酵素是通过益生菌发酵一种或多种新鲜蔬菜、水果、菌菇、中草药等而成的一种功能性液体或固体，因富含酶、维生素、微量元素、氨基酸和多酚等营养物质，受到国内外研究者的重视，具有极大的发展潜力[1]。近年来，水果酵素的制备与抗氧化活性研究逐渐成为热点，水果酵素具有较强的抗氧化能力，对人体内的自由基有清除作用[2]。林冰等[3]利用自然发酵的方式制备刺梨酵素，并研究发现，发酵过程中刺梨酵素有较好的抗氧化活性；张巧等[4]采用自然发酵的方式制备大果山楂酵素，并研究发现，在发酵至15～25 d时，大果山楂酵素抗氧化能力最强；李世燕等[5]以毛酸浆为原料，采用不同发酵工艺制备酵素，并对酵素发酵过程中的抗氧化活性进行研究发现，不同发酵工艺制得毛酸浆酵素均有较强的抗氧化性。
树莓（Rubus idaeus）及石榴（Punica granatum）富含多酚类化合物，具有较强的抗氧化能力[6]。嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）具有减轻乳糖不耐受症、预防胃炎和感染性腹泻等作用[7]。干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）具有降低胆固醇的作用[8-9]。
因此，本实验以树莓和石榴复合果汁为原料，采用自然发酵、单一添加嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、单一添加干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）及同时添加嗜热链球菌和干酪乳杆菌发酵四种方式制备酵素，并对其发酵过程中的pH值、总酚含量、总黄酮含量、羟自由基（·OH）清除能力、超氧离子自由基（O2-·）清除率及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力进行测定，以期确定合适的制备工艺，为树莓、石榴等水果的加工开发提供理论依据，提高树莓、石榴的附加值并利于当地农产品加工发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
树莓：贵州贵山红农业发展有限公司；石榴：贵州水城县南亚生态农业发展有限公司。
1.1.2 菌株
嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，ST）、干酪乳杆菌亚种（Lactobacillus casei，LC）：中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.1.3 试剂
DPPH（分析纯）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；福林酚（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；MRS培养基：上海博微生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
UV5500型紫外-可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；HH-4D数显恒温水浴锅：常州澳华仪器有限公司；SHZF-4263台式气浴全温振荡培养箱：成都瑞昌仪器制造有限公司；JB-CJ-2FXS洁净工作台：无锡优派科技有限公司；GR60DA立式自动压力蒸汽灭菌器：致徽（厦门）仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌种的活化与扩培
挑取适量的嗜热链球菌冻干粉、干酪乳杆菌冻干粉分别接种至5 mL MRS液体培养基中，37 ℃、180 r/min条件下培养24 h，按接种量2%（V/V）分别接种至100 mL MRS液体培养基中，37 ℃、180 r/min条件下培养36～48 h，待用。
1.3.2 树莓-石榴复合果汁的制备
参考程勇杰等[10]的方法稍作修改：用无菌水洗涤生果，然后用体积分数95%乙醇进行表面消毒，再用无菌水冲洗。将树莓、石榴与无菌水按质量比0.5∶0.5∶1.0混合，粉碎成浆液，装至1 000 mL锥形瓶中，在37 ℃、180 r/min条件下振荡3 h。四层纱布过滤浆液得到澄清的树莓-石榴复合果汁，用无菌水稀释2倍后分装至250 mL锥形瓶各100 mL。
1.3.3 树莓-石榴复合果汁酵素的制备
参考李豆[11]的方法稍作修改：向树莓-石榴复合果汁中分别加入1%嗜热链球菌，1%干酪乳杆菌，0.5%嗜热链球菌和0.5%干酪乳杆菌，37 ℃、180 r/min条件下培养96 h。每12 h取样，4 500 r/min离心10 min，取上清液。以自然发酵制备的树莓-石榴复合果汁酵素为对照，测定不同发酵方式制备的树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中pH值、总酚含量、总黄酮含量及抗氧化活性的变化。
1.3.4 测定方法
pH值：采用pH计进行测定。
总酚含量：参照文献[12]的方法。以没食子酸质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，建立没食子酸标准曲线。根据没食子酸标准曲线的回归方程，对总酚含量进行计算。
总黄酮含量：参照文献[13]的方法。以芦丁质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，建立芦丁标准曲线。根据芦丁标准曲线的回归方程，对总黄酮含量进行计算。
羟自由基清除率：参照文献[14]的方法测定树莓-石榴复合果汁酵素对羟自由基的清除能力。
DPPH自由基清除率：参考文献[15]的方法测定树莓-石榴复合果汁酵素对DPPH自由基的清除能力。
超氧阴离子自由基清除率：参考文献[16-17]的方法并稍作修改。向1 mL样品中加入3 mL Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.2），混匀，加入0.2 mL邻苯三酚（2.5 mmol/L），混匀，反应4 min，再加入10 mol/L HCl 2滴终止反应，采用紫外分光光度计测定波长320 nm处的吸光度值（A）。邻苯三酚（2.5 mmol/L）自氧化4 min，测定波长320 nm处的吸光度值（A0）。以Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.2）作为空白对照，重复3次试验。计算超氧阴离子清除率，其计算公式如下：
1.3.5 数据分析
采用OriginPro9.0软件绘图，每组实验重复3次，使用SPSS25.0软件进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中pH值的变化
不同发酵方式制备的树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中pH值的变化见图1。
图1 树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中pH值的变化
Fig.1 Change of pH during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme
由图1可知，4种发酵方式制备的树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中pH值的变化趋势一致，在发酵0～12 h时，pH值上升；发酵12～24 h时，pH急速下降；发酵24～60 h时，pH值缓慢下降。发酵12 h后pH值不断降低，主要是因为随着糖的消耗，发酵液中有机酸的不断生成使pH值降低，其次在微生物生长和代谢过程中利用果汁中的糖类产生大量CO2，一部分CO2溶于发酵液中也有可能导致pH值降低；同时生成的CO2使得瓶内充满气泡，导致pH值有波动。当发酵96 h后，pH值趋于稳定，分析原因可能是由于pH值过低会影响微生物的生长，最终pH值降至3.52。结果表明，较低的pH值利于发酵进行。
2.2 树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中总酚含量的变化
以没食子酸的质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，建立没食子酸标准曲线，结果见图2。由图2可知，没食子酸标准曲线的线性回归方程为y=47.757x-0.015 2，相关系数R2=0.999 1，说明线性关系良好，可用于总酚含量的测定。
图2 没食子酸标准曲线
Fig.2 Standard curve of gallic acid
不同发酵方式制备的树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中总酚含量的变化见图3。
图3 树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中总酚含量的变化
Fig.3 Change of total phenols contents during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme
由图3可知，树莓-石榴复合果汁酵素在发酵过程中，随着发酵时间的延长，总酚含量先增加后降低。除自然发酵外，其他3种发酵方式发酵72 h时，总酚含量均达到最大，其中混菌发酵方式的总酚含量最高，为0.57 mg/mL，因此，混菌发酵方式最好。总酚含量呈先增加后降低的原因可能是在发酵前期，微生物将大分子酚类物质转变成小分子酚类[18]，也可能由于发酵微生物对多酚复合物的酶促降解[19]，导致总酚含量增加。发酵过程中微生物可能代谢产生CO2和水，使发酵液浓度降低，从而使后期总酚含量下降[20]。
2.3 树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中总黄酮含量的变化
以芦丁质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，建立芦丁标准曲线，结果见图4。由图4可知，芦丁标准曲线的线性回归方程为y=1.314 9x+0.028 3，相关系数R2=0.999 1，线性关系良好，可用于总黄酮含量的测定。
图4 芦丁标准曲线
Fig.4 Standard curve of rutin
不同发酵方式制备的树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中总黄酮含量的变化见图5。
图5 树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中总黄酮含量的变化
Fig.5 Change of the total flavonoids contents during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme
由图5可知，4种发酵方式制备的树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中总黄酮含量的变化趋势一致，均呈现先升高后下降的趋势。采用混菌和干酪乳杆菌发酵60 h时，总黄酮含量达到最高，分别为0.41 mg/g、0.36 mg/g。采用嗜热链球菌和自然发酵72 h时，总黄酮含量达到最高，分别为0.33 mg/g、0.27 mg/g。结果表明，混菌发酵方式最好。发酵过程中总黄酮含量的增加可能是微生物产生的某种酶类使黄酮苷水解成黄酮苷元导致总黄酮含量增加。后期由于pH值的不断降低，黄酮苷元的溶解度逐渐减小最终从溶液中析出，导致黄酮类化合物含量降低。也有可能是因为发酵时间过长后，黄酮本身被水解所致[21]。
2.4 树莓-石榴复合果汁酵素抗氧化活性研究
2.4.1 树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中羟自由基清除率的变化
不同发酵方式制备的树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中羟自由基清除率的变化见图6。
图6 树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中羟基自由基清除率的变化
Fig.6 Change of hydroxyl radical scavenging rate during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme
由图6可知，除自然发酵方式外，其余3种发酵方式酵素的羟自由基清除能力随着发酵时间的延长，呈上升下降交替变化的波动趋势。采用混菌和干酪乳杆菌发酵72 h时，羟自由基清除率达到最大，分别为67.1%、48.5%，而采用嗜热链球菌发酵60 h时，羟自由基清除率达到最大，为41.9%。有研究表明，微生物在代谢过程中会产生一些胞外清除自由基的活性物质（如胞外多糖等）能提高羟基自由基的清除率[22-23]。发酵后期羟基自由基清除率降低可能原因是温度较高影响发酵液的稳定性所致。结果表明，混菌发酵方式最好。
2.4.2 树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中DPPH自由基清除率的变化
不同发酵方式制备的树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中DPPH自由基清除率的变化见图7。
由图7可知，采用嗜热链球菌与混菌发酵时，DPPH自由基清除率先增加后降低，60 h时达到最高，分别为79%、94%；采用干酪乳杆菌发酵0～60 h时，随着发酵时间的延长，DPPH自由基清除率呈上升趋势，但略有波动，在60 h时达到最高（69%）后迅速下降，后趋于平稳；自然发酵过程中，DPPH自由基清除率缓慢上升后趋于平稳。有研究表明，乳杆菌能使黄酮转化为游离的黄酮苷元，而游离态的苷元抗氧化能力更强，这有可能是DPPH自由基清除率提高的原因之一[24-25]。
图7 发酵过程中DPPH自由基清除率的变化
Fig.7 Change of DPPH radical scavenging rate during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme
2.4.3 树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中超氧阴离子清除活性的变化
不同发酵方式制备的树莓-石榴复合果汁酵素发酵过程中超氧阴离子清除率的变化见图8。
图8 发酵过程中超氧阴离子自由基清除率的变化
Fig.8 Changes of superoxide anion radical scavenging rate during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme
由图8可知，随着发酵时间的延长，4种发酵方式制备的树莓-石榴复合果汁酵素的超氧阴离子自由基清除率均呈先升高后缓慢降低的趋势，且采用混菌方式发酵72 h时，超氧阴离子自由基清除率最高为54%，表明混菌发酵方式最好。
3 结论
与单一嗜热链球菌发酵、单一干酪乳杆菌发酵、自然发酵相比，嗜热链球菌和干酪乳杆菌混菌发酵方式最优，能增加树莓-石榴复合果汁酵素中总酚含量、总黄酮含量，提高抗氧化能力。混菌发酵72 h时，总酚含量（0.57 mg/mL）、·OH清除率（67%）及O2-·清除率（54%）最高；发酵60 h时，总黄酮含量（0.41 mg/g）及DPPH自由基清除率（94%）最高；发酵过程中，pH值最低，且变化最小，利于发酵的进行。
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