泡菜是我国的传统发酵食品，因其口感独特、营养丰富而深受消费者喜爱[1]。但大量研究证实，泡菜在发酵过程中会积累亚硝酸盐，进而可形成亚硝胺，被认为与癌症有关[2-4]。国外有研究表明，人体如果摄入大量的硝酸盐也会在体内转化成亚硝酸盐[5-6]，因此硝酸盐和亚硝酸盐的降解对泡菜的生产同样重要。
国内外关于泡菜中亚硝酸盐降解的方法很多，如物理法、化学法和生物法[7-10]。但很多方法都有局限性，对泡菜的风味也有一定影响。目前已有关于有机酸能降解亚硝酸盐的报道[11-12]，但仅对比了不同有机酸对亚硝酸盐的降解能力，未做进一步研究。而采用向泡菜中添加有机酸，达到清除亚硝酸盐目的同时保证其风味的研究未见报道。柠檬酸是泡菜发酵的重要产物，具有较强的降解亚硝酸盐能力，酸味爽快可口，能为泡菜提供较好的口感。若将其运用到泡菜中，可能发挥更大的作用。
为探究有机酸对泡菜的影响，本试验以新鲜豇豆为原料，并添加不同浓度的柠檬酸制作泡菜。研究柠檬酸对泡菜中硝酸盐、亚硝酸盐、氨基酸态氮及挥发性香气成分的影响，并试图筛选出最佳浓度的柠檬酸，达到既可降低泡菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量的效果，同时利于氨基酸态氮和香气成分形成，以期为泡菜的生产加工提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
豇豆、食盐、柠檬酸（均为食品级）：市售；氢氧化钠、甲醛、邻苯二甲酸氢钾、碳酸氢钠、乙酸锌、亚铁氰化钾、亚硝酸钠、硝酸钠，对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、四硼酸钠（均为分析纯）：重庆川东化工有限公司。
1.2 仪器与设备
PB-10酸度计：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；UV-1000紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；5810台式高速离心机：德国Eppendorf公司；GC-MS-QP2010气相质谱联用（gas chromatography-Mass spectrometry，GC-MS）仪：日本岛津公司；聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取头（50/30 μm）：美国Supelco公司。
1.3 试验方法
1.3.1 泡菜（酸豇豆）腌制方法
豇豆→清洗→切分→装坛→按1∶1加入8%食盐水→用水密封→22 ℃恒温发酵7 d→酸豇豆
1.3.2 分析检测
硝酸盐测定：参照唐志华[13]的方法；亚硝酸盐测定：参照GB5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的分光光度法[14]；氨基酸态氮测定：参照王冉[15]的方法；泡菜挥发性风味成分测定：采用气相色谱-质谱联用法。
顶空固相微萃取（headspacesolid-phasemicro-extraction，HS-SPME）提取泡菜香气成分：取适量泡菜用研钵粉碎至匀浆，称取1.00 g样品放入顶空瓶中，加入3.00 g NaCl，60 ℃水浴平衡30 min后用PDMS萃取头在60 ℃吸附30 min[16-17]。然后将萃取头插入气相色谱进样口中解吸3 min，进行GC-MS分析，其色谱条件如下：
气相色谱条件：DB-5MS色谱柱（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气：氦气（He）；进样口温度为230 ℃，柱箱温度50 ℃，进样时间1 min，溶剂延迟3 min，不分流进样；升温程序：50 ℃，保持4 min，以7 ℃/min升至140 ℃，再以10 ℃/min升至150 ℃，再以5 ℃/min升至180 ℃，保持2 min，最后以10 ℃/min升至230 ℃，保持3 min[18-19]。
质谱条件：离子源为电子电离（electronic ionization，EI）源；离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；接口温度230 ℃；扫描质量范围50～550 m/z[20]。
挥发性成分定性与定量：利用质谱结果定性，通过计算机检索与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）2014提供的标准质谱对照，根据匹配度，并结合已有的文献进行定性分析。并采用面积归一法计算各成分的相对含量。
2 结果与分析
2.1 添加不同浓度柠檬酸对硝酸盐和亚硝酸盐含量的影响
不同的柠檬酸添加量（0、0.30%、0.45%、0.60%、0.75%、0.90%）对发酵过程中泡菜的硝酸盐及亚硝酸盐含量影响结果见图1。由图1A可知，泡菜中硝酸盐含量随着发酵进行不断减少，在发酵前5 d，柠檬酸处理组比未处理组降低速率慢；发酵第7 天，柠檬酸处理组中硝酸盐含量均明显低于未处理组（145.13 mg/kg），但各处理组间差异不显著（P＞0.05）。综上所述，添加柠檬酸能降低泡菜中硝酸盐含量，且添加0.30%柠檬酸使终产品的硝酸盐含量最低。由图1B可知，在整个发酵过程中，柠檬酸各处理组中亚硝酸盐含量均保持在3 mg/kg的低水平，与未处理组相比，未出现“亚硝峰”。原因可能是经柠檬酸处理后，一方面抑制了发酵后期微生物中的硝酸盐还原酶活性，使亚硝酸盐的产生降低；另一方面，柠檬酸使亚硝酸盐降解加快且积累少，最终使其含量一直保持较低水平。不同浓度柠檬酸处理组之间差异性不显著（P＞0.05），但考虑到成本以及对硝酸盐含量影响效果，选用柠檬酸添加量为0.3%较为合适。
图1 不同浓度柠檬酸对泡菜中硝酸盐（A）及亚硝酸盐含量（B）的影响
Fig.1 Effect of different citric acid concentration on nitrate content (A)and nitrite contents (B) in pickle
2.2 添加不同浓度柠檬酸对氨基酸态氮含量的影响
不同柠檬酸添加量（0、0.30%、0.45%、0.60%、0.75%、0.90%）对泡菜中氨基酸态氮含量变化影响结果见图2。由图2可知，随着发酵的进行，各处理组中氨基酸态氮含量均呈先上升再曲折下降的趋势。在发酵初期，所有处理组的氨基酸态氮含量均上升，最高可达到0.82 g/kg，这可能是由于豇豆中的蛋白质被微生物分泌的蛋白酶降解形成多肽、氨基酸[21]；之后随着发酵的进行，氨基酸态氮含量开始下降，且在第7 天时，0.90%处理组中氨基酸态氮含量降至最低，为0.44 g/kg。这可能是由于多肽、氨基酸不断渗透进入到泡菜液中，且有些会被微生物生长繁殖所利用所致。经过7 d发酵后，0.30%柠檬酸处理组与未处理组最为接近，无显著差异（P＜0.05）。因此，0.30%柠檬酸处理组对氨基酸态氮含量无显著影响。
图2 不同浓度柠檬酸对泡菜中氨基酸态氮含量的影响
Fig.2 Effect of different citric acid concentration on amino acid nitrogen contents in pickles
2.3 不同浓度柠檬酸处理对蔬菜发酵过程中挥发性香气成分的影响
由表1可知，经HS-SPME-GC-MS共检出148种物质，酯类30种，醇类31种，醛类26种，酮类11种，挥发性酸类11种，芳香族类13种，烯烃类5种，烷烃类21种，各类物质相对含量变化见图3。由图3可知，添加柠檬酸对泡菜中醇类和烯烃类物质含量影响较大。0.30%柠檬酸处理组使泡菜中醇类物质由44.64%降至28.84%，烯烃类物质由21.20%降至2.70%；而添加柠檬酸使泡菜中酯类物质、醛类物质和芳香族物质相对含量有所提升，其中0.30%柠檬酸处理组中这3类物质较其他处理组均最高，分别为12.54%、20.09%和16.13%。
0.30%柠檬酸处理组发酵7 d后，样品的香气物质种类最多（88种，其中酯类20种，醇类13种，醛类19种，酮类5种，挥发性酸类5种，芳香族类9种，烯烃类3种，烷烃类14种）。醇类物质具有香甜花香味，酮类物质具有甘草气息，含有苯环的芳香族类物具有芳香气味，醛类物质是泡菜特殊风味的重要组成部分，这些物质的存在使泡菜风味协调。且0.30%柠檬酸处理组各类物质相对含量相差小，形成的泡菜风味更好，这可能是该浓度柠檬酸抑制了有害微生物的生长，但未抑制有益微生物的发酵作用，使泡菜发酵环境快速进入理想化状态，从而使泡菜的香气物质组成更丰富，风味更和谐。
表1 各处理组发酵7 d样品香气成分相对含量
Table 1 Relative contents of aroma components of each treatment group after fermentation 7 d
续表
续表
续表
注：“-”表示未检出。
图3 不同处理组发酵7 d各挥发性香气成分变化
Fig.3 Variation of aroma components of each treatment group after fermentation 7 d
3 结论
添加0.30%柠檬酸于泡菜中能最大程度的降解其中的硝酸盐、亚硝酸盐，使其含量分别达到97.86 mg/kg、2.33 mg/kg；且氨基酸态氮含量为0.52 g/kg，与自然发酵泡菜相近。经柠檬酸处理的6组泡菜在发酵7 d后共检测出148种香气成分，且0.30%柠檬酸处理组的香气物质种类最多，为88种，包括酯类20种，醇类13种，醛类19种，酮类5种，挥发性酸类5种，芳香族类9种，烯烃类3种，烷烃类14种，且各类物质含量差异小，使各香气物质组成更协调，泡菜整体风味整体更和谐。因此，选择0.30%柠檬酸添加至泡菜中，既能最大程度的降解硝酸盐和亚硝酸盐，同时对泡菜风味的影响也最小。
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