刺梨（Rosa roxbunghii）又名山王果、茨梨、木梨子，属蔷薇科蔷薇属植物，主要分布于亚热带及暖温带地区，在我国主要分布于贵州、云南和四川等地，其中以贵州的野生与栽培资源最为丰富[1-3]。刺梨始载于《贵州通志》，性平，味苦、涩，归胃、大肠经，具有消食健脾，收敛止泻的功效，临床用于治疗积食腹胀，泄泻等症[3-4]。刺梨鲜果中含有18种氨基酸、维生素C、胡萝卜素、B族等多种维生素，以及钙、铁、碘、锌、硒等10多种微量元素。孙悦等[5]通过正交试验优选了刺梨中维生素C的闪式提取工艺，结果显示优化出的工艺条件简单、经济，提取率高。此外，刺梨中还含有多种活性成分，如黄酮、多酚、多糖、三萜类化合物等[3，6-7]。李志[8]采用正交试验对刺梨中总黄酮的提取工艺进行了优化，结果显示，在最优的工艺条件下刺梨总黄酮提取得率为0.57%；刘英等[9]在单因素试验基础上，通过中心组合试验设计（central composite design，CCD），优化了刺梨中总黄酮的提取工艺，结果显示总黄酮的提取率为10.76%；张汇慧等[10]通过中心组合试验设计优化了刺梨黄酮的半仿生法提取工艺，在最佳工艺条件下总黄酮提取量为27.70 mg/g；李光等[11]通过响应面试验优化了刺梨中多酚的提取工艺，结果显示，在最佳工艺下多酚的平均提取含量为1.811 7%。孙红艳等[12]通过正交试验优化了超声波法提取刺梨多酚的工艺，多酚提取率达15.930 mg/g。成刚等[13]通过正交试验对微波辅助法提取刺梨多糖的工艺进行了优化，结果刺梨多糖的提取率达到16.036%，多糖含量为90.68%。代甜甜等[14]采用乙醇回流法提取得到刺梨总三萜，并对总三萜的含量测定方法进行了研究，结果显示，在建立的含量测定方法下刺梨总三萜含量以熊果酸计为57.9%。目前鲜有有关刺梨总皂苷提取工艺研究的相关报道，为此，本研究利用响应面试验对微波辅助超声法提取刺梨中总皂苷的工艺进行了探索优化，以期为更好地开发和利用刺梨提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
刺梨：采于贵州省毕节市七星关区，经吉林化工学院钟方丽教授鉴定为蔷薇科植物缫丝花（Rosa roxburghii Tratt.）的果实，自然阴干后备用；齐墩果酸（纯度＞98%）：成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；乙醇（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
TU-1950紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；XH-300UL电脑微波超声波紫外光组合催化合成仪：北京祥鹄科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵：巩义市予华仪器有限公司；RE-3000A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；FA2204B电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；SK2510HP超声波清洗器：上海科导超声仪器有限公司；DZF6050型真空干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 总皂苷含量测定方法
对照品溶液制备：精密称取齐墩果酸2.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加适量甲醇超声溶解，继续加甲醇稀释至刻度，即得质量浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液。
供试品溶液制备：准确称取粉碎后的刺梨粉末（过60目筛）5.0 g，置于100 mL圆底烧瓶中，按既定的提取工艺进行刺梨总皂苷的提取，提取液进行减压回收溶剂，80 ℃水浴蒸干残留液，得浸膏，真空干燥，精密称取干浸膏2.0 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度即得供试品溶液。
齐墩果酸标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL分别置于5个10 mL具塞带刻度试管中，在70 ℃水浴条件下挥干溶剂，然后分别加入6%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，高氯酸1.0 mL，于60 ℃水浴条件下振荡反应20 min，取出，自然冷却至室温，以冰醋酸稀释至刻度，在548 nm波长条件下测定吸光度值（A），以标准品质量浓度（C）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为A=35.96C-0.002 1，相关系数R2=0.998 0。
供试品溶液中总皂苷含量测定：精密移取供试品溶液0.8 mL，按标准曲线制作步骤测得供试品溶液吸光度值，刺梨总皂苷得率计算公式如下：
式中：Y表示总皂苷得率，%；w表示每次提取刺梨总皂苷得到的干浸膏质量，g；Ai表示供试品溶液吸光度值。
1.3.2 刺梨总皂苷提取工艺优化单因素试验
准确称取刺梨粉末5份，每份5.0 g，分别按液料比（8∶1、10∶1、12∶1、15∶1、18∶1、20∶1（mL∶g））加入不同体积分数（20%、30%、40%、50%、60%、70%）的乙醇溶液，在微波功率（200 W、300 W、400 W、500 W、600 W、700 W），超声频率40 KHz，超声功率1 200 W的条件下进行超声辅助提取，超声时间（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min），过滤，得提取液，制得供试品溶液，测定刺梨总皂苷得率，考察乙醇体积分数、液料比、微波功率及超声时间对提取总皂苷的影响。
1.3.3 刺梨总皂苷提取工艺优化响应面试验
在单因素试验结果基础上，根据CCD原理，选取乙醇体积分数（X1）、液料比（X2）、微波功率（X3）、超声时间（X4）作为自变量，以刺梨总皂苷得率（Y）为因变量，设计响应面试验[15-18]。试验设计的因素及水平见表1。
表1 刺梨总皂苷提取工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extraction technology optimization of total saponins from Rosa roxburghii
1.3.4 数据处理
所有试验数据均为重复3次试验后的平均值，响应面试验结果采用Minitab 16.2软件进行分析处理，利用Origin 9.2进行绘图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 乙醇体积分数对刺梨总皂苷得率的影响
图1 乙醇体积分数对刺梨总皂苷提取率的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total saponins from Rosa roxburghii
从图1中可以看出，当乙醇体积分数在20%～50%时，刺梨总皂苷的得率随乙醇体积分数增大而迅速升高，当乙醇体积分数达到50%时，刺梨总皂苷得率最大，为3.8%，随后随着乙醇体积分数＞50%之后，刺梨总皂苷得率开始逐渐降低，可能是由于乙醇体积分数增加后，其他非皂苷成分溶出增多所致。因此，选择乙醇体积分数40%、50%、60%进行响应面试验。
2.1.2 液料比对总皂苷提取率的影响
图2 液料比对刺梨总皂苷得率的影响
Fig.2 Effect of liquid to material ratio on extraction rate of total saponins from Rosa roxburghii
从图2可以看出，开始阶段刺梨总皂苷得率随液料比在8∶1～15∶1（mL∶g）范围内的增大而逐渐上升，当液料比为15∶1（mL∶g）时，刺梨总皂苷得率最大，为3.83%，之后随着液料比继续增大，刺梨总皂苷得率开始下降，但液料比对刺梨总皂苷得率的总体影响不大。因此，液料比选择12∶1、15∶1、18∶1（mL∶g）进行响应面试验。
2.1.3 微波功率对刺梨总皂苷得率的影响
图3 微波功率对刺梨总皂苷得率的影响
Fig.3 Effect of microwave power on extraction rate of total saponins from Rosa roxburghii
从图3中可以看出，微波功率对刺梨总皂苷得率的影响比较显著，当微波功率＜500 W之前，刺梨总皂苷的得率随微波功率增加而迅速增大，当微波功率为500 W时，刺梨总皂苷得率最大，为3.81%，而后随着微波功率的继续增大，刺梨总皂苷得率开始下降，可能是由于微波功率增加后，其它非皂苷成分溶出增多所致，因此微波功率选择400 W、500 W、600 W进行响应面试验。
2.1.4 超声时间对刺梨总皂苷得率的影响
图4 超声时间对刺梨总皂苷得率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of total saponins from Rosa roxburghii
从图4中可以看出，刺梨总皂苷得率随超声时间在5～20 min范围内延长而逐渐增大，当超声时间为20 min时，刺梨总皂苷得率最大，为3.93%，之后随着超声时间继续延长，刺梨总皂苷得率开始下降，因此超声辅助提取时间选择15 min、20 min、25 min进行响应面试验。
2.2 响应面试验分析结果
2.2.1 响应面试验结果
在单因素试验结果基础上，根据CCD原理，选取乙醇体积分数（X1）、液料比（X2）、微波功率（X3）、超声时间（X4）作为自变量，以刺梨总皂苷得率（Y）为因变量设计响应面试验，响应面试验设计及结果如表2所示。
表2 刺梨总皂苷提取工艺优化响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface experiments for extraction technology optimization of total saponins from Rosa roxburghii
续表
利用Minitab 16.2软件对表2中数据进行分析处理，得到以Y为因变量，X1、X2、X3、X4为自变量的四元二次方程：Y=-14.41+0.2X1+0.3X2+0.03X3+0.37X4+2.29E-003X1X2-2.5E-005X1X3+1.43E-003X1X4-9.17E-005X2X3+5.58E-003X2X4+4.25E-004X3X4-2.32E-003X12-0.017X22-2.90E-005X32-0.018X42，对此模型进行方差分析及显著性检验，结果见表3。
从表3中可以看出，回归模型的P值为0.000 4，显著性分析结果为极显著（P＜0.01）；失拟项的P值为0.133 6＞0.05，说明模型的拟合程度良好，影响拟合的因素对试验结果干扰很小；方程决定系数R为0.844 9，说明响应值的变化有84.49%来源于所选变量，由此反映出回归模型的拟合程度良好，试验误差小，可用该回归方程代替试验真实点进行分析和预测总皂苷得率。一次项X1、X3、X4、交互项X3X4、二次项X22对总皂苷得率影响显著（P＜0.05），二次项X12、X32、X42对总皂苷得率影响极显著（P＜0.01），而其他项影响则不显著（P＞0.05），由此反映试验选定的各因素对响应值的影响不是简单的线性关系。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
2.2.2 响应曲面分析
为了更加清晰表达两个因素对刺梨总皂苷得率的影响，在固定试验选定的因素中任意两个的值为零水平对应实际值的基础上，考虑另外两个因素对总皂苷得率的影响，根据回归模型绘制响应曲面图和等高线图[19-22]，结果如图5所示。
图5 各因素交互作用对总皂苷得率影响的响应曲面和等高线图
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on total saponins yield
由图5可知，响应曲面越陡峭，表明该因素对试验结果的影响越显著[12-15]，曲面顶点即为交互因素最佳取值的试验结果，将响应曲面对底面做投影可得等高线图，等高线图的中心更加直观地反映出最佳的提取工艺。从图5中可以看出，微波功率、乙醇体积分数、超声时间对总皂苷得率影响比较明显，而微波功率和超声时间二者的交互作用对试验结果影响也比较显著，这与表3的方差分析结果相吻合。
利用Minitab软件可同时得到回归模型优化的最佳提取工艺参数：乙醇体积分数为54.37%，液料比为14.8∶1（mL∶g），微波功率为545.05 W，超声时间为21.66 min，考虑到实际情况，将上述工艺参数修正为：乙醇体积分数54%、液料比15∶1（mL∶g）、微波功率545 W、超声时间22 min。在此最佳工艺条件下，重复3次平行验证试验，刺梨总皂苷得率为4.18%，实际平均得率与理论得率的差值仅占理论得率的0.7%，说明由模型方程优化的最佳工艺条件稳定可靠。
3 结论
采用微波辅助超声法提取刺梨总皂苷的方法，以总皂苷得率为考察指标，在单因素试验的基础上，利用响应面实验设计优化了提取刺梨总皂苷的工艺条件，结果显示，在乙醇体积分数54%、液料比15∶1（mL∶g）、微波功率545 W、超声时间22 min的工艺条件下，刺梨总皂苷实际得率为4.18%，与理论预测值接近。反映了微波辅助超声法可有效提取刺梨中总皂苷，为刺梨总皂苷在医药保健品领域的应用开发提供了参考。
[1]中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1998：452.
[2]贵州植物志编辑委员会.贵州植物志[M].贵阳：贵州人民出版社，1982：223.
[3]李齐激，南莹，杨艳，等.HPLC 法测定药食两用植物刺梨中刺梨苷的含量[J].中国民族民间医药，2016，25（9）：22-23.
[4]贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准[M].贵阳：贵州科学技术出版社，2003：230.
[5]孙悦，林冰.刺梨中维生素C 的闪式提取工艺研究[J].中国食品添加剂，2018（9）：129-133.
[6]刘丹，江帆，丁小艳，等.黔产刺梨果中总多酚的含量测定及其干燥方式考察[J].中国实验方剂学杂志，2016，23（23）：20-23.
[7]赵转地，张爱华，洪峰.刺梨及其产品的营养及保健药用价值研究进展[J].环境与职业医学，2007，24（1）：82-84.
[8]李志.正交试验法优化刺梨黄酮提取工艺研究[J].云南师范大学学报（自然科学版），2018，38（6）：40-45.
[9]刘英，张丽艳，罗君，等.响应面法优化刺梨总黄酮提取工艺[J].食品研究与开发，2018，39（2）：51-55.
[10]张汇慧，刘龙云，吴彩娥，等.刺梨黄酮的半仿生法提取工艺及组分研究[J].南京林业大学学报（自然科学版），2017，41（6）：47-53.
[11]李光，余霜，杨筱珊，等.响应曲面法优化无籽刺梨多酚提取工艺研究[J].安顺学院学报，2017，19（2）：134-136.
[12]孙红艳，胡凯中，郭志龙，等.超声波法提取刺梨多酚的工艺优化及体外抑菌活性研究[J].中国食品添加剂，2016，17（2）：57-61.
[13]成刚，杜超，李学婷，等.微波辅助提取刺梨多糖的工艺优化[J].贵州农业科学，2018，46（1）：97-100.
[14]代甜甜，李齐激，陈晓靓，等.刺梨总三萜的提取及含量测定[J].贵州师范大学学报（自然科学版），2018，36（3）：36-39.
[15]高涵，张丽姿，焦梦悦，等.响应曲面优化分心木中总皂苷的提取工艺[J].食品研究与开发，2019，40（7）：105-109.
[16]许世林，李佳川，何晓磊，等.响应面法优化石榴保健果醋发酵工艺及其降糖降脂活性[J].中国酿造，2019，38（3）：99-103.
[17]陈帅，王慧竹，薛健飞，等.响应面法优化超声提取野葛茎中葛根素的工艺[J].广东农业科学，2015，42（4）：60-66.
[18]陈帅，王慧竹，钟方丽，等.葫芦巴总黄酮提取工艺及其体外抗氧化活性[J].青岛科技大学学报（自然科学版），2015，36（6）：628-634.
[19]张崇军，唐贤华，赵龙，等.响应面法优化大曲中黄曲霉毒素B1提取工艺[J].中国酿造，2018，37（12）：132-136.
[20]张海全，陈友发，黄勤英，等.响应面法优化罗汉果总黄酮提取工艺及其抑菌活性研究[J].河南工业大学学报（自然科学版），2018，39（6）：65-70.
[21]马金菊，孙江飞，武文浩，等.响应面法优化无花果叶总黄酮超声辅助提取工艺[J].中国酿造，2018，37（3）：140-144.
[22]WANG H,LI Y,REN Z,et al.Optimization of the microwave-assisted enzymatic extraction of Rosa roxburghii Tratt.polysaccharides using response surface methodology and its antioxidant and α-D-glucosidase inhibitory activity[J].Int J Biol Macromol,2018,112(6):473-482.