口含烟是一种直接入口食用的新型无烟气烟草制品，受到世界各烟草企业关注[1-2]。与传统卷烟不同，口含烟是不经过燃烧直接放入口中吸食的[3]，其口感和冲击强度直接受烟草原料的感官特性影响，因此口含烟制品对烟叶原料的品质要求更高。
微生物发酵是改善口含烟烟草原料品质的有效手段[4-6]。近年来，国内外研究均发现采用人工控制微生物发酵技术可以消除烟叶的青杂气和减轻刺激性，使烟叶香气质和香气量变佳[7-8]或降解烟草中有害物质[9-10]等。此外，微生物代谢过程中往往会产生对人体有益的功效性成分，如有助于消化的蛋白酶、可以溶解血栓的纳豆激酶（nattokinase，NK）[11-12]等。因此接种合适的功能微生物于烟叶中发酵不仅可从感官上增香提质，同时还能产生一些可大大提高口含烟食用价值的功能活性物质。
解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一种非致病性益生菌[13]，可用作多种食品工业酶的生产菌株[14]，能产生一系列抑制真菌和细菌活性的自身代谢产物，如多种消化酶、抗生素、抗菌蛋白或多肽类物质等[15-16]，已广泛应用于食品生产、水产养殖及蔬菜保鲜等众多领域[17-20]。基于此，初次采用实验室筛选出的具有优良产纳豆激酶和蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌GUHP-86对口含烟烟草原料进行人工控制接种发酵，考察发酵前后烟草原料成分的改变，并进一步考察发酵过程中产酶情况及降低烟草中亚硝酸盐的情况，为解淀粉芽孢杆菌在烟草发酵中的提质降害提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
口含烟烟草原料大理红大CL314：云南中烟工业有限责任公司；纤维蛋白原、水杨苷：美国Sigma公司；福林酚试剂：上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为色谱纯或分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefacien）GUHP-86：保藏于中国典型培养物保藏中心（保藏编号CCTCC M 2016003）。
发酵培养基：胰蛋白胨2 g、酵母提取物1 g、NaCl 10 g、葡萄糖1 g，补充蒸馏水至1 000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
有糖盐溶液：准确称取MgCl20.5 g、KCl0.5 g、CaCl20.5 g、NaCl 0.5 g、葡萄糖2 g，补壳蒸馏水至1 000 mL，溶解灭菌后备用。
1.2 仪器与设备
7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪（gaschromatographymass spectrometry，GC-MS）（配PAL3多功能自动进样器）：美国Agilent公司；BSA124S-CW型电子天平：德国sartorius公司；A10超纯水机：美国Millipore公司；Q/YXLZ82 分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；SPX恒温生化培养箱：上海科恒实业发展有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头：美国Supelco公司。
1.3 方法
1.3.1 烟叶发酵
发酵培养基中接入解淀粉芽孢杆菌GUHP-86于37 ℃、180 r/min培养18 h，取出后置于灭菌的离心管内，4 ℃、8 000 r/min离心10 min，弃上清，加入无菌生理盐水至20 mL，摇匀。称取20 g烟叶于密封袋内，吸取4 mL（即接种20%）离心管内的菌液、4 mL有糖盐溶液，直接加入烟叶中，充分混匀，于37 ℃培养箱内发酵培养15 d，每天对其进行换气。
1.3.2 酶活力测定
精确称取磨碎的发酵烟草样品1 g于烧杯中，用25 mL磷酸盐（phosphate buffer saline，PBS）缓冲溶液浸提24 h，然后用慢速定性滤纸过滤，滤液待用。纳豆激酶活力用紫外分光光度法测定[21-22]。蛋白酶活力参照GB/T23527—2009《蛋白酶制剂》[23]进行测定。
1.3.3 亚硝酸盐测定
精确称取3.0 g磨成粉末状的发酵烟叶样品，置于250 mL锥形瓶里，加入10 mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，加入蒸馏水150 mL，70 ℃水浴加热30 min后过滤，滤液转入250 mL容量瓶中，在旋转的同时加入5 mL亚铁氰化钾溶液，摇匀并加入5 mL醋酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀后过滤，滤液备用。参照GB 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中分光光度法进行亚硝酸盐测定。
1.3.4 挥发性成分GC-MS分析
将2 g发酵烟草样品放入10 mL顶空固相微萃取瓶，配50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，萃取条件为70 ℃保持5 min，70 ℃吸附30 min。待萃取结束后，在GC进样口解吸，解吸温度250 ℃，时间5 min。
GC-MS条件：DB-wax毛细管柱（60m×0.25mm×0.25mm）；进样口温度：240 ℃；载气：氦气（He），流速1.5 mL/min；分流比2∶1；升温程序：初始温度40℃，保持1min，以10℃/min升至120 ℃，保持1 min；以3 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。传输线温度：240 ℃；电离方式：电子电离源（electron ionization，EI）；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；扫描范围：33～350 amu；数据采集模式：全扫描。采用美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）谱库检索定性。
1.3.5 数据分析
利用SPSS version 19.0进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 GUHP-86发酵烟丝挥发性物质的变化
采用GC-MS考察了菌株GUHP-86接种烟叶发酵前后挥发性物质的变化，结果见表1。
由表1可知，发酵后口含烟草的挥发性物质的种类及相对含量均发生了变化。发酵后烟叶中出现了新的物质如哌啶类和喹啉类，而嘧啶类物质消失，酮类、烃类含量基本不变，醇类、醛类、烷烃类物质明显增加，但酯类含量稍有降低，酸类物质大幅度减少。发酵后烟叶中消失了一些成分，如植醋酸、糠醇、丁内酯、乙酸、大马酮等，但也产生了一些成分，如2-哌嗪酮、3-羟基-N-甲基哌啶、邻苯二甲酸、4-嘧啶酮、有鲜清甜香的苯乙醛、植醇，具有果香和酒香香气的癸酸乙酯，具有柑橘和柠檬似香气的萜品烯等。发酵后醇类物质的相对含量大大增加，主要表现为植醇的增加，而植醇是具有芳香气味的物质。此外，酸类物质含量大大降低，酸在口腔中呈味作用主要表现在贡献H+使人感觉到酸味觉，并同时有酸刺激感觉。作为在口腔中食用的口含烟，酸含量的下降会提高其食用的舒适感，降低刺激性。其他种类如酮类、醛类、酯类、烯烃类等的变化不大。
表1 发酵前后烟草挥发性物质比较
Table 1 Comparison of volatile substances in tobacco before and after fermentation
2.2 发酵烟叶纳豆激酶活力测定
自然发酵烟叶和菌株GUHP-86发酵烟叶的提取液在纤维蛋白平板的水解效果见图1。由图1可见，自然发酵的烟叶没有水解圈，只有发酵烟草样品提取液颜色扩散所产生的颜色圈，而经菌株GUHP-86发酵的烟叶出现了水解圈，说明菌株GUHP-86在烟叶发酵过程中可以产纳豆激酶，由紫外法测得纳豆激酶活力为（10.53±0.21）FU/g。纳豆激酶（nattokinase，NK）是一种蛋白激酶，具有溶解血栓，降低血黏度等作用[24]。烟叶发酵后纳豆激酶的产生无疑可以提高口含烟的食用价值。口含烟发酵后产纳豆激酶，国内外还未见报道。
图1 自然发酵烟叶（a）、菌株GUHP-86发酵烟叶（b）的提取液在纤维蛋白平板上的水解效果
Fig.1 Hydrolysis effect of extracts from naturally fermented tobacco leaves (a) and GUHP-86 fermented tobacco leaves (b) on fibrin plate
2.3 菌株GUHP-86发酵烟叶中蛋白酶活力测定
自然发酵烟叶酶提取液（a）和菌株GUHP-86发酵烟叶酶提取液（b）在酪蛋白琼脂培养基上水解效果见图2。由图2可见，自然发酵的烟叶水解圈较小，而经菌株GUHP-86发酵的烟叶出现了明显的水解圈并且较未发酵烟叶水解圈更大，说明菌株GUHP-86在烟叶发酵过程中可以产蛋白酶。蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，可以促进烟叶中蛋白质的水解和进一步形成烟草致香物质，从而提高烟草品质[25]。同时蛋白酶也有助于人体消化。由福林-酚试剂法测得菌株GUHP-86发酵烟叶中蛋白酶酶活为54.45 U/g。
图2 自然发酵烟叶（a）、菌株GUHP-86发酵烟叶（b）的酶提取液在酪蛋白平板上的水解效果
Fig.2 Hydrolysis effect of enzyme extracts from naturally fermented tobacco leaves (a) and strain GUHP-86 fermented tobacco leaves (b) on casein plate
2.4 菌株GUHP-86降亚硝酸盐性能测定
烟草中特有的亚硝胺（tabacco-specific nitrosamines，TSNA）是烟叶中重要的有害成分。TSNA 的形成普遍认为是由烟草中的生物碱和亚硝酸盐反应形成的，因此亚硝酸盐是生成TSNA的前体物之一，降低烟叶中亚硝酸盐含量有助于降低TSNA含量，提高口含烟的食用安全性。菌株GUHP-86属于芽孢杆菌属，国内外大量研究表明，芽孢杆菌对亚硝酸盐及硝酸盐有很好的去除效果[26-27]。
由图3可以看出，经菌株GUHP-86处理的烟叶（a）发酵21 d后，亚硝酸盐含量下降了73%；而自然发酵烟叶（b）中亚硝酸盐含量仅下降了18%，降亚硝酸盐性能差异显著（P＜0.05），说明解淀粉芽孢杆菌GUHP-86具有良好的降解亚硝酸盐作用，其机理可能是发酵过程中GUHP-86产生了亚硝酸盐还原酶将亚硝酸盐降解和被生物利用。自然发酵烟叶在发酵过程中亚硝酸盐也下降了18%（P＜0.05），其原可能因为烟叶表面本身含有一定微生物，对亚硝酸盐本身也有一定的降解作用，但降解率较GUHP-86弱很多。
图3 烟叶发酵过程中亚硝酸盐含量变化曲线
Fig.3 Change curve of nitrite content during the tobacco leaves fermentation
a：加GUHP-86发酵烟叶；b：自然发酵烟叶。
3 结论
将解淀粉芽孢杆菌GUHP-86用于口含烟烟叶原料的发酵，GC-MS检测发现发酵消除了烟叶中一些成分但又新增一些成分，其中醇含量大大提高，酸含量显著下降。此外，发酵后烟草原料中的纳豆激酶、蛋白酶含量得到提升，而亚硝酸盐含量降低了73%。说明将解淀粉芽孢杆菌GUHP-86用于口含烟烟草原料发酵能一定程度地提高其口含烟产品的食用舒适性和食用安全性。尤其是口含烟发酵后产纳豆激酶，国内外目前未见报道，富含纳豆激酶的口含烟可显著提高口含烟的功能价值。
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