苦荞麦是国际粮农组织公认的药食兼用粮种，富含蛋白质、脂肪、纤维素、淀粉、维生素和矿物质等多种营养素[1-2]，具有保肝、补肾、造血及增加免疫功能作用，被称为“三降食品”和“21世纪人类的健康食品”[3]。
苦荞中含有蛋白质、脂肪、脂肪酸和氨基酸，营养价值高于小麦、玉米、大米等大宗粮食作物，苦荞不仅含有其他粮食谷物所不具有的黄酮类化合物，而且荞麦中含有丰富的无机盐和维生素，包括钾、镁、铜、硒，维生素B、C、E等[4-6]。
冠突散囊菌（Eurotium cirstatum）属子囊菌纲，曲霉目，曲霉科，散囊菌属的真菌，其形成的子囊孢子附着于茶叶表面，具有明显香味，俗称“金花”[7]。研究表明，冠突散囊菌在生长代谢过程中会分泌多种胞外酶[8]（如纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等），这些酶将纤维素、果胶、多糖等大分子物质转化成小分子物质。其他霉菌进行发酵使物料表面覆盖大量菌丝，而且带有不良霉味，因此本试验拟采用冠突散囊菌固态发酵苦荞，以苦荞总蛋白、苦荞清蛋白、球蛋白、醇蛋白和谷蛋白为考察指标，通过单因素试验和单因素条件优化苦荞固态发酵条件，来提高蛋白含量，为以后开发苦荞相关产品提供有力依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苦荞：长沙市高桥农贸市场；冠突散囊菌（Eurotium cristatum）：从湖南安化白沙溪茶厂的茯砖茶分离；氯化钠、无水乙醇、氢氧化钠、磷酸、盐酸、碳酸钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；考马斯亮蓝-G250、牛血清蛋白、酪氨酸均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
SPX-25085-Ⅱ生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；TP-620A电子天平：湘仪天平仪器设备有限公司；DGG-9070A 电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；XMTD 数显恒温水浴锅：上海浦东物理光学仪器厂；FW135中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；SP-752型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；722N可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；PHS-3C pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 苦荞发酵样品的制备
发酵剂制备：按苦荞∶水料液比为1∶0.5（g∶mL）制作培养基，121 ℃灭菌25 min，接入斜面冠突散囊菌，28 ℃培养4 d，装入无菌纸袋置45 ℃烘箱中烘干，作为冠突散囊菌发酵剂。
苦荞与水按一定比例混匀后，装一定厚度的物料入500 mL三角瓶中，在高压灭菌锅中121 ℃灭菌25 min。冷却后加入1%的冠突散囊菌发酵剂，置一定温度发酵一定时间后，放入烘箱中，45 ℃烘干，粉碎机粉碎后过40目筛，收集筛下物为实验样品，密封保存。
苦荞清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白提取方法参考Osborne法[9]。
1.3.2 不同条件对苦荞蛋白和蛋白酶的影响
发酵时间：将苦荞按照1.3.1处理，苦荞与水料水比按1∶0.6（g∶mL）混匀后，使物料厚度分别为1.0 cm，放在28 ℃培养箱中，分别测定发酵0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d苦荞蛋白含量和蛋白酶活性。
物料厚度：将苦荞按照1.3.1处理，苦荞与水料水比按1∶0.6（g∶mL）混匀后，使物料厚度分别为1.0 cm、1.5 cm、2.0 cm、2.5 cm、3.0 cm，放在28 ℃培养箱中，培养6 d测其蛋白含量和蛋白酶活性。
发酵温度：将苦荞按照1.3.1处理，苦荞与水料水比按1∶0.6（g∶mL）混匀后，使物料厚度分别为1.0 cm，分别放在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃培养箱中，培养6 d测其蛋白含量和蛋白酶活性。
固液比：将苦荞按照1.3.1处理，苦荞与水的料水比分别为1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2（g∶mL），物料厚度为1.0 cm，放在28 ℃培养箱中，培养6 d测其蛋白含量和蛋白酶活性。
1.3.3 发酵对苦荞抗氧化能力的影响
将苦荞按照1.3.1处理，苦荞与水料水比按1∶0.6（g∶mL）混匀后，使物料厚度分别为1.0 cm，放在28 ℃培养箱中，分别测定发酵0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d苦荞的抗氧化能力，探讨发酵对抗氧化能力的影响。
1.3.4 测定方法
蛋白质含量：采用考马斯亮蓝法[10]；苦荞总蛋白提取：总蛋白的提取参考文献[11]；蛋白酶活性：采用Folin-酚试剂法[12]。
发酵苦荞体外抗氧化能力的测定：在试管中加入不同时间发酵的1.0 g苦荞粉，加入一定体积的水，混合均匀，8 000 r/min离心5 min，取上清液作为待测样品。总抗氧化能力、超氧阴离子自由基（O2-·）、羟基自由基（·OH）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH·）清除率的测定：采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。
2 结果与分析
2.1 不同发酵时间对苦荞蛋白及蛋白酶的影响
不同发酵时间对苦荞蛋白及蛋白酶的影响结果见图1和图2。
图1 发酵时间对苦荞中4种蛋白含量的影响
Fig.1 Effect of fermentation time on four kinds of protein contents in tartary buckwheat
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
由图1可知，在发酵期间，随发酵时间的延长，苦荞清清蛋白含量先升高后降低，发酵4 d时清蛋白含量最高为24.12 mg/g，比未发酵时高2.95 mg/g；球蛋白含量先升高后降低，在6 d时含量最高为20.41 mg/g，比未发酵时高3.88 mg/g；醇蛋白含量逐渐增加，在10 d时含量达到5.49 mg/g，比未发酵时高4.21 mg/g；谷蛋白在发酵期间含量没有明显变化（P＞0.05）。
由图2可知，在0～8 d，蛋白酶的活性逐渐在增加，8 d时蛋白酶活性达到最高为32.08 U/g；在0～4 d期间，苦荞总蛋白质含量随着发酵时间的延长不断增加，4 d之后，总蛋白质含量降低，4 d时苦荞蛋白质最高为104.46 mg/g，比未发酵高10.79 mg/g。冠突散囊菌在生长繁殖期间，会分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等酶[13]，这些酶将蛋白质、淀粉、纤维素等大分子物质转化成小分子物质，同时为自身代谢活动提供碳源和能源。前期蛋白酶活性低，而纤维素酶、淀粉酶的活性高，纤维素酶能分解细胞壁，促使内含物溶出，从而增加了可溶性固形物含量[14]，造成发酵过程中蛋白含量变化呈由增加变为减少趋势。
图2 发酵时间对总蛋白含量和蛋白酶活力的影响
Fig.2 Effect of fermentation time on total protein contents and protease activity
2.2 不同物料厚度对苦荞蛋白及蛋白酶的影响
不同物料厚度对苦荞蛋白及蛋白酶的影响结果见图3和图4。
图3 物料厚度对苦荞中4种蛋白含量的影响
Fig.3 Effect of material thickness on four kinds of protein contents in tartary buckwheat
由图3可知，随着物料厚度的增加，苦荞总蛋白含量先减少后增加，物料厚度为1.0 cm时，总蛋白质的含量达到最高为86.69 mg/g；清蛋白含量先减少后增加，清蛋白含量最高为20.09 mg/g；球蛋白含量先增加后减少，物料厚度为2.0 cm时，球蛋白含量最高为22.34 mg/g；醇蛋白含量先增加后减少，物料厚度为2.5 cm时，醇蛋白含量最高为4.36 mg/g；发酵期间谷蛋白的含量没有明显变化（P＞0.05）。
由图4可知，随着物料厚度的增加，蛋白酶的活性在持续的升高，总蛋白质的含量不断的降低，在物料厚度为1.0cm时，蛋白酶的活性最低为24.89 U/g，总蛋白质的含量达到最高为86.69 mg/g；在物料厚度为2.5 cm时，蛋白酶的活性最高为31.57 U/g，总蛋白质的含量最低为66.05 mg/g。由于物料的厚度会对物料的通气性能产生影响，物料厚度过高不利于氧气的扩散[15]，进而影响冠突散囊菌的生长繁殖过程，使其影响了酶活性，影响了蛋白质含量。
图4 物料厚度对总蛋白含量和蛋白酶活力的影响
Fig.4 Effect of material thickness on total protein contents and protease activity
2.3 不同发酵温度对苦荞蛋白及蛋白酶的影响
不同发酵温度对苦荞蛋白及蛋白酶的影响结果见图5和图6。
图5 发酵温度对苦荞中4种蛋白含量的影响
Fig.5 Effect of fermentation temperature on four kinds of protein contents in tartary buckwheat
图6 发酵温度对总蛋白含量和蛋白酶活力的影响
Fig.6 Effect of fermentation temperature on total protein contents and protease activity
由图5可知，随着发酵温度的升高，苦荞总蛋白含量先降低后增加，24 ℃时达到最高为94.10 mg/g；清蛋白的含量先减少后增加，发酵温度为32 ℃时，清蛋白含量最高为22.75 mg/g；球蛋白含量先增加后减少，发酵温度为28 ℃时，球蛋白含量最高为20.77 mg/g；醇蛋白含量先增加后减少，发酵温度为30 ℃时，醇蛋白含量最高为4.73 mg/g；谷蛋白在发酵温度为24～32 ℃之间，含量没有明显变化（P＞0.05）。
由图6可知，在发酵过程中，随着发酵温度的升高，蛋白酶活性先升高后降低，总蛋白含量先降低后升高。24 ℃时蛋白酶活性最低为12.21 U/g，总蛋白含量达到最高为94.10 mg/g；30 ℃时蛋白酶活性最高为31.48 U/g，总蛋白含量最低为76.91 mg/g。发酵温度的高低影响着冠突散囊菌的生长，发酵温度也影响其菌体酶活性，进而影响了蛋白质的含量。温琼英[16]对冠突散囊菌进行温度培养试验，结果表明冠突散囊菌在28 ℃时生长最快。
2.4 不同固液比对苦荞蛋白及蛋白酶的影响
不同固液比对苦荞蛋白及蛋白酶的影响结果见图7和图8。
图7 固液比对苦荞中4种蛋白含量的影响
Fig.7 Effect of solid-liquid ratio on four kinds of protein contents in tartary buckwheat
图8 固液比对总蛋白含量和蛋白酶活力的影响
Fig.8 Effect of solid-liquid ratio on total protein contents and protease activity
由图7可知，随着固液比的增加，苦荞总蛋白含量先降低后增加，固液比为1∶1.2（g∶mL）时，总蛋白含量最高为90.86 mg/g；清蛋白含量先降低后增加，固液比为1∶0.4（g∶mL）时，清蛋白含量最高为20.52 mg/g；球蛋白含量先增加后减少，固液比为1∶0.6（g∶mL）时，球蛋白含量最高为20.41 mg/g；醇蛋白含量先增加后减少，醇蛋白在固液比为1∶0.8（g∶mL）时含量最高为4.34 mg/g；谷蛋白含量随着固液比的变化而没有明显变化（P＞0.05）。
由图8可知，发酵过程中随着固液比的增加，蛋白酶活性先升高后降低，总蛋白含量先降低后升高。在固液比为1∶0.8（g∶mL）时，蛋白酶活性最高为32.17 U/g，总蛋白含量最低为65.33 mg/g；在固液比为1∶1.2（g∶mL）时，蛋白酶活性最低为22.72 U/g，总蛋白含量最高为90.86 mg/g。水分活度是反映存在于物质中微生物新陈代谢的可利用自由水的量度[17]，降低水分活度将会导致微生物生长停滞期的延长，代谢活性的降低，繁殖能力降低，降低了微生物产生酶的活性[18-19]。所以水分含量太低影响冠突散囊菌的生长，进而影响菌产生酶的活性，水分含量太高会使菌吸水膨胀，影响菌的生长。
2.5 发酵对苦荞抗氧化能力的影响[20-21]
2.5.1 发酵苦荞总抗氧化的能力
图9 发酵苦荞的总抗氧化能力
Fig.9 Total antioxidant ability of fermented tartary buckwheat
由图9可知，未发酵苦荞的总抗氧化能力为1.09 mmol/g，发酵6 d的苦荞总抗氧化能力最高为1.25 mmol/g，比未发酵苦荞的总抗氧化能力高14.7%；随着发酵时间的延长，发酵苦荞的总抗氧化能力增强，6 d时达到最大，随后总抗氧化能力逐渐下降。苦荞总抗氧化能力可能与其球蛋白含量有关。
2.5.2 发酵苦荞抑制超氧阴离子的能力
图10 发酵苦荞抑制超氧阴离子自由基的能力
Fig.10 Inhibition of fermented tartary buckwheat on superoxide anion radical
由图10可知，在发酵期间，苦荞发酵产物的抑制超氧阴离子能力高于未发酵的苦荞，未发酵苦荞的抑制超氧阴离子的能力为327.59 U/L，发酵8 d的抑制超氧阴离子的能力最强为956.90 U/L，抑制超氧阴离子的能力是未发酵苦荞的1.92倍。超氧阴离子的抑制能力可能与发酵后苦荞的醇蛋白含量的增加有关。
2.5.3 发酵苦荞抑制羟自由基的能力
图11 发酵苦荞抑制羟自由基的能力
Fig.11 Inhibition of fermented tartary buckwheat on hydroxyl radical
由图11可知，在发酵期间，苦荞发酵产物对羟基自由基的抑制作用高于未发酵的苦荞，未发酵苦荞抑制羟自由基的能力为319.87 U/mL，发酵6 d的苦荞抑制羟自由基的能力为403.28 U/mL，是未发酵苦荞的0.26倍，表明发酵后苦荞对羟基自由的抑制作用增强。在发酵期间，随着发酵时间的延长，苦荞抑制羟自由基能力逐渐升高，6 d时达到最大，随后开始下降。苦荞抑制羟自由基能力可能与球蛋白含量有关。
2.5.4 发酵苦荞DPPH自由基清除能力
图12 发酵苦荞DPPH自由基清除率
Fig.12 DPPH radical scavenging rate of fermented tartary buckwheat
由图12可知，在发酵期间，苦荞发酵产物对DPPH自由基的清除率增大，未发酵苦荞对DPPH自由基清除率为37.5%，发酵4 d的苦荞对DPPH自由基清除率最高为68.4%，比未发酵苦荞高30.9%。随着发酵时间的延长，发酵苦荞对DPPH自由基的清除率逐渐增大，4 d时达到最大，随后发酵苦荞对DPPH自由基的清除率呈下降趋势。苦荞DPPH自由基清除率可能与总蛋白、清蛋白含量有关。
3 结论
通过对发酵条件的4个单因素进行试验探讨苦荞蛋白含量及抗氧化能力的变化得出，苦荞经冠突散囊菌在一定条件下的发酵，清蛋白含量为24.61 mg/g，比未发酵高3.44 mg/g；球蛋白含量为21.31 mg/g，比未发酵高4.78 mg/g；醇蛋白含量为5.83 mg/g，比未发酵高4.55 mg/g；谷蛋白在发酵期间没有明显变化（P＞0.05）。发酵条件对苦荞总蛋白、清蛋白、球蛋白和醇蛋白的含量影响较大，对谷蛋白的含量影响较小。在一定发酵条件下，蛋白酶活性影响着苦荞总蛋白的含量。发酵后的苦荞体外抗氧化能力比未发酵的总抗氧化能力、抑制超氧阴离子能力、抑制羟自由基能力、DPPH自由基清除能力均有不同程度的提升。该研究结果对苦荞的开发具有指导意义。
[1]何嵋，王锐，周云.荞麦研究进展综述[J].现代农业科技，2011（2）：46-47.
[2]GUO X N,YAO H Y.Fractionation and characterization of tartary buckwheat flour proteins[J].Food Chem,2006,98(1):90-94.
[3]左光明.苦荞主要营养功能成分关键利用技术研究[D].贵阳：贵州大学，2009.
[4]谢勇武，曾亚文，谭属琼.粳稻02428 突变体RIL 孕穗期耐冷性状与糙米功能成分的遗传分析[J].种业导刊，2018（12）：31-36.
[5]魏娜，次顿，张唐伟.西藏高原地理与气候因子对青稞功能性成分的影响[J].中国农业科技导报，2018，20（12）：115-121.
[6]ZHU F.Chemical composition and health effects of tartary buckwheat[J].Food Chem,2016,203:231-245.
[7]黄彦，石瑞，苏二正.冠突散囊菌的研究与应用进展[J].生物加工过程，2017（1）：49-56.
[8]刘巧林.液态发酵茶工艺参数及相关酶活性的研究[D].成都：四川农业大学，2007.
[9]冯明珠，何聪芬，赵华，等.燕麦麸蛋白质的Osborne 分类及SDS-PAGE电泳分析[J].食品工业科技，2007（1）：77-79.
[10]柳荫，吴凤智，陈龙，等.考马斯亮蓝法测定核桃水溶性蛋白含量的研究[J].中国酿造，2013，32（12）：131-133.
[11]王晋峰，刘凌，郑玉才，等.植物叶蛋白提取技术及开发利用研究[J].草业科学，2003，20（1）：7-11.
[12]乌显章.酶的工业生产技术[M].吉林：吉林科学技术出版社，1988：35-39.
[13]刘巧林.液态发酵茶工艺参数及相关酶活性的研究[D].成都：四川农业大学，2007.
[14]邓放明.茯砖茶中冠突散囊菌分离培养及其发酵液胞外多糖与应用酶学研究[D].长沙：湖南农业大学，2007.
[15]冯纪网，陈晓旭，黄海龙，等.发酵豆粕的品质控制[J].粮油加工，2014（8）：75-77.
[16]温琼英.茯砖茶中主要微生物的研究[J].茶叶通讯，1986（4）：21-23.
[17]FRIESEL R R.The application of water activity (Aw) measurement to the microbiological attributes testing of raw materials used in the manufacture of non-sterile pharmaceutical products[J].Pharmacopeial Forum,1999,25(6):8974.
[18]MURRLL W G,SCOTT W J.Heat resistance of bacterial spores at various water activities[J].Nature,1957,179(4557):481-482.
[19]FRIESEL R R,CUNDELL T.The application of water activity measurement to the microbiological attributes testing of nonsterile over-the-counter drug products[J].Pharmacopeial Forum,1998,24:6087-6090.
[20]周小理，侍荣华，周一鸣，等.热处理方式对苦荞蛋白功能特性的影响[J].农业工程学报，2018，34（9）：292-298.
[21]左光明，谭斌，秦礼康.苦荞麸皮蛋白的提取分离及清除自由基作用研究[J].食品科学，2008，29（11）：269-273.