生物胺是一类含氮的小分子碱性有机化合物，常见的生物胺有8种，分别为色胺、组胺、苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺和亚精胺[1]。按组成成分可分为单胺和多胺，多胺包括精胺和亚精胺，其余6种为单胺[2]。发酵制品中生物胺的合成途径是在微生物产生的氨基酸脱羧酶的作用下，氨基酸脱羧反应的产物[3]。生物胺是人体的正常成分，适量的生物胺有利于人体的健康，而过量的生物胺则会导致中毒，引起头痛、血压变化、呕吐等一系列严重反应[4]。生物胺在胺氧化酶的作用下氧化成醛，醛进一步氧化生成的羧酸可被生物体利用产能或排泄，而酒精会抑制人体内胺类氧化酶的活性，12%的乙醇会抑制91%的胺氧化酶活性[9]，从而加强生物胺的危害作用[5]，使酒中生物胺安全风险增大，因此对酒类产品中生物胺的限量标准比普通食品更严格。
黄酒发酵多以大罐发酵为主，粳米等原材料经过浸泡、蒸煮冷却后，与酒曲搅拌后呈半固半液状态的开放式落罐发酵[6]，是糖化、乳酸杆菌和酵母菌协同作用的混合发酵[7]。黄酒发酵中浸米浆水中的乳酸杆菌主要来源于环境，以发酵用米的形式带入发酵醪液[8]。在黄酒复杂的生产工艺及其开放的发酵体系中含有丰富的微生物，其中一些微生物能够产生氨基酸脱羧酶，氨基酸在氨基酸脱羧酶的作用下脱羧基转化为生物胺，这也是黄酒发酵过程中生物胺形成的原因[9]。
由于生物胺的形成与微生物紧密相关，而季节对微生物的种类和数量影响很大，因此分析了不同的季节对生物胺的影响，而冬酿黄酒由于温度低，后酵时间长，营养更加丰富，味道更加醇厚，着重分析冬酿黄酒生物胺含量的变化。本研究采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法对浙江绍兴某黄酒厂春酿、秋酿和冬酿黄酒原料（酒母、麦曲）、预发酵（浸米、浸米水）、发酵过程（落缸、前酵和后酵）及后处理阶段（压榨、清酒结束和煎酒）样品中生物胺的消长进行了分析，探讨了黄酒生产过程中生物胺形成和分解的潜在机制，为控制黄酒中生物胺含量奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
春酿、秋酿和冬酿黄酒（产品类型为特型半干黄酒，主要成分为水、乙醇、糖类、蛋白质、有机酸、氨基酸）：浙江绍兴某黄酒厂；麦曲、酿酒酒母：人工固态培养。
1.1.2 化学试剂
色胺、组胺、苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺、亚精胺标准品（纯度均＞98%）、乙腈（色谱纯）、丹磺酰氯（纯度＞99%）：美国Sigma公司；盐酸、三氯乙酸、丙酮、饱和碳酸氢钠、氢氧化钠、谷氨酸钠、氯化钠、无水乙醚（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
LC-20AT高效液相色谱仪：日本岛津有限公司；DK-8B型恒温水浴锅：上海精宏实验设备公司；Sigma 3K30型低温高速离心机：德国Satorious公司；UF/UVPL5124超纯水仪：美国Pall公司。
1.3 实验方法
1.3.1 取样
黄酒发酵工艺流程：
原米→浸米→蒸米（30 min）→落缸（加入酒母）→糖化→发酵→冲缸（加入麦曲）→开耙→灌坛后酵→压榨→生酒→煎酒→灌坛陈酿→成品
采集浙江绍兴某黄酒厂冬酿黄酒生产中原料（酒母、麦曲）、预发酵段（浸米、浸米水）、发酵段（落缸、前酵第2天和后酵第10天）以及后处理阶段（压榨、生酒和煎酒）样品。用三点取样法，分别取样品的底部、中部和上部，用烧杯取样，每个取样点取样量为500 mL，采用冷冻（-20 ℃）方式保存样本。
1.3.2 高效液相色谱法测定生物胺含量
参照国标GB/T 5009.208—2016《食品中生物胺含量的测定》规定的方法，在此基础上对样品预处理方法加以修改，具体如下：
固液混合类样品（浸米、生酒、煎酒）和纯液体类样品（浸米水、落缸、前酵、后酵、压榨），直接取适量样品于离心管中，3 600 r/min离心10 min，取上清液5 mL上样检测。
称取5 g固体类样品（酒母、麦曲），置于100 mL具塞三角瓶中，加入30 mL的5%三氯乙酸溶液，混匀，振荡提取60 min后转移至离心管中，3 600 r/min离心10 min，取上清液倒入50 mL容量瓶中，将沉淀部分重复上述操作，合并两次上清液并用5%三氯乙酸溶液定容后，取5 mL溶液上样检测。
2 结果与分析
2.1 冬酿黄酒原料及发酵过程生物胺的形成及消长规律
2.1.1 原料生物胺变化
黄酒生产的原料包括糯米、麦曲、酒母、糖化酶和水。酒母主要含有酵母菌和乳酸杆菌及其他微生物，负责把米发酵成酒精。麦曲主要原料是小麦和水，采用人工固态培养，麦曲中主要微生物是曲霉、根霉、毛霉，还有微量酵母、青霉和细菌，在黄酒的酿造过程中，它作为菌种、糖化剂和谷物原料一起参与酒醪的复式发酵以及分解、重组[10]。糖化酶在黄酒生产中解决麦曲中酶系和微生物产糖化酶活力不足的问题[11]。测定糯米、自来水、酒母、麦曲和糖化酶生物胺总量和8种生物胺含量，探究黄酒原料阶段样品中生物胺形成及含量变化，测定结果见表1。由表1可知，糯米总生物胺含量为29.39 mg/kg，以腐胺为主，占总生物胺的71.3%，其次是尸胺、精胺、亚精胺，其余4种生物胺均能检出，但含量很低（＜1 mg/kg）。自来水只检测出五种生物胺，含量较低（＜0.5 mg/kg），总生物胺含量为1.06 mg/kg。水中生物体腐烂后，由细菌分解其尸体产生的生物胺，会对水体造成污染[12]，生活用水经过净化处理后生物胺含量较低。酒母中腐胺和色胺含量显著地高于其他生物胺（P＜0.05）；麦曲中色胺含量高于其他七种生物胺。
表1 原料中生物胺含量测定结果
Table 1 Determination results of bioamine content of raw materials mg/kg
注：“ND”表示未检出。下同。
2.1.2 预发酵阶段物料生物胺含量
黄酒预发酵阶段主要指浸米和蒸饭过程。浸米过程中，浆水中微生物数量巨大，发酵产物和自溶产物极其丰富，随配料加入和蒸饭带入发酵醪中，经过发酵、贮存等过程是形成黄酒风味丰富性和复杂性的主要因素之一[13]。测定浆水、浸米和蒸饭生物胺总量和8种生物胺含量，探究黄酒预发酵阶段样品中生物胺形成及含量变化，测定结果见表2。
表2 预发酵阶段物料生物胺含量测定结果
Table 2 Determination results of bioamine content of materials in pre-fermentation stage mg/kg
由表2可知，浸米和浸米水中生物胺含量升高，这是由于浸米水中发酵产物和自溶产物氨基酸极其丰富，为生物胺的形成提供了丰富的前体物质，再加上适宜的生长条件促进了生物胺的形成[8]。浸米和浸米水中主要生物胺为腐胺和酪胺，因为浸米和浸米水中弯曲乳杆菌和植物乳杆菌能够产生酪氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶，以酪氨酸和鸟氨酸为底物分解成腐胺和酪胺[15]。蒸饭中含有较高含量的酪胺（47.08 mg/kg），蒸饭是用于黄酒发酵的直接原料，其高含量的生物胺能够影响最终黄酒的生物胺量。
2.1.3 发酵过程中生物胺含量变化
黄酒酿造发酵段工艺包括落缸、前酵和后酵。物料落缸后便开始糖化和发酵，前酵阶段酵母菌大量繁殖、代谢，温度控制在28～30 ℃；前酵结束后进入后发酵期，后酵期是部分残留的淀粉和糖继续发酵，促进酒成熟、增香和提高风味。冬酿黄酒发酵阶段生物胺总量和各种生物胺含量变化结果见表3。由表3可知，落缸时物料总生物胺含量为34.95 mg/kg，其来源于蒸饭、酒母、麦曲和糖化酶；前酵1 d，总生物胺含量变化不大（36.51 mg/kg），整个前酵期生物胺显著增加，前酵结束时（第3天），总生物胺达到了191.92 mg/kg。前酵期发酵温度较高（30 ℃），这一阶段酵母大量增殖；通过开粑方式鼓入氧气，一些好氧性细菌（葡萄球菌和芽孢杆菌等）大量繁殖，微生物生长代谢旺盛[16]；发酵体系中蛋白酶将蛋白质水解成氨基酸，为生物按合成提供了充足的条件[17]。前酵结束后，发酵醪液从发酵缸转入坛中进行后酵，后酵温度在20 ℃，后酵第1天，发酵物料生物胺含量增加至268.51 mg/kg，后酵第7天，发酵物料生物胺含量达到了402.58 mg/kg，继续发酵生物胺含量开始降低，到发酵结束，物料生物胺降低至234.55 mg/kg。进入后酵期，发酵醪液酒精度（15%vol～17%vol）逐渐增加，发酵液酸度、氧气等环境因素发生了改变，微生物生长特性也发生了改变，对生物胺的形成产生了抑制；同时，发酵醪液中胺氧化酶活性增加，部分生物胺发生了降解。
表3 发酵阶段物料生物胺含量测定结果
Table 3 Determination results of bioamine content of materials in fermentation stage mg/kg
2.1.4 成熟期生物胺含量变化
黄酒成熟期包括压榨、清酒结束和煎酒。冬酿黄酒的压榨、清酒结束和煎酒阶段生物胺总量和各种生物胺含量结果见表4。由表4可知，压榨段生物胺总量比后酵段生物胺含量显著增加（P＜0.05），增加了26.07 mg/L。经过压榨之后，滞留在发酵醪液中的生物胺进入了发酵液中[16]。在清酒结束时，生物胺含量显著降低（P＜0.05），降低了75.32 mg/L。由于清酒时采用硅藻土过滤，硅藻土能够吸附一部分生物胺[18]。而煎酒中生物胺含量又略高于清酒结束，原因是煎酒之后pH降低[17]，黄酒发酵液pH值与生物胺含量呈负相关[19]。由表4可见，在成熟期的3个阶段中，腐胺、酪胺和色胺仍然是主要的生物胺。清酒结束时，三种主要生物胺含量均显著低于压榨阶段（P＜0.05），腐胺降低了54.57 mg/L，酪胺降低了12.87mg/L，色胺降低了1.27mg/L。由于在澄清之前经过了勾兑，勾兑所用酒的生物胺含量低于压榨后发酵液所致。
表4 成熟过程物料中生物胺含量测定结果
Table 4 Determination results of bioamine content of materials in mature stage mg/kg
2.2 春酿黄酒、秋酿黄酒、冬酿黄酒生物胺含量变化
发酵温度和贮藏温度对黄酒中生物胺的形成和积累有显著的影响，温度越高越利于生物胺的积累[16-17]。生产季节不同，温度差异很大。根据前期数据分析，生物胺形成主要是在发酵段和后熟段，因此，从黄酒发酵段（落缸、前酵、后酵）和煎酒对3个季节生产黄酒的总生物胺、腐胺、酪胺和色胺变化进行分析（以每一阶段每种生物胺/该阶段总生物胺表示，%），探讨生产条件对生物胺形成的影响（图1）。
由图1（a）可知，不同生产季节的黄酒落缸、前酵、后酵和煎酒过程中总生物胺含量变化趋势和幅度不同。落缸时物料生物胺主要来源于原米、酒母、麦曲、浸米和蒸米。春酿和秋酿黄酒均采用纯酵母菌为酒母，由于使用的季节不同，秋酿酒母中总生物胺显著高于春酿酒母（P＜0.05）。同一工厂麦曲的生产工艺相同，但是生产季节不同，麦曲生物胺含量也不同，秋酿黄酒生产用麦曲总生物胺含量高于春酿和冬酿。冬酿黄酒在酿造中为了提高发酵力，使用了商业糖化酶，糖化酶中生物胺含量非常高（1 047.29 mg/kg）；在浸米过程中，浆水中微生物数量较多，发酵产物和自溶产物极其丰富，浆水的pH较低（3.7～4.0），主要是乳酸杆菌发酵产酸。乳酸菌具有分泌氨基酸脱羧酶能力，大量的乳酸菌和浆水中丰富的氨基酸底物，有利于浆水中生物胺的形成[17]，冬酿黄酒由于浸米时间长，浆水中生物含量非常高（707.1 mg/kg）。从食品安全考虑，现代的黄酒生产工艺不用浆水回填工艺，而是将浆水弃掉。生物胺为可溶性化合物，主要存在于浸米浆水中，但是在浸米中也有残留，冬酿黄酒浸米时间长（18 d），浸米中生物胺含量非常高（315.45mg/kg）。经过淋洗、蒸煮、淋饭过程，能够去除掉一部分生物胺，但是，仍有一部分生物胺进入发酵阶段。因此，冬酿黄酒落缸时物料总生物胺显著高于秋酿和春酿黄酒。前酵发酵液中的微生物生长旺盛，尤其是霉菌代谢产生糖化酶、淀粉酶和蛋白酶，将原料中的蛋白质、淀粉和糖类转化为微生物可以利用的营养物质，并产生合成生物胺所需的各种氨基酸，导致生物胺的变化[19]。而三个季节酿造的黄酒前酵阶段总生物胺含量差异不显著（P＞0.05）；后酵阶段秋酿黄酒和冬酿黄酒总生物胺含量显著高于春酿黄酒（P＜0.05），而煎酒阶段秋酿黄酒总生物胺含量较后酵显著降低（P＜0.05），春酿黄酒和冬酿黄酒较后酵有所增加。总体来讲，秋酿、冬酿黄酒总生物胺含量明显高于春酿黄酒，原因是秋酿黄酒和冬酿黄酒的后酵温度和湿度更适合产氨基酸脱羧酶微生物的生长，使得生物胺的含量增加[18]。
图1 不同季节生产黄酒发酵过程中生物胺变化
Fig.1 Changes of bioamine in Chinese rice wine produced in different seasons during fermentation process
由图1（b）可知，在整个发酵过程中，春酿黄酒中腐胺占总生物胺43.3%～70.5%；冬酿黄酒中腐胺占总生物胺44.3%～60.6%左右；秋酿黄酒中腐胺占总生物胺的比例较低（7.0%～28.6%）。就绝对含量而言，腐胺含量则是冬酿黄酒最高，显著高于秋酿黄酒和春酿黄酒（P＜0.05），可能原因是冬酿黄酒中有更多的弯曲乳杆菌能够产生鸟氨酸脱羧酶和鸟氨酸，鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶的作用下转化为腐胺，导致腐胺含量显著增加（P＜0.05）。
由图1（c）可知，秋酿黄酒后酵阶段酪胺总生物胺84.7%，显著高于春酿、冬酿黄酒后酵阶段酪胺占总生物胺30.2%、2.2%（P＜0.05）。由于在pH 5.5，40 ℃时，酪氨酸转化为酪胺的效率最高[19]，秋酿黄酒后酵温度为33 ℃，高于春酿黄酒和冬酿黄酒后酵温度，增强了酪氨酸脱羧酶的活性，导致秋酿黄酒酪胺含量显著高于春酿黄酒和冬酿黄酒（P＜0.05）。
由图1（d）可知，在整个发酵过程中，春酿、秋酿、冬酿黄酒中色胺分别占总生物胺17.6%～38.0%、3.0%～29.3%及1.5%～7.56%，其中在煎酒阶段中色胺占总生物胺比例最高。冬酿黄酒中色胺分别占总生物胺最低，可能原因是冬酿黄酒中色氨酸比例相对较低，即色胺的前体物质含量较低，导致冬酿黄酒中色胺比例低于春酿和秋酿黄酒。
综上分析，不同生产季节的黄酒，不但总生物胺含量差异显著，主要生物胺组分含量上差异也较大。冬酿黄酒中生物胺含量最高（210.21 mg/kg），春酿黄酒中生物胺含量最低（28.92 mg/kg）；春酿黄酒中主要生物胺是腐胺和色胺，秋酿黄酒中主要生物胺是酪胺、色胺、腐胺；冬酿黄酒中主要生物胺是腐胺、酪胺、色胺。冬酿和秋酿黄酒中酪胺含量分别为72.11 mg/kg和30.26 mg/kg，以及高含量的腐胺和色胺，具有潜在的食品安全隐患。在黄酒酿造中控制生物胺的形成对保证黄酒产品安全性具有重要的意义。
3 结论
通过高效液相色谱法对春、秋和冬酿黄酒的生产过程的总生物胺及色胺、组胺、苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺、亚精胺8种生物胺含量监测，实验结果显示，冬酿黄酒中，生物胺总量在整个发酵过程中呈现先降低后升高的趋势，其中后酵第7天时生物胺含量最高，为402.6 mg/L。春酿、秋酿和冬酿黄酒前酵阶段生物胺含量差异不明显（P＞0.05），后酵阶段秋酿黄酒和冬酿黄酒生物胺含量显著高于春酿黄酒（P＜0.05），煎酒阶段冬酿黄酒生物胺含量显著高于春酿黄酒和秋酿黄酒（P＜0.05）。综合得知，冬酿和秋酿黄酒中煎酒阶段酪胺含量分别为72.11mg/kg和30.26 mg/kg，以及高含量的腐胺和色胺，具有潜在的食品安全隐患，在黄酒酿造中控制生物胺的形成或者采取有效措施去除生物胺对保证黄酒产品安全性具有重要的意义。
[1]TENBRINK B,DAMINK C,JOOSTEN H M L J,et al.Occurrence and formation of biologically-active amines in foods[J].Int J Food Microbiol,1990,11(1):73-84.
[2]SANTOS M H S.Biogenic amines:Their importance in foods[J].Int J Food Microbiol,1996,29(2-3):213-231.
[3]BENKERROUM H.Biogenic amines in dairy products:origin,incidence,and control means[J].Comp Rev Food Sci F,2016,15(4):801-826.
[4]GOMES M B,PIRES B A,FRACALANZZA S A,et al.The risk of biogenic amines in food[J].Cienc Saude Coletiva,2014,19(4):1123-1134.
[5]GARCÍA-RUIZ A,GONZÁLEZ-ROMPINELLI E M,BARTOLOMÉ B,et al.Potential of wine-associated lactic acid bacteria to degrade biogenic amines[J].Int J Food Microbiol,2011,148(2):115-120.
[6]范雪，张爱良，孙顺远.黄酒发酵过程中物位测量技术的研究与改进[J].现代食品科技，2018，34（8）：219-224.
[7]毛青钟，鲁瑞刚，陈宝良，等.黄酒发酵醪抑制霉菌生长的初步探讨[J].中国酿造，2006，25（9）：56-59.
[8]毛青钟，俞关松.黄酒浸米浆水中优势细菌的不同对发酵的影响[J].酿酒，2010，37（5）：69-73.
[9]汪建国.黄酒中色、香、味、体的构成和来源浅析[J].中国酿造，2004，23（4）：6-10.
[10]MORENO-ARRIBAS V,TORLOIS S,JOYEUX A,et al.Isolation,properties and behaviour of tyramine-producing lactic acid bacteria from wine[J].J Appl Microbiol,2000,88(4):584-593.
[11]刘景，任婧，孙克杰.食品中生物胺的安全性研究进展[J].食品科学，2013，34（5）：322-326.
[12]冯雅蓉，马俪珍.生物胺对食品安全和人类健康的重要性[J].肉类研究，2005，1（1）：25-27.
[13]张凤杰，薛洁，王异静，等.黄酒中生物胺的形成及其影响因素[J].食品发酵与工业，2013，39（2）：62-67.
[14]宋颖，董全.黄酒中生物胺的形成与控制研究进展[J].食品工业科学，2016，37（8）：387-391.
[15]ÖNAL A,TEKKELI S E K,ÖNAL C.A review of the liquid chromatographic methods for the determination of biogenic amines in foods[J].Food Chem,2013,138(1):509-515.
[16]栾同青.黄酒酿造过程生物胺变化规律及其产生菌株研究[D].济南：齐鲁工业大学，2013.
[17]俞剑燊，张凤杰，王德良，等.酿酒工艺对黄酒中生物胺的影响[J].中国酿造，2015，34（4）：123-127.
[18]孟祥平，张普查.食品中生物胺检测方法及控制技术的研究进展[J].食品研究与开发，2014，35（5）：133-136.
[19]RIO B D,REDRUELLO B,LINARES D M,et al.The dietary biogenic amines tyramine and histamine show synergistic toxicity towards intestinal cells in culture[J].Food Chem,2017,218(1):249-255.
[20]赵伟睿，胡升，喻毅，等.透性化酪氨酸脱羧酶工程菌制备酪胺的研究[J].高校化学工程学报，2017，31（6）：1364-1371.