Fe和Zn都是人体必需的微量元素[1]，众所周知，长期缺Fe或Zn对人体健康具有较大的危害[2]。猪肝系列产品中含有丰富的Fe和Zn，之前的研究以测定Fe和Zn总量为主，对其形态分析较少[3]。相关研究报告表明[4-7]，人体对微量元素的吸收与其形态密切相关，与无机态相比，有机态的金属元素更易被人体吸收。近年来，随着对微量元素研究的深入，已有一些形态分析研究报道，MEI T等[8]利用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术发现，金针菇水溶性蛋白中至少含有6种含硒蛋白，约占总可溶性硒的7.0%；李红卫等[9]利用4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯柱前衍生，建立高效液相色谱法测定富硒米曲霉中有机硒形态的分析方法，取得了良好的效果。
实验动物模型可以较好的模拟人体消化和吸收的过程，但其成本高、耗时、耗力。本实验以实验室研制的猪肝酱为研究对象，采用体外全仿生消化（含消化酶）技术[10-13]模拟猪肝酱在胃、肠中消化，依据化学仿生（人工胃、肠）与医学仿生（酶的作用）原理，模拟猪肝酱经胃肠环境的转运机制，研究胃、肠所含的无机物、有机物及消化酶对猪肝酱中Fe、Zn形态和生物可给性的影响。利用0.45 μm微孔滤膜分离悬浮态和可溶态，通过D101大孔树脂实现无机态和有机态的分离。微波消解后使用高分辨-连续光源原子吸收光谱（high resolution-continuum source atomic absorption spectrometry，HR-CS AAS）仪[14-18]测定各形态Fe和Zn的含量，为科学补充Fe和Zn提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪肝酱：实验室研制产品。
粘液素、牛血清白蛋白、黏蛋白、胰液素、淀粉酶、脂肪酶（均为生化试剂）：上海源叶生物科技有限公司；KCl、KSCN、NaH2PO4、Na3PO4、NaCl、NaOH、CaCl2、NH4Cl、NaHCO3、KH2PO4、MgCl2（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
ContrAA 700高分辨-连续光源原子吸收光谱仪（简称HR-CS AAS）：德国Analytik Jena公司；XT-9900型智能微波消解仪、XT-9800多用预处理加热仪：上海新拓微波溶样测试技术有限公司；CascadaTM实验室超纯水系统：美国Pall公司；3-30K台式高速冷冻离心机：德国Sigma公司；L550台式低速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。
1.3 方法
1.3.1 猪肝酱制作工艺流程[19-21]
腌制：将沥水后的猪肝和五花肉加入香料，滚揉腌制30 min。腌制配比：猪肝100 g，五花肉10 g，料酒3 g，葱1 g，姜3 g，蒜3 g，白砂糖2 g。
炒制：将20 g植物油和5 g猪油加入锅中，加热后加入蒜末和姜末，出味后依次加入五香粉、盐、味精、淀粉、糊精等进行炒制，炒制时间为3 min。
炒制配方：猪肝100 g，五花肉10 g，蒜3.75 g，姜3.75 g，五香粉1 g，盐3.75 g，味精0.5 g，淀粉3.5 g，糊精7 g，亚硝酸钠1.2 g，复合磷酸盐1 g。
脱气：将斩拌好的样品真空滚揉10 min。
杀菌：将灌装好的猪肝酱121 ℃杀菌60 min。
1.3.2 仪器工作参数
HR-CS AAS（火焰法）测定Fe和Zn的工作参数见表1。同时进行乙炔流量和燃烧器高度的优化。
表1 HR-CS AAS工作参数
Table 1 Working parameters of HR-CS FAAS
1.3.3 样品前处理及其Fe和Zn的测定
参考文献[1]，采用微波消解处理猪肝酱及其胃、肠消化后的样品，根据Fe和Zn的实际浓度，进行适当稀释，最后再使用HR-CS AAS按表1的工作参数测定Fe和Zn。
1.3.4 消化液的制备
参考文献[22]，分别加入唾液、胃液、十二指肠液和胆汁中所含的有机物和无机物，利用HCl和NaHCO3调节pH值，再用超纯水定容至500 mL，置于4 ℃冷藏保存备用，使用前在此基础上分别加入相应的消化酶。
1.3.5 模拟猪肝酱在胃中消化
在50.0 g猪肝酱中添加5.00 mL唾液，混匀后在37 ℃、60 r/min条件下恒温振荡5 min后；再添加75.0 mL胃液，混匀后在37 ℃、60 r/min条件下恒温振荡2 h[22]；结束后将样品转移至适当离心管中，通过离心实现固液分离，称量上清液（猪肝酱胃全仿生消化液）质量。
1.3.6 模拟猪肝酱在肠中消化
在50.0 g猪肝酱中添加5.00 mL唾液，混匀后在37 ℃、60 r/min条件下恒温振荡5 min后；添加75.0 mL胃液，混匀后在37 ℃、60 r/min条件下恒温振荡2 h；再添加100.0 mL十二指肠液和40.0 mL胆汁，混匀后在37 ℃、60 r/min条件下恒温振荡7 h；结束后将样品转移至适当离心管中，通过离心实现固液分离，称量上清液（猪肝酱肠全仿生消化液）质量。
1.3.7 悬浮态与可溶态的分离和测定
将一定质量的猪肝酱胃全仿生消化液转移至适当离心管中，通过高速离心实现固液分离，再将上清液通过0.45 μm滤膜，悬浮态将被滤膜截留下来，通过的为可溶态[1]，并称其质量。再按1.3.3方法对可溶态样品进行处理和测定。按同样的方法处理猪肝酱肠全仿生消化液。
悬浮态Fe（或Zn）=Fe（或Zn）总量-可溶态Fe（或Zn）
1.3.8 无机态与有机态的分离和测定
参考文献[22]，处理D101大孔吸附树脂，将一定质量的可溶态溶液通过树脂，用体积分数1%的HNO3按一定流速洗涤树脂，再按1.3.3方法对洗脱液样品进行处理和测定，洗脱液样品中Fe和Zn为无机态。
有机态Fe（或Zn）=可溶态Fe（或Zn）-无机态Fe（或Zn）
1.3.9 Fe（或Zn）生物可给性的计算
模拟猪肝酱在胃、肠中消化，Fe（或Zn）生物可给性的计算公式如下：
式中：BA为Fe（或Zn）的生物可给性，%；TK为胃、肠消化液中可溶态Fe（或Zn）含量，μg/g；TZ为猪肝酱中Fe（或Zn）总量，μg/g。
2 结果与分析
2.1 测定参数的优化
使用HR-CS AAS测定Fe和Zn时，利用仪器自带优化功能对不同测定参数进行优化，优化结果见表2。
由表2可知，HR-CS AAS测定Fe的最佳参数为乙炔流量80 L/h，燃烧器高度5 mm；测定Zn的最佳参数为乙炔流量90 L/h，燃烧器高度6 mm。
表2 测定参数的优化
Table 2 Optimization of determination parameters
2.2 标准工作曲线的绘制
使用HR-CS AAS测定不同浓度的Fe标准溶液，吸光度值以A表示，Fe标准溶液浓度以c表示，经仪器自带软件绘制，得Fe回归方程为A1=（-0.001 375 2+0.025 587 4×c1）/（1+0.019 396 3×c1），相关系数R2为0.999 5；同理，得Zn回归方程为A2=（-0.018 503+0.131 201 5×c2）/（1+0.128 793 8×c2），相关系数R2为0.999 1；Fe和Zn标准工作曲线的相关系数R2均≥0.999，这表明浓度与吸光度值有良好的关系。
2.3 加标回收率
将一定量Fe、Zn标准溶液和猪肝酱样品一起置于微波消解罐中进行微波消解，按1.3.3方法进行处理和测定，重复6次，计算加标回收率[23]，结果见表3。
由表3可知，Fe平均加标回收率为103.7%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）=1.28%；Zn平均加标回收率为96.8%，RSD=1.58%。这表明按1.3.3方法进行处理和测定，结果准确可靠。
表3 加标回收率测定结果
Table 3 Results of adding standard recoveries
2.4 消化液中Fe的形态分析
胃、肠消化后猪肝酱中Fe的形态分析，结果见表4。
由表4可知，猪肝酱含有丰富的Fe，达（112.56±3.13）μg/g；消化前猪肝酱中可溶态Fe为（9.21±0.40）μg/g，占总量的8.18%，其中有机态Fe占总量的1.75%，Fe的生物可给性为8.18%；猪肝酱在模拟胃中消化后可溶态Fe为（21.24±0.52）μg/g，占总量的18.87%，其中有机态Fe占总量的8.02%，Fe的生物可给性为18.87%；猪肝酱在模拟肠中消化后可溶态Fe为（29.22±0.76）μg/g，占总量的25.96%，其中有机态Fe占总量的13.42%，Fe的生物可给性为25.96%。
表4 消化液中Fe的形态分析
Table 4 Speciation analysis of Fe in digestive juice
相比消化前，胃消化后除悬浮态Fe，其他各形态Fe的含量都所有增加，生物可给性变大；相比胃消化，肠消化后除悬浮态Fe，其他各形态Fe的含量都所有增加，生物可给性变大；这表明胃、肠消化都是将一部分悬浮态Fe消化成可溶态Fe，其中以有机态Fe为主，有利于人体吸收。
2.5 消化液中Zn的形态分析
胃、肠消化后猪肝酱中Zn的形态分析，结果见表5。
由表5可知，猪肝酱含有丰富的Zn，达（41.38±1.14）μg/g；消化前猪肝酱中可溶态Zn为（8.13±0.36）μg/g，占总量的19.65%，其中有机态Zn占总量的1.81%，Zn的生物可给性为19.65%；猪肝酱在模拟胃中消化后可溶态Zn为（12.48±0.32）μg/g，占总量的30.16%，其中有机态Zn占总量的7.85%，Zn的生物可给性为30.16%；猪肝酱在模拟肠中消化后可溶态Zn为（18.48±0.49）μg/g，占总量的44.66%，其中有机态Zn占总量的16.09%，Zn的生物可给性为44.66%。
相比消化前，胃消化后除悬浮态Zn，其他各形态Zn的含量都所有增加，生物可给性变大；相比胃消化，肠消化后除悬浮态Zn，其他各形态Zn的含量都所有增加，生物可给性变大；这表明胃、肠消化都是将一部分悬浮态Zn消化成可溶态Zn，其中以有机态Zn为主，有利于人体吸收。
表5 消化液中Zn的形态分析
Table 5 Speciation analysis of Zn in digestive juice
3 结论
通过单因素试验，确定Fe最佳测定条件：乙炔流量为80 L/h，燃烧器高度为5 mm；Zn最佳测定条件：乙炔流量为90 L/h，燃烧器高度为6 mm。在此条件下，测定猪肝酱中Fe含量为112.56 μg/g，Zn含量为41.38 μg/g。胃、肠消化后除悬浮态Fe和Zn，其他各形态Fe和Zn的含量都有所增加，生物可给性变大，这表明胃、肠消化都是将一部分悬浮态Fe和Zn消化成可溶态Fe和Zn，其中以有机态Fe和Zn为主。
[1]陈安徽，陈尚龙，巫永华，等.黄精酵素口服液中钙、铁和锌的形态分析[J].现代食品科技，2016，32（1）：272-277.
[2]张滨，马美湖.金属螯合亲合层析（MCAC）分离血红素肽-铁及功能活性研究[J].中国食品学报，2010，10（2）：60-66.
[3]GÓMEZNIETO B,GISMERA M J,SEVILLA M T,et al.Determination of essential elements in beverages,herbal infusions and dietary supplements using a new straightforward sequential approach based on flame atomic absorption spectrometry[J].Food Chem,2017,219:69-75.
[4]POHL P,STELMACH E,SZYMCZYCHA-MADEJA A.Simplified sample treatment for the determination of total concentrations and chemical fractionation forms of Ca,Fe,Mg and Mn in soluble coffees[J].Food Chem,2014,163(20):31-36.
[5]MAO G H,REN Y,LI Q,et al.Anti-tumor and immunomodulatory activity of selenium(Se)-polysaccharide from Se-enriched Grifola frondosa[J].Int J Biol Macromol,2016,82:607-613.
[6]BARBOSA U A,PEÑA-VAZQUEZ E,BARCIELA-ALONSO M C,et al.Simultaneousdetermination and speciation analysisofarsenic and chromium in iron supplements used for iron-deficiency anemia treatment by HPLCICP-MS[J].Talanta,2017,170:523-529.
[7]高淑云.火焰原子吸收法测定牛蒡中元素含量[J].徐州工程学院学报（社会科学版），2007，22（6）：32-35.
[8]MEI T,LI B,SUN T,et al.HPLC-ICP-MS speciation of selenium in Se-cultivated Flammulina velutipes[J].Arab J Chem,2017,219:69-75.
[9]李红卫，王开萍，吴娱，等.柱前衍生-反相高效液相色谱法检测富硒米曲霉中有机硒形态[J].食品科学，2015，36（22）：137-141.
[10]WU P,BHATTARAI R R,DHITAL S,et al.In vitro,digestion of pectinand mango-enriched diets using a dynamic rat stomach-duodenum model[J].J Food Eng,2017,202:65-78.
[11]SUN L,LIU G,YANG M,et al.Bioaccessibility of cadmium in fresh and cooked Agaricus blazei Murill assessed by in vitro,biomimetic digestion system[J].Food Chem Toxicol,2012,50(5):1729-1733.
[12]LI S X,LIN L X,ZHENG F Y,et al.Metal bioavailability and risk assessment from edible brown alga Laminaria japonica,using biomimetic digestion and absorption system and determination by ICP-MS[J].J Agr Food Chem,2011,59(3):822-828.
[13]WAGH P,PARUNGAO G,VIOLA R E,et al.A new technique to fabricate high-performance biologically inspired membranes for water treatment[J].Sep Purif Technol,2015,156(2):754-765.
[14]PERONICO V C D,RAPOSO J L.Ultrasound-assisted extraction for the determination of Cu,Mn,Ca,and Mg in alternative oilseed crops using flame atomic absorption spectrometry[J].Food Chem,2016,196:1287-1292.
[15]OZBEK N,BAYSAL A.A new approach for the determination of sulphur in food samples by high-resolution continuum source flame atomic absorption spectrometer[J].Food Chem,2015,168:460-463.
[16]PAZ-RODRÍGUEZ B,ABOAL-SOMOZA M,BERMEJO-BARRERA P.Application of high resolution-continuum source flame atomic absorption spectrometry(HR-CS FAAS):determination of trace elements in tea and tisanes[J].Food Chem,2015,170:492-500.
[17]BAYSAL A,AKMAN S.A practical method for the determination of sulphur in coal samples by high-resolution continuum source flame atomic absorption spectrometry[J].Talanta,2011,85(5):2662-2665.
[18]宋慧，陈尚龙，李超，等.火焰原子吸收光谱法测定牛奶中不同化学形态的钙[J].食品科学，2012，33（22）：278-281.
[19]崔瑞颖，张志胜，任慧，等.猪肝酱加工工艺的优化[J].食品工业，2013，34（6）：11-13.
[20]余静，王卫，张佳敏.猪肝调味酱加工工艺优化[J].成都大学学报（自然科学版），2017，36（3）：247-251.
[21]李银塔，陈英乡，位正鹏，等.猪肝酱的加工工艺研究[J].肉类工业，2010（12）：26-28.
[22]陈尚龙，刘恩岐，陈安徽，等.应用体外全仿生模型初步分析2 种富硒产品中硒形态及生物可给性[J].食品科学，2018，39（4）：225-232.
[23]赵欣，杨庆文，韩建欣，等.微波消解-原子吸收光谱法测定山西老陈醋中微量元素[J].中国酿造，2017，36（3）：165-169.