蜂粮顾名思义为蜜蜂的食物，是幼蜂的主要食物来源，对于蜂群的繁衍生息具有重要作用[1]。蜜蜂在蜂巢中将采集到的花粉团咬碎后用蜂蜡封藏，封藏的花粉团在微生物的作用下，经过一定时间的发酵便形成了蜂粮[2-3]。蜂粮的保健作用是近年来才被开发的，蜂粮具有丰富的营养并且能够提高人体抵抗力，目前已经成为一种极具开发前景的产品[4-5]。近些年，蜂粮商品在巴西、新加坡等国家已有上市，但是蜂粮商品在我国市场几乎没有。
虽然天然蜂粮的产量比较稳定，但是由于以下原因无法像其他蜂产品一样可以容易地获取：一是因为天然蜂粮被蜜蜂封在蜂房中，人为收集会破坏蜂房结构，影响蜂群的生活习性；二是天然蜂粮的产量低，仅仅只是供应幼虫的营养，人为强取会影响整个蜂群的繁衍生息；三是天然蜂粮的成分复杂，且含有蜂卵等不易去除的杂质，因而对生产加工要求高[6-7]。所以要进行人工发酵蜂粮，人工发酵蜂粮的优点有以下几个方面：一是人工发酵蜂粮的原料是花粉，来源不受限制，可进行大规模生产；二是人工发酵蜂粮是用纯天然花粉进行发酵，不添加任何添加剂，从而保证发酵产品营养成分贴近于天然蜂粮。本研究对人工蜂粮的两种发酵方式（固态发酵和液态发酵）的乳酸菌活菌数以及主要的营养成分进行了对比分析，为后续人工蜂粮大规模生产提供参考依据[8-10]。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
菌种：从天然蜂粮中提取出植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为发酵菌株。
MRS固体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉5g/L，葡萄糖20g/L，吐温-80 1 mL，酵母粉4 g/L，琼脂粉15 g/L，乙酸钠5 g/L，柠檬酸三铵2 g/L，硫酸镁0.2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，pH 6.2。
硫酸、乙醇、硼酸、蒽酮、氢氧化钠（分析纯）：重庆川东化工厂。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-1BU/18U型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；SHP-250型生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；THZ-C型摇床：北京寅韬兴业科技有限公司；30L-7000c发酵罐：上海保兴生物设备有限公司；日立835-50型氨基酸自动分析仪：日本日立公司；723N 型可见分光光度计：上海光学仪器一厂；SHZ-D真空泵：上海晖创化学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌种培养
在超净工作台内挑取1～2环保藏在斜面上的植物乳杆菌接种于MRS平板上，置于37 ℃的生化培养箱中倒置培养12 h。然后挑取2～3环已经活化的菌株到30 mL MRS液体培养基中，在37 ℃条件下摇床培养12 h，制成浓度约为106个/mL的菌悬液[11]。
1.3.2 固态发酵方法
称取50 g花粉倒入锥形瓶内，与20%的无菌水混匀高压灭菌之后，待温度降至40 ℃左右加入9%的乳酸菌培养液后置于35 ℃的生化培养箱中发酵8 d，发酵结束后对发酵产品进行冷冻真空干燥[9，12]。
1.3.3 液态发酵方法
称取花粉500 g经研磨、过筛后，倒入发酵罐内，加入料液比为0.13∶1（g∶mL）的无菌水充分混匀后高压灭菌30 min。冷却后，接入10%的乳酸菌培养液，设定发酵罐温度为33 ℃，搅拌转速为445 r/min，待发酵罐显示屏上连续2 d之内的pH变化＜0.02时停止发酵，发酵结束后对发酵产品进行离心、冷冻真空干燥处理[6，13]。
1.3.4 蜂粮中乳酸菌活菌数的测定
称取5.0 g蜂粮倒入三角瓶（装有适量玻璃珠）中，然后加入15 mL蒸馏水进行振荡，使样品被研磨成均匀的稀释液。用梯度稀释法再次进行稀释，稀释梯度分别为10-1，10-2，10-3，……10-9，在超净工作台内吸取100 μL各个梯度的样品到MRS固体培养基上，涂布均匀后将平板放入37 ℃培养箱内培养2 d后选择蜂粮含菌量大概在10个/cm2的梯度平板为适宜浓度，两个平板为一个浓度，结果取平均值[14-15]。
1.3.5 蜂粮感官评定
（1）感官评定评价标准
感官评定主要考虑蜂粮产品的颜色、香气、口感，具体的评价方法为：采用标准比色卡对蜂粮的颜色进行对比之后，在距离鼻子0.5 cm处通过嗅觉感受香气，然后称取5 g蜂粮取食感受蜂粮的口感。每项指标满分5分，请5名专业的食品评判员对这三个指标进行打分，评分标准如表1所示[16]。
表1 蜂粮感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standard of bee bread
（2）感官评定指标权重
为了把握单个指标在总评价中的相对水平，请8名从事食品检测和评价的工作人员对以上三个感官评价因素进行打分，从而确定蜂粮感官评价时各因素的权重。
1.3.6 蜂粮中总糖含量的测定
采用蒽酮比色法[17-18]对蜂粮中的总糖含量进行测定。在试管中加入0.2 g新鲜蜂粮，加入5 mL蒸馏水，振荡均匀后管口加盖在沸水浴煮沸10 min，流水冷却至室温，过滤，将滤液配制成25 mL的水溶液。然后取上述溶液0.1 mL，然后加0.9 mL的蒸馏水进行稀释，按标准曲线测定的方法，测定溶液的吸光度值，并重复操作3次。总糖含量的计算公式如下：
1.3.7 总蛋白含量的测定
采用凯氏定氮法对花粉、天然蜂粮、固态以及液态发酵的蜂粮进行蛋白质含量的测定[19]。
1.3.8 氨基酸含量的测定对花粉、天然蜂粮、固态以及液态发酵的蜂粮进行氨基酸含量的测定[20]。
2 结果与分析
2.1 固态发酵与液态发酵蜂粮中乳酸菌活菌数的曲线分析
对固态及液态发酵过程中每一天的蜂粮进行乳酸菌活菌数的测定，连续测定8 d，测定结果如图1所示。
图1 两种发酵方式蜂粮中乳酸菌活菌数的曲线
Fig.1 Curve of viable lactic acid bacteria count in bee bread by two fermentation methods
根据图1的曲线可以观察到，固态发酵过程中蜂粮中乳酸菌的活菌数在发酵第7天达到最大值为1.65×107 CFU/g，液态发酵条件下，蜂粮中乳酸菌活菌数在发酵第3天达到最大值为2.12×107 CFU/g，且远远高于固态发酵。这说明液态发酵条件更有利于乳酸菌的生长繁殖，因而经液态发酵的蜂粮中的活菌数更多。
2.2 两种发酵方式发酵蜂粮的感官评分
8名工作人员对蜂粮3个感官因素的评价结果见表2。
表2 感官评定的指标权重
Table 2 Index weight of sensory evaluation
综合表1和表2，经过计算，蜂粮的颜色、香味、口味的权重系数分别为0.29、0.27、0.44。设蜂粮颜色评分为X，香味评分为Y，口味评分为Z，则蜂粮综合感官评分公式为：蜂粮综合感官评分=0.29X+0.27Y+0.44Z。
请专业的食品评判员对固态和液态发酵的蜂粮进行感官评分，再根据综合计算公式得到感官评分，结果如表3所示。
表3 两种发酵方式蜂粮感官评分对比
Table 3 Comparison of sensory score of bee bread between two fermentation methods
根据表3的结果可知，从颜色来看，经固态发酵的蜂粮颜色较液态发酵的颜色浅；从香味来看，液态发酵的蜂粮香气更浓；从口感分析，液态发酵的蜂粮的口感更好。综合分析，相比于固态发酵，液态发酵的蜂粮的感官评分更高，得分为4.44分。
2.3 总糖含量
为了研究发酵对花粉中总糖含量的影响，对天然花粉、天然蜂粮、固态发酵以及液态发酵的人工蜂粮进行总糖含量的测定，测定结果如表4所示。
表4 花粉、天然蜂粮、固态发酵蜂粮以及液态发酵蜂粮的总糖含量对比
Table 4 Comparison of total sugar content of pollen,natural bee bread,solid-state and liquid-state fermented bee bread
由表4可知，经过发酵后的花粉的总糖含量升高，且人工发酵的蜂粮中的总糖含量高于天然蜂粮；液态发酵的蜂粮中的总糖含量略微高于固态发酵。这可能是因为液态发酵更为彻底，使得蜂粮中的可溶性糖含量尤其是果糖含量增多。
2.4 总蛋白含量
为了探究发酵对花粉中总蛋白含量的影响，对花粉、天然蜂粮、固态以及液态发酵的蜂粮进行总蛋白含量的测定，测定的结果如表5所示。
表5 花粉、天然蜂粮、固态以及液态发酵蜂粮中总蛋白含量的对比
Table 5 Comparison of total protein content in pollen,natural bee bread,solid-state and liquid-state fermented bee bread
根据表5的数据可以得知，经过发酵后的蜂粮总蛋白的含量有轻微上升，并且可以看出液态发酵的蜂粮中总蛋白含量略高于固态发酵。分析可能是因为液态发酵加入的乳酸菌培养液较多，而培养液中有含氮物质，经过发酵后转变成了某种有机氮分子，从而使得总蛋白含量升高。
2.5 氨基酸含量
为了探究发酵对花粉中氨基酸含量的影响，对花粉、天然蜂粮、固态以及液态发酵的蜂粮中氨基酸含量进行测定，测定的结果如表6所示。
表6 花粉、天然蜂粮、固态以及液态发酵蜂粮中氨基酸含量的对比
Table 6 Comparison of amino acid contents in pollen,natural bee bread,solid-state and liquid-state fermented bee bread g/100 g
根据表6的结果可以发现，人工发酵蜂粮中各种氨基酸含量丰富，尤其是天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量较高，而这些氨基酸对增强免疫能力有很大帮助。并且可以看出固态发酵的蜂粮中氨基酸含量不及液态发酵氨基酸含量高。原因可能为乳酸菌培养液中的含氮分子经过一系列反应生成了各种氨基酸。
3 结论
通过考察蜂粮发酵产品的品质，对蜂粮的总糖含量、总蛋白含量以及氨基酸含量进行了分析测定。实验证明了人工发酵蜂粮中的总糖、总蛋白含量以及氨基酸含量均优于天然蜂粮和花粉；使用同样的乳酸菌对同种花粉进行发酵的结果表明，无论是蜂粮中总糖含量、总蛋白含量还是氨基酸含量，液态发酵的蜂粮的结果都明显高于固态发酵。这是由于液态发酵经过搅拌，乳酸菌与花粉的接触面积变大，有利于花粉的充分发酵。从大规模生产的角度上来考虑，液态发酵乳酸菌繁殖快，能够提高生产效率；另一方面液态发酵生产的蜂粮感官评分以及主要营养成分，如总糖、总蛋白以及氨基酸含量都高于固态发酵，保证了人工发酵蜂粮的质量。因此用液态发酵蜂粮的方式具有更多的优势，可用此进行蜂粮的大规模生产。
[1]嵇保中，刘曙雯，徐丽娜，等.蜂粮研究进展[J].中国农学通报，2006，22（8）：165-165.
[2]刘祥伟，王静，高夫超，等.天然蜂粮的营养成分分析[J].中国蜂业，2012，63：31-32.
[3]段传人，暴佳芳，石轶松，等.枇杷花和油菜花蜂粮中微生物的分离与鉴定[J].食品工业科技，2015，36（5）：175-180.
[4]黄文诚.微生物在蜂群营养和健康上的重要性（三）[J].中国蜂业，2010，61（11）：55-56.
[5]贺春玲，张淑霞，侯小改，等.黄胸木蜂蜂粮的蛋白质和矿物元素分析[J].营养学报，2016，38（2）：414-416.
[6]冯永芬.蜂粮人工发酵新工艺的探索及其质量标准的制定[D].重庆：重庆大学，2015.
[7]张明海，张石胜，张少斌.我国蜂粮研究与开发利用的进展[C]//全国花粉资源开发与利用联络组中国林业科学研究院.第十一届全国花粉资源与开发利用研讨会论文集.缙云：2010：19-21.
[8]路龙女，唐欣昀.纳豆固体发酵和液体发酵条件的研究[J].安徽农业科学，2011，39（26）：16433-16434.
[9]訾慧，白洪志，王惠，等.利用农业废弃物对青霉菌进行固态发酵生产纤维素酶[J].江苏农业科学，2018，46（5）：285-289.
[10]朱奇，刘国富，郭善利，等.双歧因子人工蜂粮保健食品及抑瘤作用研究[J].食品科技，2004（1）：91-92.
[11]MAJDIAH O,ARIFF A B,LEONARDO R S,et al.Extractive fermentation of lactic acid in lactic acid bacteria cultivation:a review[J].Front Microbiol,2017,8:1-5.
[12]赵光雷，郑赛，古芸，等.利用豆粕和小麦秸秆生产多肽的固体发酵工艺条件优化[J].应用与环境生物学报，2018，24（1）：20-25.
[13]杨文超，刘赛，吴珍红，等.蜂粮源乳酸菌发酵油菜蜂花粉的工艺优化[J].中国蜂业，2012，63：68-73.
[14]李可义.单菌种和混合菌种在发酵饲料中乳酸菌数量的动态变化研究[J].江西水产科技，2017（1）：8-9.
[15]WANG Y C,YU R C,CHOU C C.Viability of lactic acid bacteria and bifidobacteria in fermented soymilk after drying,subsequent rehydration and storage[J].Int J Food Microbiol,2004,93(2):209-217.
[16]张爱霞，生庆海.食品感官评定的要素组成分析[J].中国乳品工业，2006，34（12）：51-53.
[17]RECH A M,WEILER F H,FERRÃO M F.Determination of total sugar content in soy-based drinks using infrared spectroscopy and chemometrics[J].Food Anal Meth,2018:1-8.
[18]文赤夫，董爱文，李国章，等.蒽酮比色法测定紫花地丁中总糖及还原糖含量[J].现代食品科技，2005，21（3）：122-123.
[19]冯芷媚，袁秦，黄敏菊，等.凯氏定氮法对几种胶原类产品中蛋白质含量测定结果分析[J].中国医疗器械信息，2018，24（9）：26-27.
[20]刘婷婷，邢青斌，程家丽，等.桦褐孔菌氨基酸含量测定方法的建立[J].营养学报，2017（5）：504-506.