拐枣学名枳椇（Hovenia acerba），又因其形似“万”字又得名万寿果，其富含糖类物质和生物活性物质。其中糖类物质含量极高，总糖含量可达249.24 mg/g，还原糖含量可达167.57 mg/g[1]。现有的研究表明，拐枣中含有多种脂肪酸、氨基酸、维生素和酚类化合物，这些成分可以直接或间接影响人体代谢，与健康密切相关[2-3]。相比一般的水果，拐枣中的多酚含量更为丰富，可达2.68 mg/g[4]，有研究发现，多酚具有抗肿瘤、抗病毒、抗诱变、预防心脑血管疾病等药理作用并且还具有抗衰老、美白保湿等作用[5-6]。虽然拐枣果实营养价值极高，但因其形态特殊，所以可供直接食用的可食部分较少，并且略带涩味，拐枣在我国的种植面积不大，甚至在有些农村地区已经绝迹。目前关于拐枣研究不多，现有产品有限，主要有拐枣酒，拐枣饮料和拐枣醋，还有很多研究是关于相关成分的提取和检测[7-9]。将拐枣应用于酵素产品，有助于提高拐枣农产品的加工利用率，有望于将拐枣的有益物质更好的得以利用。酵素本意指酶，现主要指各种原料经微生物发酵后所得到的成品[10]。酵素制品可以在保留原料的有益成分的基础上增加更多的有益物质，有很多研究也证实了酵素所具有的一些功能特性，如解酒保肝、润肠通便和抗氧化等[11-14]。日本在20世纪80年代就已经将酵素产品的生成作为技术来研究并进入应用阶段，每天有超过2 000万人在服用酵素产品，食用酵素在日本一年可达1 000亿日元的消费额[15]。我国酵素行业起步较晚，目前尚少见到将拐枣全果应用于酵素制作的相关研究，并且将四川泡菜水应用于酵素发酵的研究也比较少见。四川泡菜水中微生物种类丰富，不仅含有乳酸菌而且还含有酵母菌和醋酸菌等[16]。本试验以拐枣以及多种果蔬（拐枣、橘子、苹果、梨、萝卜、卷心菜、菠菜、柠檬、土豆、藕、西红柿）作为混合原料制作酵素，将四川泡菜水用于酵素的发酵，以还原力和超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）酶活力作为检测指标，探索不同条件对拐枣果蔬酵素品质的影响[17-18]。通过单因素试验和正交试验，最终得到拐枣果蔬酵素的最佳发酵条件。具有拐枣风味的酵素产品的开发，不仅充分利用了拐枣中多酚含量高的优势，而且为提高拐枣的加工利用率提供了方向。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料与菌株
红糖、白砂糖、各种果蔬（拐枣、橘子、苹果、梨、萝卜、卷心菜、菠菜、柠檬、土豆、藕、西红柿）、高活性安琪酵母：宜宾某超市；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）：本实验室保藏；四川泡菜水：实验室自制。
1.1.2 化学试剂
没食子酸、无水碳酸钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、十二水磷酸氢二钠、盐酸、二水磷酸二氢钠（均为分析纯）：成都市科隆化工试剂厂；福林酚试剂（分析纯）：南京奥多福尼生物科技有限公司。
1.1.3 培养基
MRS液体培养基：牛肉膏6.0 g，蛋白胨6.0 g，酵母浸粉3.0 g，乙酸钠3.0 g，磷酸氢二钾1.2 g，吐温-80（聚山梨脂-80）0.6mL，葡萄糖12.0g，MnSO4·4H2O0.15g，MgSO4·7H2O0.35g，柠檬酸铵1.2 g，蒸馏水600 mL，pH 6.2±0.2。121 ℃、0.1 MPa高压灭菌20 min。
MRS固体培养基：在MRS液体培养基基础上再加琼脂15.0 g。121 ℃、0.1 MPa高压灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
GZ-250-S生化培养箱：韶关市广智科技设备有限公司；HWS-12电热恒温水浴锅：上海齐欣科学仪器有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；KQ5200V超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；TG-16台式高速离心机：四川蜀科仪器有限公司；TGL-16B离心机：上海安亭科学仪器厂；UV-1000紫外可见分光光度计：上海翱艺仪器有限公司；868Thermo pH计：热电（上海）仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 拐枣果蔬酵素工艺流程及操作要点
果蔬清洗→预处理→混合→调配→装罐密封→一次发酵→过滤→二次发酵→拐枣果蔬酵素
操作要点：
预处理：将拐枣、橘子、苹果、梨、萝卜、卷心菜、菠菜、柠檬、土豆、藕、西红柿等果蔬清洗干净，并于通风处自然晾干水分后去皮、去核并切丁，将切好的果蔬按质量比为1∶1混合得到混合果蔬。
四川泡菜水的制备：芹菜2份、小米辣1份、生姜1份、泡萝卜6份均清洗晾干备用。饮用水烧开晾至25～30 ℃，按8%的添加量加入食用盐搅拌溶解。将经预处理好的蔬菜装入泡菜坛子，然后倒入盐水，直至淹没蔬菜，并在最上面撒一层大约0.03 cm厚度的食盐。封罐：盖上泡菜坛盖以水封。定期检查水封的水量，水量低于坛沿2/3立即将水补齐至坛沿；3月后即可获得四川泡菜水。
菌株活化：酵母菌加入10倍蒸馏水于30 ℃水浴0.5 h活化酵母菌，植物乳杆菌于MRS液体培养基中37 ℃培养2 d，即可得到乳酸菌活化液。
调配：混合果蔬中加入35%混合糖（砂糖和红糖质量比为1∶1），再分别加入一定量的四川泡菜水、活化酵母菌及植物乳杆菌混匀。
装罐密封：装罐量为容积的80%，不可装太满。
一次发酵：在35 ℃条件下进行恒温发酵15 d，前7 d每天搅拌一次，每隔3 d取发酵液测定pH值，直至pH值稳定不再下降后，即视为达到发酵终点。
过滤：一次发酵完成后用双层纱布过滤。
二次发酵：将过滤后的一次发酵液密封后于常温避光处二次发酵成熟30 d，得拐枣果蔬酵素。
1.3.2 检测方法
（1）总酚含量的测定
样液预处理：取发酵液在4 000 r/min条件下离心15 min。
参考福林酚比色法测定核桃青皮果蔬酵素中的总酚含量[18]，在25 mL刻度试管中加入经稀释10倍的样液，然后加入2.5 mL10%的福林酚试剂，混匀之后静置3 min，最后加入1 mL 12%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至25 mL，置于45 ℃水浴锅中遮光显色30 min，取出后迅速冷却于696 nm波长条件下测定吸光度值。以不同质量浓度的没食子酸标准溶液代替样液测定吸光度值，以没食子酸质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程：y=0.0720 0x+0.005 6，R2=0.999 6。
（2）还原力的检测
参考毛酸浆酵素还原力的测定方法[19]，取经预处理后的发酵液0.2 mL，加入2.5 mL浓度为0.2 moL/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 6.6），然后加入质量分数为10%的铁氰化钾溶液，于50 ℃水浴20 min后快速冷却，然后加入2.5 mL 体积分数为20%的三氯乙酸溶液，于3 600 r/min离心15 min后立即取上清液2.5 mL，加入去离子水2.5 mL和0.1%三氯化铁0.5 mL。以去离子水作参比在波长700 nm处测定吸光度值（OD700nm值）。吸光度值越大，说明还原能力越强，抗氧化效果越好。
（3）SOD酶活力的检测
参考国标GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定》[20]，于25 ℃左右，取经预处理并适当稀释的样液0.2 mL于试管中，然后依次将2.35 mL浓度为0.1 moL/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液（pH为8.2，内含1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠（ethylene diamine tetraacetic acid-2Na，EDTA-2Na））、1.8 mL蒸馏水、0.15 mL 4.5 mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后立即倒入石英比色皿中在波长325 nm条件下分别测定初始时和1 min后的吸光度值，二者之差则为A1，空白比色皿用10 mmol/L盐酸调零，同样地用蒸馏水代替样液测定吸光度值A0，SOD酶活性计算公式如下：
超氧化物歧化酶活力定义：25 ℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%所需的SOD量为一个活力单位（U）。
1.3.3 原料对总酚含量和发酵时间的影响
将经预处理后的除拐枣外的所有果蔬原料（橘子、苹果、梨、萝卜、卷心菜、菠菜、柠檬、土豆、藕、西红柿）按1∶1质量比混合得到混合果蔬原料，然后按照不同拐枣添加量分组，第一组不添加拐枣，第二组拐枣与混合果蔬的质量比为1∶4，第三组拐枣与混合果蔬的质量比为1∶3。然后分别按原料∶白砂糖∶红糖=4∶1∶1（g∶g）进行调配，加入2%的泡菜水置于35 ℃条件下进行发酵，每隔3 d取发酵液测定pH值，直至pH值稳定取样测定其总酚含量。
1.3.4 糖的种类对发酵的影响
将经预处理后的的除拐枣外的所有果蔬原料（橘子、苹果、梨、萝卜、卷心菜、菠菜、柠檬、土豆、藕、西红柿按1∶1的质量比混合）混合得到混合果蔬原料，将拐枣与混合果蔬原料按1∶4的质量比混合，等量分为3个样品组，分别添加白砂糖50%、红糖50%、混合糖50%，3个样品组菌接种泡菜水2%，置于35 ℃培养箱中恒温发酵，每隔3 d取发酵液测定pH值，直至pH值稳定不再下降后取发酵液经预处理后进行还原力和SOD酶活力的测定。
1.3.5 发酵工艺优化单因素试验
（1）加糖量的选择
前处理方式不变，将样品进行编号1～4号，在调配时分别加入混合糖（砂糖和红糖质量比为1∶1）20%、30%、40%、50%，每个样品均添加2%的泡菜水，然后在35 ℃条件下进行恒温发酵，每隔3 d取发酵液测定pH值，直至pH值稳定不再下降后取发酵液经预处理后进行还原力和SOD酶活力的测定。
（2）菌种的选择
前处理方式不变，调配时加入30%的混合糖（砂糖和红糖质量比为1∶1），将样品进行编号1～6号，分别加入酵母菌2%、4%，乳酸菌2%、4%，四川泡菜水2%、4%。在35 ℃条件下进行恒温发酵，每隔3 d取发酵液经预处理后进行还原力和SOD酶活力的测定。
（3）发酵温度的选择
前处理方式不变，调配时加入30%的混合糖（砂糖和红糖质量比为1∶1）与2%的泡菜水，将样品进行编号1～4号，分别在25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃条件下进行恒温发酵，每隔3 d取发酵液测定pH值，直至pH值稳定不再下降后取发酵液经预处理后进行还原力和SOD酶活力的测定。
1.3.6 发酵工艺优化正交试验
在单因素的基础上设计正交试验，考察混合糖（砂糖和红糖质量比为1∶1）添加量（A）、发酵温度（B）和四川泡菜水接种量（C）3个因素共同作用对拐枣果蔬酵素的影响，一次发酵结束后对发酵液的还原力和SOD酶活性进行测定，每个样品重复测3次，最后结果取平均值，根据测定结果最终选择出最优工艺条件，正交试验因素与水平见表1。
表1 发酵工艺优化正交因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization
2 结果与分析
2.1 原料对总酚含量和发酵时间的影响
图1 不同原料对总酚含量和发酵时间的影响
Fig.1 Effect of different raw materials on total phenol content and fermentation time
由图1可知，不同拐枣添加量对酵素总酚含量影响较大，拐枣的加入能够明显提升酵素中总酚含量，其中第一组无拐枣组的总酚含量为1.32 mg/mL，第二组拐枣与混合果蔬的质量比为1∶4时，总酚含量为2.35 mg/mL，第三组拐枣与混合果蔬的质量比为1∶3时，总酚含量上升至2.63 mg/mL，上升幅度不是很明显。同时可以看出拐枣的添加量对发酵时间有较明显的影响，拐枣的加入会延长发酵时间。所以综合两种因素考虑，最终选择拐枣与混合果蔬的最适质量比为1∶4。
2.2 糖种类选择结果
由图2可知，添加了混合糖的酵素样品的SOD酶活力和还原力明显高于单一糖种类样品，且仅添加白糖的样品组SOD酶和还原力最低分别为121.6 U/mL和1.534（OD700nm值），这说明红糖和白砂糖混合发酵效果要优于单一糖种类发酵，这可能是因为红糖相比白砂糖含更多的微量元素，较适宜微生物发酵。但是仅用红糖进行发酵，所得酵素的还原力和SOD酶活力也低于混合糖发酵，这可能是因为只添加红糖发酵酵素样品更容易受到其他杂菌的影响，最终导致酵素的品质比混合糖发酵酵素品质低。所以选择砂糖和红糖最适质量比为1∶1。
图2 糖种类对还原力和超氧化歧化酶活力的影响
Fig.2 Effect of sugar types on reducing power and superoxide dismutase activity
2.3 发酵工艺优化单因素试验
2.3.1 加糖量的选择
图3 混合糖添加量对还原力和超氧化歧化酶活力的影响
Fig.3 Effect of mixed sugar addition on reducing power and superoxide dismutase activity
由图3可知，糖的添加量对酵素的SOD酶活力和还原力均会产生影响，随着糖添加量的增大，SOD酶活力出现了先增大后降低的现象，这可能是过高的糖添加反而会抑制微生物的生长繁殖，最终导致所产酶活力下降。还原力是随着糖添加量的增大而一直增大，这可能是由于糖添加量的增多，被微生物所分解成为还原糖的量也越大，所以最终导致发酵结束时还原力很大。但是总体来说30%的混合糖添加量与50%混合糖添加量条件下还原力和SOD酶活力分别为1.345（OD700nm值）、1.502（OD700nm值）和171.2 U/mL、156.2 U/mL，其中还原力差别不是特别明显，而SOD酶活力30%糖添加量情况下更多，且较多的糖添加量还会延长发酵时间。所以选择混合糖（砂糖和红糖质量比为1∶1）的最适添加量为30%。
2.3.2 发酵温度选择结果
图4 发酵温度对还原力和超氧化歧化酶活力的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on reducing power and superoxide dismutase activity
由图4可知，随着发酵温度的升高，酵素样品的SOD酶活性和还原力均呈现出先升高后降低的趋势，其中30 ℃和35 ℃条件下发酵的酵素样品的还原力和SOD酶活性明显高于25 ℃和40 ℃条件下发酵的，这说明适宜的温度对发酵效果十分重要。25 ℃发酵温度过低，可能不适宜目的微生物生长，所以导致发酵不完全且所需发酵时间较长而40 ℃发酵温度过高，可能会抑制目的微生物生长，并且40 ℃样品的活力较25 ℃更低。35 ℃样品两者指标均最高还原力和SOD酶活力分别为1.932（OD700nm值）、205.4 U/mL。所以选择最适发酵温度为35 ℃。
2.3.3 菌种的选择结果
图5 不同菌种对还原力和超氧化歧化酶活力的影响
Fig.5 Effect of different strains reducing power and superoxide dismutase activity
由图5可知，加入不同的菌种对酵素样品的SOD酶活力和还原力有很大影响，且由图可知影响效果为：泡菜水＞乳酸菌＞酵母菌。这可能是由于四川泡菜水中微生物种类丰富，不仅有多种乳酸菌，还有醋酸菌和酵母菌等，并且本试验用的老泡菜水（制作超过3个月以上）菌落总数达105 CFU/mL以上，产酸能力强。所以选择泡菜水作为接下来正交试验的菌种。
2.4 发酵工艺优化正交试验结果
在单因素的基础上设计正交试验，以发酵液的还原力和SOD酶活性为考察指标，考察混合糖添加量（A），发酵温度（B）和四川泡菜水接种量（C）3个因素共同作用对拐枣果蔬酵素的影响，正交试验结果与分析见表2。
表2 发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization
由表2可知，影响酵素样品SOD酶活力和还原力的因素主次顺序为A＞B＞C，混合糖的添加量是影响酵素样品的SOD酶活力和还原力的最主要的因素，这可能是由于本试验的酵素样品都发酵较完全，所以糖的添加量在较大程度上决定了发酵的周期，因而影响了酵素的产物。对于SOD酶活力和还原力而言，两种指标均越大越好，所以从两种指标都可得出最优发酵工艺组合是A2B2C3，即拐枣果蔬酵素的最佳发酵工艺为混合糖添加量30%，发酵温度35 ℃，四川泡菜水接种量4%。在此最佳发酵工艺条件下，SOD酶活力及还原力（OD700nm值）分别为270 U/mL和2.165（OD700nm值）。
3 结论
本试验以拐枣和多种果蔬为原料，以四川老泡菜水为菌种母液，通过对不同原料发酵的酵素样品的总酚检测，以拐枣与混合果蔬按照1∶4质量比进行拐枣果蔬酵素的研制，最终得出拐枣果蔬酵素的最佳工艺条件为混合糖添加量30%、发酵温度35 ℃、四川泡菜水接种量为4%，发酵15 d，在此优化条件下得到的酵素超氧物歧化酶（SOD）活性为270 U/mL，还原力为2.165（OD700nm值），总酚含量为3.38 mg/mL，经过30 d熟成后颜色呈悦人的浅红棕色，发酵液清澈，酸甜适口，香气浓郁，并无不良风味。
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