点[13-16]。
目前对黑枸杞的研究主要集中于黑枸杞营养成分等，也有对黑枸杞与葡萄、灵芝、红枣、苦荞和仙人掌等结合生产复合饮料的研究[17-21]。而以黑枸杞为原料的乳清酒未有报道，本研究以乳清粉和黑枸杞为原料制备乳清酒，通过单因素试验和正交试验对乳清酒发酵原料的配比及工艺进行优化，并利用顶空固相微萃取-气质联用（head space solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）法鉴定黑枸杞乳清酒挥发性风味成分，以期为黑枸杞乳清酒中香味物质的认识和乳清高附加值产品的开发提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑枸杞：银川杞里乡商贸有限公司；乳清粉：新西兰恒天然集团有限公司；啤酒酵母：安琪酵母股份有限公司；乳糖酶（10万U/g）：山东圣斯德食品添加剂有限公司。
1.2 仪器与设备
PB-10精密电子pH计：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HWS-12电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；SPME装置：上海安谱实验科技股份有限公司；Trace1300-ISQ型GC-MS联用仪、U3000高效液相色谱仪：美国赛默飞世尔科技公司。
1.3 方法
1.3.1 黑枸杞乳清酒生产工艺流程及操作要点
原料选择：选择无霉变、无病虫害的黑枸杞干。
黑枸杞汁制备：将黑枸杞进行研磨，按照1∶5（g∶mL）加入水，搅拌均匀，静置30 min，取上清。
乳清液制备：乳清粉按照1∶10（g∶mL）加水溶解，制得10%的乳清溶液，加入0.7%的乳糖酶，搅拌均匀后35 ℃酶解3 h。
杀菌：65 ℃水浴30 min。
成分调整：按200 g/L加入蔗糖。
菌株活化：啤酒活性干酵母按料水比为1∶10（g∶mL）配制，加入2%蔗糖，置于35 ℃水浴锅中活化30 min至大量起泡即酵母活化完成。
接种：在超净工作台中完成，以防止污染。
发酵：发酵瓶用带有单向阀的瓶盖密封，置于28 ℃恒温培养箱中。
过滤：用砂芯漏斗过滤不溶性固形物。
1.3.2 黑枸杞乳清酒发酵工艺优化单因素试验
固定初始原料体积比（黑枸杞汁∶乳清汁）1∶4，接种量1%，发酵温度28 ℃，发酵时间120 h。分别改变原料体积比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6）、接种量（0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%）、发酵时间（96 h、108 h、120 h、132 h、144 h），对黑枸杞乳清酒粗品进行感官评定以确定原料体积比、接种量和发酵时间的最佳水平。
1.3.3 黑枸杞乳清酒发酵工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，设计3因素3水平正交试验，考察原料体积比（A）、接种量（B）和发酵时间（C）对黑枸杞乳清酒感官品质的影响，正交试验因素与水平见表1。
表1 黑枸杞乳清酒发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of black medlar whey wine
1.3.4 测定方法
感官评价：根据国家标准GB/T 16861—1997《感官分析通过多元分析方法鉴定和选择用于建立感官剖面的描述词》，选择描述词，根据GB/T 10220—2012《感官分析方法学总论》建立感官评分标准，满分100分，见表2。选定20人（男、女各10人），根据表2标准主要围绕色泽、香气、口感和组织状态对黑枸杞乳清酒进行感官评定。
表2 黑枸杞乳清酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standard of black medlar whey wine
黑枸杞乳清酒中挥发性风味物质分析：利用HS-SPMEGC-MS法[22]，量取8.0 mL黑枸杞乳清酒放入20 mL SPME样品瓶中，将老化后的萃取头插入样品瓶顶空部分进行萃取，在60 ℃水浴条件下平衡10 min，萃取头顶空吸附30 min后，在GC进样口释放1 min。
气相色谱-质谱条件：DB-5毛细色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为氦气（He）；载气流速1.0 mL/min；离子源温度230 ℃；进样口温度250 ℃；升温程序：初始温度50 ℃保持1 min，以2 ℃/min升温至100 ℃保持3 min，再以4 ℃/min升温至220 ℃保持10 min，不分流进样；质量扫描范围50～550 m/z；溶剂延迟时间1 min。
1.3.5 统计分析
单因素和正交试验中每个水平做3次平行试验。利用SPSS软件对数据进行方差分析（采用一般线性模型单因素Duncan法）。
2 结果与分析
2.1 黑枸杞乳清酒发酵条件优化单因素试验
2.1.1 黑枸杞汁与乳清汁体积比的确定
由图1可知，黑枸杞乳清酒感官评分随黑枸杞汁与乳清汁体积比的减少呈现先升高后下降趋势。在黑枸杞汁与乳清汁的体积比为1∶3时，感官评分达到最大值89.1分，此时酒体色泽鲜明，口感纯正，故黑枸杞汁与乳清汁最佳体积比确定为1∶3。
图1 黑枸杞汁与乳清汁比例对感官评分的影响
Fig.1 Effect of the ratio of black medlar to whey on sensory evaluation
字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
2.1.2 接种量的确定
图2 接种量对感官评分的影响
Fig.2 Effect of inoculum on sensory evaluation
由图2可知，在原料比例固定情况下，黑枸杞乳清酒感官评分随接种量的增加整体呈现先升高后下降的趋势。在接种量为1.0%时感官评分达到最大值84.1分，此时黑枸杞乳清酒香味协调，口感平衡，故最佳接种量确定为1.0%。
2.1.3 发酵时间的确定
图3 发酵时间对感官评分的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on sensory evaluation
由图3可知，在其他条件不变情况下，发酵时间对黑枸杞乳清酒感官评分的影响类似于接种量对其的影响。在发酵120 h时感官评分达到最大值89.9分，此时黑枸杞乳清酒光泽协调，酒体醇厚。随发酵时间延长，发酵液糖度下降和酒精度升高使黑枸杞乳清酒口感缺少柔和性，故最佳发酵时间确定为120 h。
2.2 黑枸杞乳清酒发酵条件优正交试验
在单因素试验的基础上，以黑枸杞汁与乳清液的比例、酵母接种量和发酵时间为评价因素，以感官评分为评价指标，进行正交试验，结果与分析见表3。
表3 黑枸杞乳清酒发酵条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of black medlar whey wine
由表3可知，影响黑枸杞乳清酒感官评价的因素主次顺序为黑枸杞汁与乳清液体积比（A）＞发酵时间（C）＞接种量（B），最优工艺组合为A2B3C1，即黑枸杞汁∶乳清液为1∶3、接种量1.1%、发酵时间115 h，在此条件下所得黑枸杞乳清酒的感官评分为90.2分。
2.3 黑枸杞乳清酒的挥发性风味物质分析
采用HS-SPME结合GC-MS萃取分离鉴定黑枸杞乳清酒中的挥发性成分，通过美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）数据库检索，黑枸杞乳清酒的挥发性风味物质组成见表4。
由表4可知，在检测到的挥发性风味物质中，酯类化合物所占的比例最大，占全部挥发性风味物质的72.42%，共有41种，其中癸酸乙酯含量最高，占总挥发性物质的28.57%，其次是辛酸乙酯，占20.87%。癸酸乙酯具有有椰子香味[23]，辛酸乙酯具有梨子香味[24]。酯类物质是酒体中最活跃的成分，整体提供了怡人的果香香气，可使黑枸杞乳清酒变得清甜醇香[25]。
表4 黑枸杞乳清酒挥发性成分的GC-MS联用分析结果
Table 4 Analysis of volatile substances in black medlar whey wine by GC-MS
续表
醇类物质所占比例仅次于酯类物质，占检出总量的24.76%。共有10种，其中异戊醇和2-甲基丁醇含量较高，分别为9.29%和6.72%。异戊醇有苹果白兰地香气和辛辣味[26-27]，2-甲基丁醇是一种香味成分，这两种物质在形成黑枸杞乳清酒整体风味中具有重要作用。
酸类物质检测到4种，分别为己酸、辛酸、顺式-13-十八酸和E-9-十四烯酸，只占风味物质检出总量的0.39%。适量的酸可对黑枸杞乳清酒起缓冲作用，协调、烘托黑枸杞乳清酒的主体香。酚类物质检测到2种，其中4-乙烯基-2-甲氧基苯酚具有香辛料、丁香和发酵样香气，兼具有炒花生香气。另外，还检测到1种醛类物质、1种酮类物质和9种烃类及其衍生物，这些物质共同构成了黑枸杞乳清酒独特的风味。
3 结论
采用单因素及正交试验对以乳清粉和黑枸杞为原料的黑枸杞乳清酒发酵工艺进行优化，结果表明，黑枸杞乳清酒最佳发酵工艺为黑枸杞汁与乳清液体积比1∶3、接种量1.1%、发酵时间115 h、发酵温度28 ℃。在此工艺条件下，得到的黑枸杞乳清酒呈透亮紫色、口感纯正、风味良好，感官评分为90.2分。
利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术分析黑枸杞乳清酒挥发性风味成分，共鉴定出68种挥发性风味物质，其中包括酯类41种（含量72.42%），醇类10种（含量24.76%），酸类4种（含量0.39%），醛类1种（含量0.14%），酚类2种（含量0.53%），酮类1种（含量0.04%），烃类及其衍生物9种（含量1.70%）。黑枸杞乳清酒中主要风味物质为酯类、醇类和酸类。主要风味化合物为癸酸乙酯（28.57%）和辛酸乙酯（20.87%）等。
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