中国白酒历史悠久，它与威士忌、伏特加、白兰地、朗姆酒、金酒并称为世界6大蒸馏酒。中国白酒以粮谷为主要原料，以大曲、小曲或麸曲及酒母等为糖化发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏而制成[1]。为了保护我国民族传统产品，国家标准GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》中规定白酒中禁止添加任何添加剂[2]。但为了掩盖白酒的苦涩，保持酒体干冽、醇厚、绵软，仍存在不良白酒生产企业在生产过程中违法添加甜味剂来改善白酒口感的现象。
甜味剂是一类能赋予食品甜味的食品添加剂，按其来源可分为天然甜味剂和人工合成甜味剂，其中人工合成甜味剂可分为磺胺类、二肽类、蔗糖衍生物等三大类[3]。食品药品监管总局2014年白酒专项监督抽查结果显示，因添加甜蜜素、糖精钠、安赛蜜等甜味剂而被判定为不合格的白酒占3.6%，而不合格产品中甜味剂的检出限均低于相关国家标准中的检出限（GB 5009.28—2016《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》[4]、GB 5009.263—2016《食品中阿斯巴甜和阿力甜的测定》[5]、GB/T 5009.140—2003《饮料中乙酰磺胺酸钾的测定》[6]）。在相关国家标准中，测定甜味剂种类单一，检出限较高，达不到国外相关标准提出“酒中甜蜜素不得检出（＜100 μg/L）”的要求[7]。目前食品中甜味剂的检测主要有高效液相色谱法[8-11]、离子色谱法[12-14]、高效液相色谱-串联质谱法[15-21]等，高效液相色谱法具有同时检测甜味剂种类多、灵敏度高等特点成为食品中甜味剂检测技术的发展趋势，本研究针对白酒样品的特性，建立一种同时测定白酒中7种人工甜味剂、9种天然甜味剂的超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（ultra high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field-orbitrap-high resolution mass spectrometry，UPLCQ-Orbitrap-HRMS）测定方法，为白酒中多种甜味剂的检测提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
9种白酒（L1～L9）：市售浓香型、清香型、酱香型等不同品牌的白酒。
安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖、阿力甜、纽甜、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C、杜克甙A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷D、甜叶悬钩子苷、甘草甜、蔗糖共计16种甜味剂标准品（纯度＞99%）：美国Sigma公司；乙腈、甲醇（均为色谱级）：德国默克公司；无水乙醇（色谱级）：美国天地公司；0.22 μm的PTFE微孔滤膜：美国Agilent公司。
1.2 仪器与设备
XP205分析天平：METTLER TOLEDO公司；IQ7003纯水仪：美国MILLIPORE公司、Accela1250型高效液相色谱、Q-Exactive四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪：美国Thermo公司；MIKRO 220R离心机：德国Hettich公司。
1.3 实验方法
1.3.1 仪器条件
色谱条件：Hypersil Gold aQ液相色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.9 μm）；进样量5 μL；流动相：甲醇-水（含5 mmol/L乙酸铵）；流速：300 μL/min；梯度洗脱：洗脱程序见表1；整个分析流程共15 min。
表1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program
质谱条件：质谱采用加热电喷雾电离源，正负离子模式同时扫描模式，源参数如下：毛细管电压为±3.2 kV，鞘气为40 arb（1 arb≈0.3 L/min），辅助气为15 arb，吹扫气为0 arb，雾化温度为220 ℃，扫描范围为150～1 200 amu，分辨率为70 000，扫描模式为一级全扫描＋自动触发二级，离子传输管温度为350 ℃。
1.3.2 标准溶液的配制
准确称取16种甜味剂标准品100.000 mg，用体积分数50%的乙醇水溶液溶解，定容至100.0 mL棕色容量瓶中，振荡均匀即得质量浓度为1 000 mg/L的混合标准储备液，于4 ℃冰箱中保存，备用。分别用水逐级稀释标准储备液，得到16种甜味剂质量浓度依次为5.0 μg/L、10.0 μg/L、25.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L、250.0 μg/L、500.0 μg/L、1 000.0 μg/L的标准工作溶液。
1.3.3 样品前处理
准确吸取1.0 mL的白酒样品，在40 ℃水浴中氮吹除醇，加水定容至1.0 mL，漩涡混匀，4 ℃、12 000 r/min条件下离心，过0.22 μm微孔滤膜后进样分析。
2 结果与分析
2.1 色谱柱的优化
分别尝试了ZORBAXXDB-C18（2.1mm×100mm，1.8μm）、ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）和Hypersil Gold aQ（2.1 mm×150 mm，1.9 μm）三种色谱柱对分离效果的影响，结果显示，甜菊苷和瑞鲍迪苷B为同分异构体，使用XDB-C18色谱柱无法实现这两种化合物的分离。故只列举SB-C18以及Hypersil Gold aQ色谱柱对化合物分离的结果，分别见图1和图2。
图1 采用SB-C18色谱柱部分化合物离子提取色谱图
Fig.1 Partial compound ion extraction chromatogram using SB-C18column
图2 采用Hypersil Gold aQ色谱柱16种甜味剂离子提取色谱图
Fig.2 Ion extraction chromatogram of 16 sweeteners using Hypersil Gold aQ column
结果表明，SB-C18色谱柱可以使16种化合物基线完全分离，但安赛蜜、纽甜、甜菊苷、瑞鲍迪苷B、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C、杜克甙A、甜叶悬钩子苷、瑞鲍迪苷D等出现峰分叉问题（图1），进一步考察了乙腈-水（含10 mmol/L乙酸铵）、乙腈-水（含5 mmol/L乙酸铵）、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-水（含5 mmol/L乙酸铵）等流动相对峰型的影响，结果显示，上述流动相均无法解决峰分叉的问题。由图2可看出，Hypersil Gold aQ柱可以使16种化合物达到分析的要求，16种化合物基线完全分离，峰型对称。从不同流动相梯度洗脱实验的结果来看，甲醇-水（含5 mmol/L乙酸铵）和乙腈-水（含5 mmol/L乙酸铵）均能满足16种化合物的洗脱要求，且灵敏度无明显差异，与范广宇[21]等结论不同，从环保和经济成本考虑，本文选择甲醇-水（含5 mmol/L乙酸铵）为流动相进行梯度洗脱。
2.2 仪器条件优化
比较了正离子和负离子模式下各物质的响应值，结果见表2。由表2可知，阿斯巴甜在正离子模式下响应值优于负离子模式，其他15种化合物在负离子模式下响应值优于正离子模式，为满足所有化合物的最佳测定需求，本研究选择了正负离子同时扫描的模式，优化条件后16种化合物的电离模式、精确质量数等信息见表2。
表2 16种甜味剂的精确质量数、电离模式、保留时间、定性离子等参数
Table 2 Accurate mass,ionization mode,retention time,qualitative ions of 16 sweeteners
2.3 样品前处理
分别开展了酒样稀释5倍、稀释10倍和氮吹除醇3种前处理方式实验，结果显示，酒样稀释5倍，基质效应比较严重，部分化合物低浓度加标回收率＜50%，高浓度加标水平加标回收率＞150%；而样品稀释10倍，酱香型白酒存在低浓度加标回收率偏低，高浓度加标回收率偏高问题。进一步加大稀释倍数，可以解决酒样基质效应问题，但因方法的定量限较高，不符合实际样品的检测，因此稀释方法不适合所有白酒中痕量甜味剂的检测。
试验进一步采用氮吹结合高速冷冻离心处理的方式，白酒样品在40 ℃水浴条件下氮吹，去除白酒中部分易挥发性物质和乙醇，高速冷冻离心去除其他干扰物质，结果发现16种甜味剂的回收率、精密度和样品定量限均可满足检测需求。所以试验中样品的前处理选择40 ℃水浴条件下氮吹，4 ℃、12 000 r/min条件下冷冻离心10 min处理。
2.4 方法学评价
2.4.1 线性关系、检出限
在优化条件下，配制了16种化合物的系列混合标准溶液，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程和相关系数（R2），根据3倍信噪比确定方法检出限（limit of detection，LOD），10倍信噪比确定方法的定量限（limit of quantity，LOQ），结果见表3。可以看出，16种化合物在各自质量浓度范围内线性良好，相关系数（R2）均＞0.995。三氯蔗糖、蔗糖较同种类型甜味剂的定量限高，安赛蜜、糖精钠、甜蜜素等甜味剂定量限低，但其线性范围较窄。
表3 16种甜味剂的线性范围、回归方程、相关系数和定量限
Table 3 Linearity range,regression equation,related coefficient,and quantitation limits of 16 sweeteners
2.4.2 精密度与回收率
选取空白酒样进行加标回收和精密度实验，由于天然甜味剂与人工甜味剂的定量限存在数量级差异[21]，因此人工合成甜味剂的加标质量浓度为20 μg/L、50 μg/L、200 μg/L 3个水平，天然甜味剂加标浓度为100μg/L、200μg/L、500μg/L 3个水平，样品经过上述1.3.3节所述方法处理后，每个水平重复6次，得到方法的回收率和精密度，结果见表4。由表4可知，3个添加水平下7种人工甜味剂、9种天然甜味剂的平均回收率为75.8%～119.7%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.1%～12.0%（n=6），表明精密度和准确度较好。
表4 16种甜味剂的回收率和精密度（n=6）
Table 4 Recovery rates and precisions of 16 sweeteners (n=6)
续表
注：“ND”代表含量低于定量限。下同。
2.5 实际样品测定
将本方法应用于市售的9款白酒（L1～L9）中多种甜味剂的检测，结果见表5。由表5可知，3款白酒有蔗糖检出，只有1款白酒有甜菊苷检出。
表5 市售9款白酒中16种甜味剂的检测结果
Table 5 Determination results of 16 sweeteners from 9 kinds of commercial Baijiu μg/L
3 结论
本研究建立了快速检测白酒中7种人工甜味剂和9中天然甜味剂的超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法。白酒样品经过加热氮吹除醇、水定容后冷冻离心，15 min内完全分离，在3个不同加标水平下，回收率在75.8%～119.7%之间，相对标准偏差为0.1%～12.0%（n=6），定量限0.2～25.5 μg/L。同时对市售的不同香型酒进行检查，结果表明，该检测方法快速、简单、准确、灵敏度高，适用于白酒中16种痕量甜味剂的定性、定量检测。
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