脂肪酶（lipase EC3.1.1.3）是一类能催化甘油酯水解的酶的总称，催化效率高，副产物少，反应条件温和，不需要辅酶或辅因子的参与，已在合成反应、生物燃料、制药工业以及洗涤剂、食品、纺织等领域得到广泛应用。脂肪酶不仅能催化甘油酯类水解与合成，还能催化酯化反应、酯交换反应、醇解反应，促进多肽、表面活性剂和药物等的合成反应[1]。微生物脂肪酶的研究始于20世纪初，经过100多年的研究，目前已经成为脂肪酶的主要来源。特别是近几十年来，随着高效筛选技术和先进基因工程技术的应用，已经实现了曲霉、毛霉和假单胞菌的相对高产，并且部分菌株已经实现工业化应用[2]。我国高质量的脂肪酶产生菌种类少，产量低，很多企业不得不依赖价格昂贵的进口脂肪酶，因此筛选和培育高产优势脂肪酶产生菌显得尤为重要[3]。另外，脂肪酶催化的反应类型和条件多种多样，不同类型的脂肪酶应用方向千差万别，因此筛选不同来源的脂肪酶是脂肪酶研究的基础。
微生物脂肪酶的表达主要受环境因子的调节，产脂肪酶微生物需要以油脂和脂肪酸作为碳源生长，因此常用的微生物筛选来源包括油脂加工厂、乳制品工厂以及附近被油脂污染的土壤和水域等[2]。芽孢杆菌是一类潜在的优良脂肪酶生产菌株，目前用于生产脂肪酶的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌[4]、蜡状芽孢杆菌[5]、类芽孢杆菌[6]和地衣芽孢杆菌[7]等。枯草芽孢杆菌所生产的脂肪酶属于胞外酶，便于下游分离纯化，适用于大规模工业化生产[8-9]，并且普遍具有较高的碱耐受力[10-11]，在洗涤剂和纺织等领域市场需求巨大。本研究从油脂污染水样中分离出一株产脂肪酶菌株，对其进行形态学特征、生理生化试验及分子生物学鉴定，并通过单因素试验和响应面试验对其发酵培养基组分进行优化，旨在提高脂肪酶产量，进一步对其酶学性质研究提供技术参考和实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
从曲阜市多个食堂和食品厂附近被油脂污染的下水道中采集样品10份。
1.1.2 化学试剂
葡萄糖、酵母膏、磷酸氢二钠、硫酸铵、氯化钠、三水磷酸氢二钾、七水硫酸镁、琼脂粉、蛋白胨、橄榄油、罗丹明B、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）：国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基[12-14]
富集培养基：酵母膏0.2 g/L，氯化钠0.5 g/L，磷酸氢二钠3.5 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，橄榄油10 mL，用蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。
初筛罗丹明B培养基[14]：硫酸铵0.5 g，氯化钠4 g，磷酸氢二钾1 g，七水硫酸镁0.5 g，琼脂粉15 g，三丁酸甘油脂乳化液100 mL（4%PVA∶三丁酸甘油脂=3∶1，超声乳化），用蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min后，待温度降至60 ℃时加入1 mL罗丹明B 溶液（质量浓度＜10 mg/mL），混匀后倒平板。
初始发酵培养基：葡萄糖5.0 g/L，蛋白陈2 g/L，尿素6.0 g/L，三水磷酸氢二钾1.0 g/L，硫酸铵1 g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，三丁酸甘油脂10.0 mL，用蒸馏水定容至1 000 mL，自然pH，115 ℃灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-1D超净工作台：苏州净化设备有限公司；SIGMA 2-16PK通用型离心机：德国Sigma公司；TS-1102立式摇床：上海天呈试验仪器制造有限公司；CL-32L高压蒸汽灭菌锅：日本ALP公司；上海申安医疗器械厂；T100型PCR仪、Mini-SubCell核酸电泳仪：美国BioRad公司；CX23生物显微镜：日本奥林巴斯有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株的筛选
将采集的样品分别依次进行富集培养、初筛和初始发酵复筛。样品经过3次富集培养后，分别取50 μL菌液上清涂布于罗丹明B培养基平板，罗丹明B能与脂肪酶降解油脂产生的脂肪酸特异性结合，产酶菌落周围会生成玫红色，在波长365 nm紫外灯下呈现橙黄色。将罗丹明B平板放在波长365 nm紫外灯下进行观察，选取橙黄色圈较大的菌株进行分离培养，镜检至无杂菌后作为出发菌种，接种于初始发酵培养基中进行复筛，选出脂肪酶高产菌株[15-17]。
1.3.2 菌种鉴定
根据《常见细菌系统鉴定手册》[18]，对所筛选的菌株进行形态学特征和生理生化鉴定。提取目的菌株的基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）为模板，以16S rDNA序列的通用引物进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。扩增产物送至上海博尚生物科技有限公司进行测序，并将得到的序列与GenBank数据库中的序列进行比对分析，使用MEGA-X软件构建系统发育树[19]。
1.3.3 产脂肪酶菌株的种子液的制备及发酵培养
种子液的制备：将1.3.1筛选得到的菌种于无菌条件下，接种一环菌至装液量为50 mL/250 mL的初始发酵培养基中，35 ℃、220 r/min，摇瓶培养12 h，制备成种子液。将种子液按照10%（V/V）装液量接种至为25 mL/250 mL的发酵培养培养基中，发酵液pH=7，35 ℃、220 r/min条件下摇瓶培养40 h。
1.3.4 发酵培养基组分优化
单因素试验：设计单因素试验考察发酵培养基中三丁酸甘油酯添加量（1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%）、葡萄糖添加量（4 g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L、9 g/L、10 g/L）及尿素添加量（6 g/L、8 g/L、10 g/L、12 g/L、14 g/L、16 g/L、18 g/L）对发酵液中粗脂肪酶活性的影响，确定各因素的中心值及水平。
响应面试验：根据响应面分析法中Box-Behnken Design（BBD）试验设计原理，采用上述单因素试验确定的中心值、低水平和高水平（分别用0、-1、+1表示），以脂肪酶活力（Y）为响应值，对发酵培养基中三丁酸甘油酯添加量（A）、葡萄糖添加量（B）、尿素添加量（C）进行优化，得到最佳发酵条件组合，试验因素与水平见表1。
表1 发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surfer experiments for fermentation conditions optimization
1.3.5 发酵液中脂肪酶活力的检测
粗酶液的制备：将发酵液低温离心去除菌体，4 ℃、5 500 r/min条件下离心15 min，除菌体。上清用0.22 μm滤膜过滤，制成粗酶液于4 ℃保存备用。
脂肪酶活力检测：参考国标GB/T 23535—2009《脂肪酶制剂》[20]。脂肪酶活力定义：在pH7.5，40 ℃条件下，每分钟产生1 μmol可滴定脂肪酸所需的酶量为1个酶活力单位（U/mL）。
2 结果与分析
2.1 目的菌株的筛选
经过初筛和富集培养，从10份样品中筛选分离得到4株橙黄色圈较大的菌株，分别编号为U1、U2、U4、U5，再分别进行摇瓶发酵培养，测定各发酵液中产脂肪酶的活力值，结果见表2。由表2可知，菌株U5脂肪酶酶活最高，为3.3 U/mL，其余3株菌脂肪酶酶活较低，均在1.3～2.9 U/mL范围内。因此，选择菌株U5作进一步鉴定。
2.2 菌株U5的鉴定
2.2.1 菌株U5形态学特征
菌株U5的菌落及细胞形态见图1。由图1A可知，在琼脂平板上，菌落乳白色，边缘不规则，不透明，菌落表面粗糙，略有突起。由图1B可知，菌体呈圆杆状，无荚膜，有鞭毛。
图1 菌株U5的菌落（A）及细胞（B）形态
Fig.1 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of strain U5
2.2.2 生理生化鉴定
菌株U5能利用甘露醇、柠檬酸盐、葡萄糖，接触酶试验、硝酸盐还原、V-P试验、7%氯化钠生长均为阳性。根据菌株U5的形态特征和生理生化特性，可以初步鉴定菌株为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。
2.2.3 分子生物学鉴定
以菌株U5基因组DNA为模板，采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果发现扩增条带约1 500 bp，测序结果见图2。
图2 菌株U5 16S rDNA测序结果
Fig.2 Sequencing results of 16S rDNA of strain U5
由图2可知，扩增片段长1 406 bp，符合细菌16S rDNA序列特征。将扩增序列结果同美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）中的Genbank核酸数据库进行基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比对分析，用MEGA-X构建系统发育树，结果见图3。
图3 菌株U5 16S rDNA序列系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of strain U5 based on 16S rDNA sequence
由图3可知，菌株U5与Bacillus subtilis strain IAM10（MH815091.1）位于同一族群，亲缘关系最近，再结合形态学观察和生理生化试验结果，进一步证实菌株U5为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
2.3 发酵培养基组分的优化
2.3.1 单因素试验结果
分别对发酵组分中三丁酸甘油酯（1.2%～2.4%）、葡萄糖（4～10 g/L）、尿素（6～18 g/L）的添加量进行单因素试验设计，结果如图4所示。
由图4a可知，随着三丁酸甘油酯添加量的增加，脂肪酶活力呈现先升后降的趋势，当三丁酸甘油酯添加量为1.8%时，脂肪酶活力最高，达到4.0 U/mL，故将1.8%作为响应面设计中三丁酸甘油酯含量的中心点，中心点左、右两侧等距离的因变量1.6%和2.0%作为低水平和高水平。
由图4b可知，随着葡萄糖添加量的增加，脂肪酶活力整体呈现先上升后略微下降的趋势，当葡萄糖添加量为8 g/L时，脂肪酶活力达到最高；葡萄糖添加量＞8 g/L后略有下降，故葡萄糖含量的中心点设为8 g/L，低水平和高水平分别为7 g/L和9 g/L。
由图4c可知，随着尿素添加量的增加，脂肪酶活力呈现先上升后下降的趋势，当尿素添加量为10 g/L时，脂肪酶活力达到最高，为3.7 U/mL；尿素添加量＞10 g/L脂肪酶活力显著下降，故将10 g/L作为响应面设计中尿素含量的中心点，中心点左、右两侧等距离的因变量8 g/L和12 g/L作为低水平和高水平。
图4 三丁酸甘油（a）、葡萄糖（b）及尿素（c）添加量对脂肪酶活力的影响
Fig.4 Effects of tributyrin (a),glucose (b) and urea (c) addition on lipase activity
2.3.2 Box-Behnken Design试验结果
根据单因素确定的中心点和因素水平，运用DesignExpert 8.0.5b中BBD试验设计原理进行3因素3水平的响应面试验设计，试验设计方案和结果见表3，方差分析见表4。对表3中进行多元回归拟合，建立二阶回归模型，找到最优响应因子水平，多元二次回归方程如下所示：
表3 Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments
由模型的回归结果分析和方程方差分析可知，该二次模型显著（P=0.000 9＜0.05），失拟项不显著（P=0.495 7＞0.05），决定系数R2=0.950 1，说明有95.01%的变差能够由该模型解释；变异系数为2.21%，说明变异（偏离）程度较小。由图5可知，各因素间有一定的交互作用，最佳预测点在试验考查范围内。因此，该二阶归模型具有良好的拟合度，能真实地描述各因素与响应值之间的关系，可对菌株U5发酵产脂肪酶条件进行预测和分析。一次项A、B，交互项AC，二次项B2对结果影响极显著（P＜0.01）。
表4 响应面试验回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of response surface experiments
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
由回归方程预测得到三丁酸甘油脂添加量为2.00%，葡萄糖添加量为8.84 g/L，尿素添加量为8.00 g/L，发酵获得粗脂肪酶活力预测值为4.36 U/mL。为方便实际培养基配制，选取三丁酸甘油脂添加量为2%，葡萄糖添加量为9 g/L，尿素添加量为8 g/L。在此优化培养基条件下，发酵获得粗脂肪酶活力实际值为4.30 U/mL，与预测值基本接近，说明所建模型拟合良好且可靠。因此通过响应面优化后得到的最佳发酵培养基配方为三丁酸甘油脂2%，葡萄糖9 g/L，尿素8 g/L，蛋白陈2 g，K2HPO4·3H2O 1.0 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L；发酵条件为接种量10%，初始pH值=7，温度35 ℃，转速220 r/min，摇瓶培养40 h。
图5 三丁酸甘油脂、葡萄糖及尿素添加量对发酵产脂肪酶活力影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction of between tributyrin,glucose and urea addition on lipase activity
2.4 模型验证及分析
为检验模型可靠性和有效性，分别用模型预测的最优培养基配方和原始培养基配方进行摇瓶发酵，每组试验设置3个平行，检测不同取样时间时的脂肪酶活力，结果见图6。由图6可知，脂肪酶活力最高为4.3 U/mL，比未优化前的活力3.7 U/mL提高16.22%。模型的预测值与实际发酵结果十分接近说明模型预测性良好。
图6 培养基组分优化前后脂肪酶活力的变化
Fig.6 Changes of lipase activity before and after culture medium optimization
3 结论
研究从富油水样中筛选出一株脂肪酶产生菌株U5，经形态观察、生理生化试验及16SrDNA序列分析鉴定其为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），利用单因素及响应面试验优化，得到菌株U5发酵产脂肪酶的培养基中最佳配方为三丁酸甘油2%，葡萄糖9 g/L，尿素8 g/L，在此培养基组分下所产脂肪酶活力为4.3 U/mL，比未优化前的酶活力提高16.22%，研究可继续对U5芽孢杆菌发酵产脂肪酶的菌种进行工程化改造、发酵过程控制优化、发酵罐放大试验等方面做进一步探索，逐步提高芽孢杆菌U5产脂肪酶的能力和活力。
[1]NATHALIA S R,BRUNA B P,MAÍSA P P,et al.Biotechnological potential of lipases from Pseudomonas:Sources,properties and applications[J].Process Biochem,2018,75:99-120.
[2]智倩，王彪，薛永常.微生物脂肪酶的研究进展[J].安徽农业科学，2013，41（4）：1453-1455.
[3]恽丽红.Burkholderia mana SYBC LI-1 产脂肪酶发酵条件优化及酶学性质研究[D].无锡：江南大学，2008.
[4]WESTERS L,WESTERS H,QUAX W J. Bacillus subtilis as cell factory for pharmaceutical proteins:a biotechnological approach to optimize the host organism[J].Biochim Biophys Acta,2004,1694(1-3):299-310.
[5]袁蕊，王学江，李峰.一株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件优化[J].化学与生物工程，2019，36（7）：35-38.
[6]DARTOIS V,BAULARD A,SCHANCK K,et al.Cloning,nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of a lipase gene from Bacillus subtilis 168[J].Biochim Biophys Acta,1992,1131(3):253-260.
[7]韩雪，童攀.一株产脂肪酶蜡状芽孢杆菌的分离鉴定[J].江汉大学学报（自然科学版），2017，45（1）：68-71.
[8]GAO J X,OU X Y,XU P,et al.Cloning,overexpression,and characterization of a novel organic solvent-tolerant lipase from Paenibacillus pasadenensis CS0611[J].Chinese J Catalys,2018,39(5):937-945.
[9]吴程雨，叶飘，杨孝婷.固定化地衣芽孢杆菌胞外脂肪酶的制备[J].浙江理工大学学报（自然科学版），2015，33（5）：694-697.
[10]SCHALLMEY M,SINGH A,WARD O P.Developments in the use of Bacillus species for industrial production[J].Canad J Microbiol,2004,50(1):1-17.
[11]VAN POUDEROYEN G,EGGERT T,JAEGER KE,et al.The crystal structure of Bacillus subtilis lipase:a minimal α/β hydrolase fold enzyme[J].J Molecul Biol,2001,309(1):215-226.
[12]宋萍，戚小灵，胡燚，等.响应面法优化枯草芽孢杆菌产脂肪酶的合成培养基[J].中国生物工程杂志，2010，30（8）：100-105.
[13]BADOEI-DALFARD A,KARAMI Z.Screening and isolation of an organic solvent tolerant-protease from Bacillus sp.JER02:Activity optimization by response surface methodology[J].J Mol Catal B,2013,89:15-23.
[14]JETTE J F,ZIOMEK E.Determination of lipase activity by a rhodaminetriglyceride-agarose assay[J].Anal Biochem,1994,219(2):256-260.
[15]杨军方.产脂肪酶细菌的筛选和脂肪酶性质研究[D].南京：南京理工大学，2004.
[16]施巧琴.碱性脂肪酶的研究I——菌株的分离和筛选[J].微生物学报，1981，8（3）：108-110.
[17]谢清，王瑶，陈尚武，等.高产脂肪酶菌株的筛选鉴定[J].中国农业大学学报，2018，23（5）：86-92.
[18]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：253-298.
[19]SAM BROOK J,FRITSCH E F,MANIATIS T,et al.Molecular cloning:a laboratory manual 2nd[J].Quart Rev Biol,1989,49(1):411.
[20]刘延波，邢星月，赵志军，等.高产脂肪酶菌株的筛选鉴定及产酶条件优化[J].中国酿造，2019，38（7）：54-59.