几丁质（Chitin）又称甲壳质、甲壳素，是由N-乙酰-D-葡萄糖胺（GlcNAc）以β-1,4糖苷键连接而成的天然高分子多糖，广泛存在于无脊椎动物的外骨骼，其含量仅次于纤维素[1-2]。由于几丁质中存在牢固的氢键使其性质相对稳定，不溶于水和大部分有机溶剂，难以应用。壳聚糖（chitosan）是几丁质通过脱除乙酰基后的产物，具有更好的溶解性和生物相容性，在食品、医药、轻工、印染、环保和农业等领域具有很大的开发和应用潜力[3-4]。目前，壳聚糖的生产主要采用化学方法，此法易造成环境污染问题。酶法生产壳聚糖绿色环保，且反应条件温和，能耗值相对较低，并可获得脱乙酰程度均一稳定的产品。因此，运用几丁质脱乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）生产壳聚糖成为研究热点[5]。
目前，真菌、细菌、昆虫、病毒和原生动物都有产CDA的报道。其中报道最多的是卷枝毛霉（Mucor circinelloides）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）及菜豆炭疽病菌（Colletotrichum lindemuthianum）等真菌CDA[6]。真菌CDA存在产酶活力低、难以催化晶体几丁质和催化温度较高的问题。细菌产CDA的报道较少，且报道的细菌多产几丁质寡糖脱乙酰酶（chitin oligosaccharide deacetylases，COD），只能水解寡聚几丁质脱乙酰基。海洋微生物丰富多样，可分泌催化性质独特的新颖酶类。本研究从海洋样品中筛选产CDA细菌，对菌株进行鉴定和培养条件优化研究，提高发酵产酶水平，为壳聚糖的酶法制备奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品来源
海泥样品：采集于海州湾海域，置于含冰袋泡沫箱立即带回实验室进行菌株筛选。
1.1.2 试剂及培养基
几丁质：江苏澳新生物工程有限公司；其他生化试剂：上海博微生物科技有限公司；细菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）快速提取试剂盒：杭州宝赛生物科技有限公司；引物合成：南京思普金生物公司。
富集培养基：壳聚糖0.25%，K2HPO40.07%，KH2PO40.03%，MgSO40.05%，NaCl 0.01%，蒸馏水配制，pH 7.2～7.5。
产几丁质脱乙酰酶筛选培养基：粉末几丁质0.2%，K2HPO40.07%，KH2PO40.03%，MgSO40.05%，对硝基-N-乙酰苯胺0.02%，琼脂2.0%，陈海水配制，pH 7.0。
LB纯化培养基：蛋白胨1.0%，NaCl 1.0%，酵母粉0.5%，琼脂2.0%，陈海水配制，pH 7.0～8.0。
种子培养基：蛋白胨1.0%，酵母粉0.5%，陈海水配制，pH 7.0。
发酵培养基：蛋白胨1.0%，葡萄糖1.0%，MgSO40.05%，陈海水配制，pH 7.0。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-1D单人单面超净工作台：苏州净化设备有限公司；JXN-26 高速冷冻离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；Q5000微量紫外分光光度计：上海在途生物科技有限公司；Mastercycler nexus聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：德国Eppendorf有限公司；Nikon 90i全电动显微镜：上海普赫光电科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 产几丁质脱乙酰酶菌株的筛选
称取1 g样品于50 mL富集培养基，30 ℃、180 r/min培养3 d。取1 mL富集后的样液梯度稀释至10-6，选择10-4、10-5、10-6浓度的稀释液0.2 mL涂布于产几丁质脱乙酰酶筛选平板，30℃倒置培养2～7d，观察菌落生长及变色圈产生情况。挑选产生黄色变色圈的菌株接种至LB培养基纯化至单菌落后，斜面保藏。菌株接种至种子培养基培养24 h，再以1%（V/V）接种量接种至发酵培养基，30 ℃、180 r/min培养48 h。发酵液4 ℃、12 000×g离心10 min后测定几丁质脱乙酰酶酶活。
1.3.2 菌株MCDA3-3的鉴定
选取变色圈最大的菌株，命名为MCDA3-3，根据伯杰氏细菌鉴定手册对菌株MCDA3-3进行形态观察和生理生化鉴定[7]。
1.3.3 菌株MCDA3-3的16S rDNA扩增及分析
用细菌DNA快速提取试剂盒提取MCDA3-3的基因组，进行16S rDNA扩增。PCR的通用引物：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1 492R：5'-GGTTACCTTGT TACGACTT-3'。反应体系为50 μL：Premix 25 μL，ddH2O 22 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃终延伸5 min。PCR扩增产物送至南京思普金公司测序，所得序列提交GenBank。将该序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，用MEGA 7.0软件进行16S rDNA序列的比对分析，并构建系统发育树。
1.3.4 培养基成分对菌株MCDA3-3发酵产酶的影响
发酵条件：以1%接种量将种子液接种到发酵培养基中，发酵培养基初始pH 7.0、装液量为50 mL/250 mL，在30 ℃、180r/min条件下培养72h，进行几丁质脱乙酰酶的酶活测定。
碳源的确定：分别添加1.0%的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、豌豆淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉。
氮源的确定：分别添加1.0%的蛋白胨、尿素、牛肉膏、豆粕、玉米浆（干粉）、米糠、花生粕、麸皮、NH4NO3、NH4Cl、（NH4）2SO4。
无机盐的确定：分别添加0.05%的MgSO4、CuSO4、CaCl2、NaH2PO4、KH2PO4、MnSO4、ZnSO4、BaCl2、FeCl3。
初始pH值的确定：改变培养基初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。
1.3.5 发酵条件对菌株MCDA3-3产酶的影响
基本条件：以1%接种量将种子液接种到发酵培养基中，发酵培养基初始pH 7.0、装液量为50 mL/250 mL，在30 ℃、180 r/min条件下培养72 h，根据以下方法设置培养条件，并进行几丁质脱乙酰酶的酶活测定。发酵温度15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃；发酵时间24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h；接种量0.5%、1%、2%、3%、4%、5%；转速100r/min、120r/min、140r/min、160r/min、180r/min、200r/min。
1.3.6 响应面法优化菌株MCDA3-3产酶条件
根据单因素结果，选择对发酵产酶影响最显著的木薯淀粉、FeCl3·6H2O及初始pH值3个因素为变量，酶活大小为响应值，运用Design Expert 11设计3因素3水平共17个试验点的Box-Behnken响应面分析试验。根据响应面分析的结果，配制最佳培养基做验证试验。
1.3.7 几丁质脱乙酰酶酶活力的测定
试管中加入30 ℃预保温的0.05 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液3mL，200mol/L的对硝基乙酰苯胺水溶液1 mL，酶液1 mL，于30 ℃水浴反应15 min，沸水浴终止酶促反应，8 000×g离心10 min，测定上清液的吸光度值。以添加1 mL同样浓度沸水浴灭活15 min的酶液作为对照。酶活单位（U）定义：在上述反应条件下每小时产生1 μg对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个酶活力单位。相对酶活（%）定义：以组内最高酶活为1，其他酶活与最高酶活的百分比即为相对酶活。
1.3.8 数据处理与分析
每组试验设3组平行，重复试验3次，试验结果用平均值±标准方差（n=3）表示，采用Origin 2018作图，响应面采用Design Expert 11进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 产几丁质脱乙酰酶菌株的筛选
将富集培养的土样涂布于产几丁质脱乙酰酶的筛选培养基，挑取产黄色变色圈明显的菌株共5株，变色圈最大的菌株为MCDA3-3。挑取单菌落至种子培养基，以1%接种量接种至发酵培养基30 ℃、180 r/min培养72 h后，4 ℃、12 000×g离心10 min，测定发酵上清中几丁质脱乙酰酶的酶活为1.74 U/mL。
2.2 菌株MCDA3-3的鉴定
2.2.1 菌株MCDA3-3的形态学特征
菌株MCDA3-3的形态学观察见图1。由图1可知，菌株MCDA3-3为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢。在LB培养基上25 ℃生长3 d，菌落呈圆形，灰褐色半透明，表面湿润，边缘规则，无晕环，中央突起，直径0.1～0.5 mm，易挑取。
图2 菌株MCDA3-3的形态观察结果
Fig.2 Morphological observation results of strain MCDA3-3
注：a：菌株MCDA3-3革兰氏染色结果；b：菌株MCDA3-3菌落形态。
2.2.2 菌株MCDA3-3的生理生化特征
菌株MCDA3-3部分生理生化试验结果见表1。结果表明，明胶液化试验、H2O2试验、反硝化、果糖试验均呈阳性，吲哚试验、三梨醇、甘露醇、麦芽糖、蔗糖、柠檬酸盐试验均为阴性。
表1 菌株MCDA3-3的生理生化试验结果
Table 1 Physiological and biochemical tests results of strain MCDA3-3
注：“+”表示反应呈阳性；“-”表示反应呈阴性。
2.2.3 菌株MCDA3-3的16S rDNA扩增及分析
将PCR产物送至南京思普金公司测序，所得1 335 bp序列提交GenBank（登录号：MH988743）。将该序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，发现与菌株Nitratireductor aquimarinus（登录号：HQ176466.1）16S rDNA相似性最高，达到100%。用MEGA 7.0软件进行16S rDNA序列的比对分析，并构建系统发育树，菌株MCDA3-3与Nitratireductor aquimarinus亲缘关系最近（见图2），因此将菌株MCDA3-3鉴定为海洋硝酸盐还原菌（Nitratireductor aquimarinus）。
图2 基于16S rDNA序列菌株MCDA3-3的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of strain MCDA3-3 based on 16S rDNA sequence
2.3 培养基成分对菌株MCDA3-3产酶的影响
2.3.1 碳源对菌株MCDA3-3产酶的影响
碳源对菌株MCDA3-3产酶的影响如图3所示。碳源为木薯淀粉时相对酶活最高，最高酶活为2.85 U/mL，麦芽糖和葡萄糖的相对酶活也达到75%以上，而豌豆淀粉和玉米淀粉相对酶活较低，因此碳源确定为木薯淀粉。
图3 碳源对菌株MCDA3-3产酶的影响
Fig.3 Effect of carbon source on enzyme production by strain MCDA3-3
2.3.2 氮源对菌株MCDA3-3产酶的影响
氮源对菌株MCDA3-3产酶的影响如图4所示。氮源为豆粕和玉米浆时相对酶活都达到90%以上，其中豆粕最高，最高酶活为2.57 U/mL，而麸皮和米糠的相对酶活仅为30%左右，考虑到豆粕的成本高，因此氮源确定为玉米浆。
图4 氮源对菌株MCDA3-3发酵产酶的影响
Fig.4 Effect of nitrogen source on enzyme production by strain MCDA3-3
2.3.3 无机盐对菌株MCDA3-3产酶的影响
无机盐对菌株MCDA3-3产酶的影响如图5所示，无机盐为FeCl3时相对酶活最高，最高酶活为2.07 U/mL，其次是BaCl2、KH2PO4，而CuSO4、ZnSO4、CaCl2、MnSO4的相对酶活都低于30%，因此无机盐确定为FeCl3·6H2O。
图5 无机盐对菌株MCDA3-3发酵产酶的影响
Fig.5 Effect of inorganic salts on enzyme production by strain MCDA3-3
2.3.4 培养基初始pH值对菌株MCDA3-3产酶的影响
图6 培养基初始pH值对菌株MCDA3-3产酶的影响
Fig.6 Effect of initial pH of medium on enzyme production by strain MCDA3-3
培养基初始pH对菌株MCDA3-3产酶的影响如图6所示，随着初始pH增大，相对酶活先上升后下降，pH较高时会使酶蛋白变性失活，pH 6.0相对酶活最高，最高酶活为2.74 U/mL，初始pH在5.0～9.0之间相对酶活都较高，达到60%以上，因此培养基初始pH确定为6.0。
2.4 发酵条件对菌株MCDA3-3产酶的影响
2.4.1 发酵时间对菌株MCDA3-3产酶的影响
发酵时间对菌株MCDA3-3产酶的影响如图7所示，随着发酵时间延长，培养基中的营养物质逐渐被消耗，相对酶活先上升后下降，在48 h时相对酶活最高，最高酶活为2.35 U/mL，因此发酵时间确定为48 h。
图7 发酵时间对菌株MCDA3-3产酶的影响
Fig.7 Effect of fermentation time on enzyme production by strain MCDA3-3
2.4.2 发酵温度对菌株MCDA3-3产酶的影响
发酵温度对菌株MCDA3-3产酶的影响如图8所示，随着发酵温度的升高，相对酶活先上升后下降，温度高时会使酶蛋白变性失活，30 ℃达到最大值，最高酶活为2.76 U/mL，温度在15～40 ℃之间相对酶活都较高，达到60%以上，因此发酵温度确定为30 ℃。
图8 发酵温度对菌株MCDA3-3产酶的影响
Fig.8 Effects of fermentation temperature on enzyme production by strain MCDA3-3
2.4.3 接种量对菌株MCDA3-3产酶的影响
接种量对菌株MCDA3-3产酶的影响如图9所示，随着接种量的增加，相对酶活先上升后下降，接种量高菌株生长迅速，营养物质消耗也随之加快，接种量为4%时相对酶活最高，最高酶活为2.64 U/mL，因此接种量确定为4%。
图9 接种量对菌株MCDA3-3产酶的影响
Fig.9 Effect of inoculum on enzyme production by strain MCDA3-3
2.4.4 转速对菌株MCDA3-3产酶的影响
转速对菌株MCDA3-3产酶的影响如图10所示，随着转速增加，相对酶活先上升后下降，转速高菌株生长迅速，培养基营养物质消耗也加快，转速为180 r/min时相对酶活最高，最高酶活为2.92 U/mL，因此转速确定为180 r/min。
图10 转速对菌株MCDA3-3产酶的影响
Fig.10 Effect of rotating speed on enzyme production by strain MCDA3-3
2.5 响应面法优化菌株MCDA3-3产CDA的发酵条件
在单因素试验的基础上，选择碳源（木薯淀粉）、无机盐（FeCl3·6H2O）、初始pH值3个因素为变量，以酶活大小为响应值，运用Design Expert 11设计3因素3水平共17个试验点的Box-Behnken响应面分析试验（表2）。对试验数据进行回归分析，得二次多项式方程：
由表3可知，从F值的大小可以得到，一次项中各因素对几丁质脱乙酰酶酶活的影响顺序是A＞C＞B。对几丁质脱乙酰酶酶活的方差分析可得模型P＜0.01，表明该方程模型极显著，不同处理间的差异性极显著；失拟项P＞0.05，表明模型失拟项不显著；模型的R2为0.965 4，说明该模型能解释96.54%响应值的变化，因而该模型拟合程度良好，试验误差小，可以用于预测最优发酵条件参数。
表2 Box-Behnken试验设计及结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken tests
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“-”为对结果影响不显著（P＞0.05）；“*”为对结果影响显著（P＜0.05）；“**”为对结果影响极显著（P＜0.01）。
根据响应面三维图结果（图11）显示，响应面开口朝下，响应值随各自变量的值先增加后减少，说明此模型有突出稳定点，且稳定点是该模型的最大值。具体体现：初始pH值固定为6.0时，当FeCl3·6H2O添加量在0.043%～0.053%，木薯淀粉添加量在0.96%～1.11%区间内酶活显示最大值；FeCl3·6H2O添加量为0.05%时，当木薯淀粉添加量在0.96%～1.12%之间，初始pH在5.56～6.11之间，酶活力显示最大值；木薯淀粉添加量为1%时，当FeCl3·6H2O添加量在0.040 1%～0.053 5%之间，初始pH在5.55～6.10之间，酶活显示最大值。
图11 木薯淀粉、FeCl3·6H2O添加量与初始pH值交互作用对几丁质脱乙酰酶酶活影响的响应曲面与等高线
Fig.11 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between cassava starch,FeCl3·6H2O addition and initial pH on chitin deacetylase activity
利用响应面法对发酵工艺条件进行优化，得到最佳培养基组合为：木薯淀粉1.07%、FeCl3·6H2O 0.044 6%、初始pH值5.72，发酵产酶活预测值为4.23 U/mL。为了保证试验的方便可行，将试验条件修正为木薯淀粉添加量1.1%、FeCl3·6H2O添加量0.045%、初始pH 5.7进行验证试验，结果显示，CDA酶活为4.07 U/mL，表明CDA的酶活与理论值非常接近，相对误差＜5%，说明该方程拟合度很好，可以用来预测实际结果。
因此，菌株MCDA3-3产CDA的最佳培养基配方为木薯淀粉1.1%、玉米浆1.0%、FeCl3·6H2O 0.045%、陈海水配制，初始pH 5.7。最佳培养条件为：接种量4%、温度30 ℃、180 r/min发酵48 h。通过优化，CDA酶活增加到4.07 U/mL，是优化前的2.3倍。
3 讨论
目前，壳聚糖的生产主要采用化学方法。通过提高碱的浓度、反应温度和延长反应时间可以提高壳聚糖的脱乙酰度。杨俊玲[8]用45%的NaOH溶液与甲壳素混合，在85 ℃水浴锅中加热3 h后水洗至中性，获得的壳聚糖脱乙酰度为84.1%。NEMTSEV S V等[9]以蜂蜜为原料制备甲壳素，将甲壳素置于50%的NaOH溶液中水浴制得产率为16%～25%的壳聚糖。传统的化学法提取壳聚糖存在很多的缺陷：使用了大量的酸碱，消耗能源的同时，环境污染严重[10]；壳聚糖的后续纯化过程复杂，增加了生产成本；造成壳聚糖分子量及乙酰化程度的降低，从而影响壳聚糖产品品质。为了解决化学酸碱法带来的问题，酶法生产壳聚糖作为一种新型绿色环保的脱乙酰方法，是利用专一性酶对几丁质进行脱乙酰基处理，反应条件温和，能耗值相对较低，可获得脱乙酰程度均一稳定的产品[11]。
SURESH P V等[12]从泥土中分离出产CDA的青霉轮枝菌和尖孢镰刀菌。HAMER S N等[13]研究了菜豆刺盘孢属菌不同底物固态发酵生产CDA。王瑶等[14]从海边红树林虾场土壤中筛选的一株产CDA的放线菌桔橙小单孢菌（Micromonospora aurantiaca）。目前CDA产生菌以丝状真菌居多，有被孢霉属[15]、根霉属[16]、帚霉属[17]等。产CDA的细菌相对较少，有微小杆菌属[18]和红球菌属[19-20]。
4 结论
从连云港市海州湾海域筛选获得了一株产几丁质脱乙酰酶细菌MCDA3-3，鉴定为海洋硝酸盐还原菌（Nitratireductor aquimarinus）。优化获得了该菌产CDA最适发酵培养基配方为木薯淀粉1.1%，玉米浆1.0%，FeCl3·6H2O 0.045%，陈海水配制，pH 5.7；最适发酵条件为接种量4%、30 ℃、180 r/min发酵48h。在此条件下培养，菌株酶活达到4.07U/mL，是优化前的2.3倍。
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