冰葡萄酒俗称冰酒，指在气温低于-7 ℃条件下，葡萄经过自然冷冻、采摘、压榨、浓缩后酿造的葡萄酒[1-2]。其酒色如金，具有花香、柑橘和蜂蜜等类香气，口感圆润，久有余香[3-4]，但在冰酒的生产过程中存在挥发酸（volatile acid，VA）含量高的问题，国际和加拿大的法律规范允许冰酒中最高VA含量为1.3 g/L[1]，我国国标GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》要求冰酒中VA含量≤2.1 g/L。乙酸是葡萄酒中挥发酸的主要组成成分[5]，对葡萄酒风味具有不良影响。多数冰酒的挥发酸超标，影响冰酒的香气，破坏冰酒的质量。
冰葡萄汁经冷冻浓缩后含糖量和含酸量高，致使在冰酒的酿造过程中，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞失水收缩，生长和糖代谢速率变缓。甘油可防止水流出，对酵母具有保护作用，所以在高渗透压环境下，酵母激活高渗甘油（high osmolarity glycerol，HOG）途径，高产甘油[6]。而酵母为维持体内的氧化还原平衡，会合成更多的挥发酸[7]，降低冰酒的香气，对酒的质量存在负面影响[8]。有研究表明，菌株、发酵温度[9]及培养基[10]等因素都会影响挥发酸的产量，但酵母菌种对冰酒挥发酸含量的影响最大[11]。因此，选育低产挥发酸的酿酒酵母具有重要应用推广价值。CORDENTE A G等[12]获得一株低产乙酸的YAP1突变菌株；何娟等[13]对冰酒中分离的酵母菌进行基因分型，为筛选本土优良冰酒酵母打下基础。但在冰酒中应用的酿酒酵母的选育研究尚鲜有报道。因此，选育低产挥发酸的酿酒酵母对冰酒的酿造具有重要意义。
常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变技术具有突变率高、突变遗传较稳定、操作简便等优点[14]，广泛应用于微生物育种[15-16]。因此，本研究以发酵性能优良却高产挥发酸的酿酒酵母NX4为原始菌株，采用ARTP诱变技术选育低产挥发酸酿酒酵母，并对其遗传稳定性及耐受性进行分析。同时，应用该突变菌株酿造冰葡萄酒，对其理化指标、感官品质及挥发性风味物质进行分析，以期获得具有推广价值的优良酿酒酵母菌株。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
酿酒酵母NX4：从宁夏广夏三基地赤霞珠自然发酵过程中分离，保存于西北农林科技大学葡萄酒学院；商业菌株F15：法国LAFFORT公司。
1.1.2 试剂
葡萄糖、果糖、2-脱氧葡萄糖（2-deoxyglucose，2-DG）、2,4-二硝基苯酚（2,4-dinitrophenol，2,4-DNP）、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，3,5-DNS）、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC）（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；K-GCROLGK甘油检测试剂盒：爱尔兰Megazyme公司。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基：酵母浸粉1%，葡萄糖2%，蛋白胨2%，121 ℃灭菌20 min。固体培养基加琼脂2%。
2-DG培养基[17]：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖8%，2-DG 0.015%，琼脂2%。
2,4-DNP培养基[18]：葡萄糖2%，无氨基酸酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）0.67%，2,4-DNP 0.002 2%，琼脂2%。
TTC培养基[19]下层：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%；上层：TTC 0.05%，葡萄糖0.5%，琼脂1.5%，115 ℃灭菌30 min。
冰酒模拟汁[1]：葡萄糖200 g/L，果糖200 g/L，L-苹果酸4.5 g/L，柠檬酸0.3 g/L，酒石酸4.5 g/L，硫酸铵2 g/L，YNB（不含硫酸铵）1.7 g/L，Tween 80 1 mL/L，油酸5 mg/L，pH值3.2，0.22 μm滤膜过滤除菌。
威代尔冰葡萄汁：总糖含量350.2 g/L，总酸（以酒石酸计）含量15.7 g/L，pH值2.9。添加250 mg/L（NH4）2SO4补充氮源，同时加250 μL/L二氨基二环己基甲烷灭菌，静置过夜。
1.2 仪器与设备
MANDELA ARTP诱变仪：北京艾德豪克国际技术有限公司；LC-10ATVP液相色谱仪：日本岛津公司；SBA-40E生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所；QP2010Plus气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）仪：日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 常温室压等离子体诱变
将菌株NX4接种于YEPD固体培养基上，30 ℃条件下培养2 d。挑取单菌落于YEPD液体培养基中，30 ℃培养16 h。用无菌生理盐水将培养至对数期的酿酒酵母NX4制备成菌悬液（1×107 CFU/mL），分别在ARTP仪下诱变处理0、5 s、15 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s后，稀释涂布于YEPD固体培养基上，30 ℃条件下培养2 d。对平板进行菌落计数，以未处理为对照计算致死率，获得致死曲线，进而确定最佳诱变处理时间。
1.3.2 低产挥发酸突变菌株的筛选
平板初筛：诱变后的菌悬液稀释涂布于2-DG、2,4-DNP和TTC培养基平板，30 ℃条件下培养2 d，挑取2-DG、2,4-DNP培养基平板上的大菌落和TTC培养基平板上的白色菌落，保存。
冰酒模拟汁发酵复筛：将初筛获得的突变菌株接种于10 mL冰酒模拟汁中，接种量5×105 CFU/mL，于20 ℃、100 r/mim条件下培养10 d，采用高效液相离子排阻色谱法测定乙酸含量。将初筛获得的突变菌株接种于300 mL冰酒模拟汁中，20 ℃条件下发酵，当酒精度达到9%vol～14%vol时，测定发酵液的基本理化指标（挥发酸含量、残糖量、总酸含量、酒精度）。
1.3.3 遗传稳定性的测定
将最终筛选得到的突变菌株进行传代培养，取5代和10代菌体接种于冰酒模拟汁中，20 ℃条件下发酵20 d，测定挥发酸含量。
1.3.4 耐受性的测定
将最终筛选得到的突变菌株分别接种于含不同酒精度（12%vol、14%vol、16%vol、18%vol）、SO2（400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L）、葡萄糖（300 g/L、400 g/L、500 g/L）的YEPD培养基，接种量为5×106 CFU/mL，25 ℃静置培养，每隔4 h观察产气，发酵3 d后测定OD600nm值，考察突变菌株的酒精、SO2及糖耐受性。将最终筛选得到的突变菌株接种于YEPD培养基，接种量为5×106 CFU/mL，于20 ℃、14 ℃、8 ℃和4 ℃条件下恒温静置培养，每隔4 h观察产气，发酵3 d后测定OD600nm值，考察菌株的低温耐受性。
1.3.5 威代尔冰葡萄汁发酵
将复筛获得的突变菌株、原始菌株NX4及商业菌株F5分别接种于800 mL威代尔冰葡萄汁中，接种量5×105 CFU/mL，18 ℃静置发酵。当酒精度达到9%vol～14%vol时，添加SO2至终质量浓度为50 mg/L，4 ℃终止发酵，测定冰葡萄酒的基本理化指标。4 ℃陈酿6个月后测定挥发性风味物质，并对其进行感官评价。
1.3.6 测定方法
乙酸含量[20]：采用高效液相离子排阻色谱法进行测定。残糖、总酸和挥发酸含量：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行测定，总酸以酒石酸计，挥发酸以醋酸计。酒精度：采用生物传感分析仪测定。甘油：参照文献[21]的方法测定。
感官评分：选取15名经过培训的品尝员，参照GB15037—2006《葡萄酒》从外观、香气、口感、品质4方面对冰葡萄酒进行感官评分，满分100分。
挥发性物质：采用搅拌棒萃取法提取发酵液中的香气物质，采用GC-MS方法测定，具体方法参照文献[22]。
2 结果与分析
2.1 常温室压等离子体诱变时间的确定
酿酒酵母NX4经ARTP诱变处理后的致死曲线见图1。由图1可知，当诱变时间为65 s时，致死率为92.73%，在85%～95%之间，因此，确定最佳诱变处理时间为65 s。
图1 常温室压等离子体诱变后酿酒酵母NX4的致死率曲线
Fig.1 Lethal rate curve of Saccharomyces cerevisiae NX4 induced by atmospheric and room temperature plasma
2.2 低产挥发酸酿酒酵母的筛选
诱变后的酿酒酵母NX4在2-DG培养基、2,4-DNP培养基和TTC培养基的生长情况见图2，挑选2-DG培养基、2,4-DNP培养基平板上的大菌落和TTC平板上的白色菌落共260株保存。
图2 常温室压等离子体诱变后酿酒酵母NX4在2-DG（a）、2,4-DNP（b）和TTC平板（c）上的菌落形态
Fig.2 Colony morphology of Saccharomyces cerevisiae NX4 induced by atmospheric and room temperature plasma on 2-DG (a),2,4-DNP (b) and TTC plate (c)
初筛得到的突变菌株经10 mL冰酒模拟汁发酵后，从中筛选出9株低产乙酸的突变菌株，分别为菌株T2-5、T2-20、T2-30、T2-42、T3-38、T3-47、2DG136、DNP2-72 和T3-10，其乙酸产量见表1。由表1可知，突变菌株的乙酸产量为2.20～2.45 g/L，较原始菌株NX4（2.90 g/L）降低15.52%～25.5%。
9株筛选菌株经过300 mL冰酒模拟汁发酵后，测定发酵液的基本理化指标，结果见表2。由表2可知，突变菌株T2-5的挥发酸产量最低，为2.40 g/L，较原始菌株NX4降低23.1%。与原始菌株NX4相比，其总酸含量降低9.4%，酒精度和残糖量无显著差异（P＜0.05）。因此，选择突变菌株T2-5为目标菌株进行进一步研究。
表1 低产乙酸突变菌株的筛选结果
Table 1 Screening results of low-yield acetic acid mutant strains
表2 冰酒模拟汁发酵样的基本理化指标
Table 2 Basic physical and chemical indexes of ice wine simulation juice fermentation samples
注：不同小写字母表示原始菌株NX4差异显著（P＜0.05）。下同。
2.3 突变体菌株T2-5的遗传稳定性
突变菌株T2-5经连续传代培养后，选取传代5次和10次的菌株发酵冰酒模拟汁，测定挥发酸含量，结果见图3。
图3 突变菌株T2-5的遗传稳定性
Fig.3 Genetic stability of mutant strain T2-5
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
由图3可知，突变菌株T2-5传代5次和10次后挥发酸产量无显著差异（P＞0.05）。结果表明，突变菌株T2-5具有良好的遗传稳定性。
2.4 突变体菌株T2-5的耐受性
突变菌株T2-5的酒精、SO2、糖和温度耐受性测定结果见表3及图4。由表3及图4可知，原始菌株NX4的酒精耐受性显著高于突变菌株T2-5（P＜0.05），SO2耐受性无明显差异（P＞0.05）。突变菌株T2-5在糖含量为300 g/L时，菌体量显著高于原始菌株NX4（P＜0.05）；而在糖含量为400 g/L和500 g/L时，菌体量较原始菌株NX4低，但产气较快，表明其具有较好的糖耐受性。突变菌株T2-5在低温耐受性上弱于原始菌株NX4，但差异不显著（P＞0.05）。结果表明，突变菌株T2-5具有较低的酒精耐受性，利于冰酒发酵到适宜酒精度后发酵终止，其所具有的高糖耐受性，有利于顺利启动冰酒发酵。
表3 以产气特征为评价指标突变菌株T2-5的耐受性
Table 3 Tolerance of mutant strain T2-5 using gas production characteristic as evaluation index
注：“+++”表示产气情况好，“++”表示产气情况良好，“+”表示产气少。
图4 以OD600nm值为评价指标突变菌株T2-5的酒精（A）、二氧化硫（B）、糖浓度（C）和温度（D）耐受性
Fig.4 Alcohol (A),SO2(B),sugar content (C) and temperature (D) tolerance of mutant strain T2-5 using OD600nmvalue as evaluation index
2.5 冰葡萄酒制备
2.5.1 冰葡萄酒的基本理化指标
分别采用突变菌株T2-5、原始菌株NX4及商业菌株F15发酵威代尔冰葡萄汁制备冰葡萄酒，测定冰葡萄酒的基本理化指标，结果见表4。由表4可知，与原始菌株NX4相比，突变菌株T2-5发酵的冰葡萄酒的挥发酸含量降低26.4%，其他指标均无显著差异（P＞0.05）。与商业菌株F15相比，基本理化指标均无显著差异（P＞0.05）。
表4 冰葡萄酒的基本理化指标
Table 4 Basic physical and chemical indexes of ice wine
2.5.2 冰葡萄酒的感官评价
冰葡萄酒陈酿6个月后，选取15位感官品尝员对其进行感官评价，结果见表5。由表5可知，突变菌株T2-5发酵的冰葡萄酒呈浅金黄色，澄清；香气浓郁度中等，具有典型的花香、蜂蜜、蜜桃、柠檬、甜瓜等热带水果香气，淡淡的饼干味，香气持久；口感适中平衡，品质好。其感官评分最高，为77.14分，优于其他两个冰葡萄酒样。
表5 冰葡萄酒的感官评分
Table 5 Sensory evaluation score of ice wine
2.5.3 冰葡萄酒中挥发性物质的测定
冰葡萄酒中挥发性物质的测定结果见表6。由表6可知，从3种冰葡萄酒共检出29种挥发性物质，包括高级醇类、酯类、酸类、萜烯类和醛酮类等物质。
与菌株F15酿造冰葡萄酒相比，菌株T2-5酿造冰葡萄酒检出的香气种类较多。菌株T2-5酿造冰葡萄酒具有更多的乙酸己酯、棕榈酸乙酯、辛酸、壬酸、肉豆蔻酸等酸类以及萜烯类和醛酮类香气物质。
与菌株NX4酿造冰葡萄酒相比，菌株T2-5酿造冰葡萄酒的甜果类香气略高，高级醇类、酯类香气物质的含量略低，但差异不大，主要包括异戊醇、乙酸异戊酯、乙酸己酯、乙酸庚酯、己酸乙酯、庚酸乙酯等香气物质，使得菌株T2-5酿造冰葡萄酒在菠萝、香蕉、玫瑰花等香气上浓郁度略降低，这与感官品尝结果一致。在酸类香气上，菌株T2-5酿造冰葡萄酒明显低于菌株NX4酿造，主要包括辛酸、壬酸、癸酸、9-癸烯酸等香气物质。菌株T2-5酿造冰酒具有更为优雅的淡淡的奶油香气，出现酸败、粗糙不适的香气缺陷风险很小。同时菌株T2-5酿造冰酒具有更高浓度的1-辛烯-3-醇、苯乙醇、玫瑰醚、十一醛等香气物质，弥补玫瑰类、具有更浓郁的薰衣草等清甜类的花香。
表6 冰葡萄酒中挥发性风味物质的测定结果
Table 6 Determination results of volatile flavor compounds in ice wine
续表
注：标有“*”的香气化合物含量的单位为mg/L。
3 结论
酿酒酵母NX4经ARTP诱变后，利用平板初筛、冰酒模拟汁发酵复筛获得一株低产挥发酸的突变菌株T2-5，其具有良好的遗传稳定性，更高的糖耐受性和更低的酒精耐受性，利于在冰酒中应用。与原始菌株NX4相比，利用该突变菌株酿造的冰酒挥发酸含量降低26.4%，感官评分较高（77.14分），香气浓郁度有所降低，但持久性增强，具有典型的花香、蜂蜜、蜜桃、柠檬、甜瓜等果香，口感更丰富圆润，品质有所提高。其中高级醇类、酯类物质浓度略低，酸类明显降低，同时，具有更高浓度的1-辛烯-3-醇、苯乙醇、玫瑰醚、十一醛等香气物质。
[1]ERASMUS D J,CLIFF M,VUUREN H J.Impact of yeast strain on the production of acetic acid,glycerol,and the sensory attributes of ice wine[J].Am J Enol Viticult,2004,55(4):371-378.
[2]黄卫东，李景明，王秀芹.冰葡萄酒生产及其在我国的发展[J].农产品加工（学刊），2005（z2）：56-61.
[3]李志江，刘彬，戴凌燕，等.冰酒的研究现状与发展趋势[J].酿酒，2006，33（4）：48-50.
[4]CLIFF M,YUKSEL D,GIRARD B,et al.Characterization of Canadian ice wines by sensory and compositional analyses[J].Am J Enol Viticult,2002,53(1):46-53.
[5]VILELA-MOURA A,SCHULLER D,MENDES-FAIA A,et al.The impact of acetate metabolism on yeast fermentative performance and wine quality:reduction of volatile acidity of grape musts and wines[J].Appl Microbiol Biot,2011,89(2):271-280.
[6]HOHMANN S.Control of high osmolarity signalling in the yeast Saccharomyces cerevisiae[J].FEBS Lett,2009,583(24):4025-4029.
[7]MICHNICK S,ROUSTAN J L,REMIZE F,et al.Modulation of glycerol and ethanol yields during alcoholic fermentation in Saccharomyces cerevisiae strains overexpressed or disrupted for GPD1 encoding glycerol 3-phosphate dehydrogenase[J].Yeast,1997,13(9):783-793.
[8]CLIFF M A,PICKERING G J.Determination of odour detection thresholds for acetic acid and ethyl acetate in ice wine[J].J Wine Res,2006,17(1):45-52.
[9]TORIJA M J,BELTRAN G,NOVO M,et al.Effects of fermentation temperature and Saccharomyces species on the cell fatty acid composition and presence of volatile compounds in wine[J].Int J Food Microbiol,2003,85(1-2):127-136.
[10]BELTRAN G,NOVO M,GUILLAMON J M,et al.Effect of fermentation temperature and culture media on the yeast lipid composition and wine volatile compounds[J].Int J Food Microbiol,2008,121(2):169-177.
[11]裴广仁，李记明，于英，等.冰葡萄酒中高含量挥发酸的影响因素分析[J].食品与发酵工业，2014，40（3）：58-62.
[12]CORDENTE A G,CORDERO-BUESO G,PRETORIUS I S,et al.Novel wine yeast with mutations in YAP1 that produce less acetic acid during fermentation[J].FEMS Yeast Res,2013,13(1):62-73.
[13]何娟，曹培鑫，黄英子，等.贵人香冰酒大生产过程中酵母菌群结构及动态变化[J].中国酿造，2014，33（5）：30-33.
[14]祁田甜，张婵，胡济美，等.常压室温等离子体诱变技术选育高产Monacolin K 紫色红曲霉突变株[J].食品科学，2015，36（9）：66-70.
[15]李慧芝，康振，李江华，等.常压室温等离子体诱变扭脱甲基杆菌AM1高产吡咯喹啉醌[J].生物工程学报，2016，32（8）：1145-1149.
[16]张雪，张晓菲，王立言，等.常压室温等离子体生物诱变育种及其应用研究进展[J].化工学报，2014，65（7）：2676-2684.
[17]MIZUNO A,TABEI H,IWAHUTI M.Characterization of low-acetic-acidproducing yeast isolated from 2-deoxyglucose-resistant mutants and its application to high-gravitybrewing[J].J Biosci Bioeng,2006,101(1):31-37.
[18]KOSUGI S,KIYOSHI K,OBA T,et al.Isolation of a high malic and low acetic acid-producing sake yeast Saccharomyces cerevisiae strain screened from respiratory inhibitor 2,4-dinitrophenol (DNP)-resistant strains[J].J Biosci Bioeng,2014,117(1):39-44.
[19]田殿梅，张良，卢中明，等.猕猴桃白兰地专用酵母菌的选育及鉴定[J].食品与发酵工业，2012，38（9）：28-32.
[20]姚浔平，李小平，陈晓红，等.离子排阻色谱法测定啤酒和饮料中有机酸研究[J].中国卫生检验杂志，2008（5）：801-803.
[21]江璐.酿酒酵母单倍体的分离及其发酵特性研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2014.
[22]王华，张莉，丁吉星，等.山葡萄‘北冰红’起泡葡萄酒研发与评价[J].食品与发酵工业，2015，41（7）：93-98.