刺梨（Rosa roxburghii Tratt）是蔷薇科多年生落叶丛生灌木植物，其果实在食药保健方面的独特优势备受关注并已被开发利用[1-2]。刺梨果渣是刺梨榨汁后的废弃物，占鲜果的40%～50%，富含原刺梨果的多种营养及药用功能成分[3]，具有很好的利用价值，但目前果渣综合利用率低，浪费严重[4]。采用生物发酵技术对果渣的资源化利用已有研究报道，主要集中在合成营养素[5-6]、提高与改善膳食纤维[7-8]以及食品加工[9-10]、动物饲养[11-12]等方面。
前期研究发现，通过嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）GIM.1.208、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）CICC.22210和生香酵母混合菌种发酵刺梨果渣能够明显改善果渣膳食纤维理化特性，提高其功能活性[13]，该技术处理对果渣资源后续高值化利用及精深加工具有重要意义，但是其发酵后风味变化及香气特征尚缺乏研究，而风味品质是发酵产品的重要属性之一。因此，本研究首先采用定量描述性分析（quantitative descriptive analysis，QDA）法对发酵前后刺梨果渣进行感官评定，然后采用顶空固相微萃取-气质联用（headspace solid-phase microextraction-gas chromatographymass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）法对刺梨果渣混菌发酵前后香气成分进行检测分析，并根据不同香气化合物阈值及相对气味活度值（relative odour activity value，ROAV）确定各香气成分对发酵果渣香气特征的影响，对发酵前后香气化合物的相对含量、种类差异性进行分析，初步明确刺梨发酵果渣香气风格组成与产生变化的原因，为进一步探究发酵刺梨果渣中关键挥发性风味物质以及后续生物发酵资源化应用提供理一定理论依据，为刺梨果渣的高附加值利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
刺梨：品种为贵农5号，采摘于贵州龙里县，充分成熟。
1.1.2 菌种
嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）GIM.1.208、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）CICC.22210：贵州轻化工中心；生香活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。
1.1.3 培养基
MRS培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸钠0.05 g，吐温80 1.0 mL，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·7H2O 0.05 g，碳酸钙20.0 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH，121 ℃、0.1 MPa灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
HP6890/5975C GC/MS联用仪：美国安捷伦公司；SPX-150BⅢ型电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；LS-50HG立式压力蒸汽灭菌锅：江阴滨江医疗设备有限公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；JYZ-E6T型九阳榨汁机：九阳股份有限公司；XMTD-204数显恒温水浴锅：上海梅香仪器有限公司；手动固相微萃取装置：美国Supelco公司；2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex萃取纤维头：美国Supelco公司。
1.3 方法
1.3.1 发酵菌种的培养
酵母菌活化：参照文献[14]并进行改进。在酵母菌中按质量比1∶20加入温水，使其均匀分散，然后加入5%的蔗糖，35～40 ℃条件下活化30 min，备用。
乳酸菌活化[13]：分别将嗜酸乳杆菌GIM.1.208、戊糖乳杆菌CICC.22210接种于MRS培养基中，37 ℃静置培养24～48 h，备用。
1.3.2 混合菌种发酵刺梨果渣
挑选新鲜、无霉烂变质的刺梨，榨汁，出汁率为50%。取刺梨果渣50 g于500 mL三角瓶中，按料液比1∶5（g∶mL）加入蒸馏水，用棉塞塞紧瓶口，煮沸灭菌10 min，待其冷却后按照体积比1∶2∶1接入嗜酸乳杆菌GIM.1.208、戊糖乳杆菌CICC.22210、生香酵母，接种量为10%，菌落总数（106～107 CFU/mL），发酵温度30 ℃，自然pH条件下置于生化培养箱发酵48 h，待测。
1.3.3 刺梨果渣香气成分的检测
采用HS-SPME-GC-MS法检测刺梨果渣的香气成分[15]。
固相微萃取条件：取样品约15 g，置于25 mL固相微萃取仪采样瓶中，插入装有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纤维头的手动进样器，在85 ℃条件下顶空萃取30 min后取出，快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口，250 ℃条件下热解吸3 min，进样。
GC条件：色谱柱为ZB-5MSI弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序为初始温度42 ℃，保留2 min，以4 ℃/min升温至280 ℃，保持2 min；汽化室温度250 ℃；载气为高纯氦气（He）；载气流量1.0 mL/min；不分流进样；溶剂延迟时间1.5 min。
MS条件：离子源为电子电离（electron ionization，EI）源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 425 V；接口温度280 ℃；选择性离子监测扫描模式，扫描质量范围20～450 amu。
定性定量分析：对总离子流图中各峰经质谱计算机数据系统检索、人工解析图谱及与Nist2008和Wiley275质谱库匹配，取匹配度＞80%并参考有关文献进行定性，用峰面积归一化法确定各化学成分的相对含量。
1.3.4 感官评价
采用QDA法[16]，由6位相关专业经验丰富的感官品评员（3名男性和3名女性）对刺梨果渣进行感官评价，获得评价选用的主要感官描述词。品评员被要求在描述词上对刺梨果渣样本按照5点标度法进行打分。0～5分别表示没感觉、弱、稍弱、平均、稍强和强，取所得分值结果的平均值作感官评定雷达图。
1.3.5 相对气味活度值
参照文献[17]中ROAV法评价各挥发性风味化合物对刺梨果渣总体风味的贡献程度，确定关键风味物质。
1.3.6 数据处理
采用Origin2017和Excel2016软件对实验数据处理制图。
2 结果与分析
2.1 刺梨果渣混菌发酵前后感官评价分析
采用QDA法对混菌发酵前后刺梨果渣的风味进行感官评定，结果见图1。
由图1可知，刺梨原果渣及混菌发酵后刺梨果渣的共同主要香型为果香、甜香、酸味、酒精味、涩味和酵母味。刺梨原果渣以果香、酸味、涩味为主；混菌发酵后的刺梨果渣以果香、酸味、酵母味为主。相较于刺梨原果渣，混菌发酵后，刺梨果渣果香、酵母味、酒精味、甜香得分有明显提高，涩味得分降低，初步说明了刺梨果渣经过混菌发酵后产生了发酵特有的酵母味，且刺梨原果渣强烈的酸涩气味得以改善，风味轮廓发生改变。
图1 刺梨果渣混菌发酵前后感官评定雷达图
Fig.1 Radar chart of sensory evaluation of Rosa roxburghii Tratt pomace before and after multi-strain mixed fermentation
2.2 刺梨果渣混菌发酵前后香气成分GC-MS分析
采用HS-SPME-GC-MS技术检测刺梨果渣在混菌发酵前后香气成分的变化，结果见图2、表1及表2。
图2 刺梨果渣混菌发酵前（A）后（B）香气成分GC-MS分析总离子流色谱图
Fig.2 Total ion chromatogram of aroma components of Rosa roxburghii Tratt pomace before (A) and after (B) multi-strain mixed fermentation analyzed by GC-MS
表1 刺梨果渣混菌发酵前后香气成分GC-MS分析结果
Table 1 Results of GC-MS analysis of aroma components of Rosa roxburghii Tratt pomace before and after multistrain mixed fermentation
续表
续表
注：“-”表示未检出。下同。
由表1及表2可知，从刺梨原果渣及混菌发酵后的刺梨原果渣中共同检出107种挥发性香气成分，其中烃类36种、醇类18种、酯类16种、酸类5种、醛类15种、酮类8种、其他类9种。从混菌发酵后的刺梨果渣中检测出80种香气成分，相对含量为92.071%，其中烃类、醇类、酯类、酸类、醛类、酮类及其他类香气成分的相对含量分别为40.959%、14.483%、5.388%、14.404%、2.810%、3.646%、10.381%；从刺梨原果渣中检测出79种香气成分，其中烃类、醇类、酯类、酸类、醛类、酮类及其他类香气成分的相对含量分别为52.398%、7.444%、2.600%、12.563%、8.511%、5.375%、8.031%。
表2 刺梨果渣混菌发酵前后香气成分种类及相对含量
Table 2 Types and relative content of aroma components of Rosa roxburghii Tratt pomace before and after multistrain mixed fermentation
2.3 刺梨果渣混菌发酵前后香气成分变化
2.3.1 烃类香气成分比较
烃类化合物的香气阈值一般较高，除了可延长发酵果渣香气留香时间外，香气直接贡献不大[18-19]。混菌发酵前后刺梨果渣中的烃类化合物数量及相对含量明显高于其他种类化合物，其大部分为萜烯类和烷烃类物质，发酵前刺梨原果渣中的萜烯类物质主要包括β-瑟林烯、石竹烯、α-律草烯、β-罗勒烯、α-愈创烯、δ-杜松烯、α-蒎烯、β-榄香烯、α-荜澄茄油烯、氧化丁香烯等，烷烃类物质主要包括十四烷、十五烷、十六烷、正壬基环己烷、姥鲛烷、植烷等。通过混菌发酵后，刺梨果渣中新检出4-十三烯-6-己炔、甲苯、苯乙烯、α-松萜、十八碳烯、十九烷。
2.3.2 醇类香气成分比较
醇类物质是微生物通过艾利希途径将氨基酸作为底物转氨脱羧再由醇脱氢酶还原而成[16]，此外，酵母也能从糖代谢的碳片段形成醇类[20]。醇类化合物可使果渣香气浓厚丰满，同时也是形成酯类化合物的前驱物质[21]，主要呈现清香和青鲜香气[22]。刺梨原果渣经混菌发酵后，醇类物质相对含量由7.444%上升至14.483%，同时另检出了异戊醇、壬醇、苯乙醇、植物醇。异戊醇与苯乙醇是酵母菌发酵的特有产物[23-24]，除本身具有愉快的风味外，还可作为其他易挥发性风味物质的溶剂[25]，对发酵果渣的风味具有双重影响功能。经过混菌中生香活性干酵母发酵，乙醇相对含量增加，是混菌发酵后果渣产生酒精味的主要原因。
2.3.3 酯类香气成分比较
酯类物质大多具有不同水果香气[26-28]，阈值一般较低，是刺梨果渣整体香气形成的重要组成部分。混菌发酵后，刺梨果渣中共检出10种酯类化合物，包括苯二甲酸丁酯、棕榈酸甲酯、异丁基邻苯二甲酸酯、棕榈酸乙酯、乙酸正十七烷基酯、油酸甲酯、亚油酸乙酯及油酸乙酯；而刺梨原果渣中共检测出8种酯类化合物，分别为乙酸乙酯、碳酸乙酯、（Z）-3-己烯乙酸酯、辛酸甲酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、棕榈酸乙酯及乙酸正十七烷基酯。刺梨果渣经过混菌发酵后，酯类物质种类与相对含量增加，分析原因可能是由于醇类含量的增加提供了充足的前体物质，其次可能是因为混菌中的生香酵母菌发酵具很强的产香能力，尤以产酯香为主的香味物质最多[29]。乙酸乙酯的相对含量最高，赋予了发酵果渣浓郁的水果香气。
2.3.4 酸类香气成分比较
混菌发酵前后的刺梨果渣中均检出辛酸，可以作为酯类物质的前体物质[25]，对果渣风味起到间接作用。但发酵后，辛酸含量降低，可能是由于辛酸与醇类合成酯类，导致含量下降，成为发酵果渣整体涩味减弱的原因之一[30]。混菌发酵后的刺梨果渣中还检出了月桂酸、棕榈酸、壬酸、发酸。
2.3.5 醛、酮及其他类香气成分比较
醛、酮及其他类物质也是贡献刺梨发酵物的特征香气的重要挥发性成分，刺梨果渣在发酵前后均检出3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、壬醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、β-紫罗酮、橙化基丙酮、诺卡酮、2,6二（1,1-二甲基乙基）苯酚、二苄基硫醚、梅西呋喃、α-沉香呋喃、榄香素。醛类物质不稳定，在微生物作用下被还原为醇或被氧化为酸[31]，可能是发酵后刺梨果渣较原果渣对比，醛类相对含量减少，醇类、酸类相对含量增多的原因之一。
2.4 刺梨果渣发酵前后主要香气成分相对气味活度值分析
由于饱和烷烃类物质感觉阈值高，一般不易引起明显嗅感[32]，为了进一步分析发酵刺梨果渣中主要风味组分的特征香气物质，分别对混菌发酵前后的刺梨果渣中烯、醇、酯、酸、醛、酮类中主要香气成分的ROAV进行计算分析，结果见表3。
由表3可知，混菌发酵后的刺梨果渣中（E）-2-癸烯醛相对含量较高，且阈值（0.3 μg/kg）较小，综合呈味分析，其对发酵刺梨果渣的总体风味贡献最大，定义其ROAV=100；发酵前刺梨原果渣定义辛醛的ROAV=100。
混菌发酵后的刺梨果渣中共有8种ROAV≥1的关键风味物质，其贡献度大小为（E）-2-癸烯醛（100）＞3-甲基丁醛（15.32）＞壬醛（14.45）＞乙酸乙酯（9.65）＞α-蒎烯（2.29）＞2-甲基丁醛（1.42）＞苯乙醛（1.05）＞1-辛烯-3-醇（1.04）；（E）-石竹烯、1-戊醇、香叶醇、壬醇、苯乙醇对样品总体风味具有重要修饰作用（0.1≤ROAV＜1）。（E）-2-癸烯醛具有青香、脂香；壬醛具有玫瑰、柑橘等香气；乙酸乙酯具有轻灵的果香，可知发酵后刺梨果渣具有轻灵的复合果香的特征。混菌发酵前的刺梨原果渣中共有8种挥发性物质的ROAV≥1，其贡献度大小为辛醛（100）＞壬醛（31.09）＞3-甲基丁醛（25.36）＞2-甲基丁醛（8.91）＞1-辛烯-3-醇（4.75）＞正己醛（2.73）＞α-蒎烯（2.50）＞（E）-石竹烯（1.28）；1-戊醇、辛醇、香叶醇、乙酸乙酯、苯甲酸乙酯、正丁醛、正戊醛、2-庚酮对原果渣具有重要的修饰作用（0.1≤ROAV＜1）。饱和直链醛通常呈现出令人不愉快的、辛辣的、刺激性涩味[34]；3-甲基丁醛具有麦芽香气[35]；α-蒎烯具有松木及树脂样气息，可知未发酵刺梨果渣具有麦芽香、树脂样以及强烈刺激性涩味的特征。
表3 刺梨果渣混菌发酵前后主要香气成分相对气味活度值
Table 3 Relative odour activity values of main aroma components of Rosa roxburghii Tratt pomace before and after multi-strain mixed fermentation
注：有部分香气成分因无法查询到相应的感觉阈值未做具体分析。
发酵前后刺梨果渣共有5种关键香气物质，分别为3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、壬醛、α-蒎烯、1-辛烯-3-醇，说明经过混菌发酵后的刺梨果渣与原果渣相似的关键风味组分较多，保留了松木树脂样及苹果香等刺梨原果渣的特征性气味。同时发酵后乙酸乙酯的ROAV较高，赋予了比原果渣更加强烈的轻灵果香；经过混菌发酵后，刺梨果渣饱和直链醛辛醛、壬醛的ROAV较低，使刺梨果渣刺激性气味减弱，香气更加柔和，可接受性更强，这和图1感官风味轮廓果香得分增加，刺激性涩味得分降低趋势相一致。
综合分析可知，混菌发酵对刺梨果渣果香饱满、香气柔和、具有原刺梨果渣特征风味起了关键的贡献，因而增加了风味协调性、香气舒适性特征。
3 结论
采用嗜酸乳杆菌GIM.1.208、戊糖乳杆菌CICC.22210和生香酵母混菌发酵刺梨果渣，通过QDA法初步对刺梨果渣发酵前后的风味轮廓进行感官评定。结果表明，果香、酸味、涩味是刺梨原果渣的主要风味，而混菌发酵后的刺梨果渣具有独特的酵母味，果味强度提高，酸涩刺激性气味明显降低。
通过HS-SPME-GC-MS从混菌发酵前后的刺梨果渣中共检出107种挥发性香气成分，其中烃类36种、醇类18种、酯类16种、酸类5种、醛类15种、酮类8种、其他类9种。经混菌发酵后，刺梨果渣的风味轮廓与发酵前明显改变，刺梨果渣中醇类、酯类、酸类相对含量均增加，烃类、醛类、酮类减少。混菌发酵后刺梨果渣中ROAV≥1的关键风味物质有8种，其贡献度大小为（E）-2-癸烯醛＞3-甲基丁醛＞壬醛＞乙酸乙酯＞α-蒎烯＞2-甲基丁醛＞苯乙醛＞1-辛烯-3-醇；原果渣中ROAV≥1的关键风味物质有8种，其贡献度大小为辛醛＞壬醛＞3-甲基丁醛＞2-甲基丁醛＞1-辛烯-3-醇＞正己醛＞α-蒎烯＞（E）-石竹烯。发酵前后刺梨果渣中共有的关键物质有5种，分别为3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、壬醛、α-蒎烯、1-辛烯-3-醇，说明发酵果渣保留了大部分刺梨果渣原本特征香气物质，具有松木树脂样及麦芽香等刺梨原果渣的特征。发酵后乙酸乙酯的ROAV较高，饱和直链醛的ROAV较低，说明发酵后赋予了刺梨果渣更加浓厚的轻灵果香，且原有饱和直链醛产生的刺激性涩味减弱，在保留了刺梨原果渣特征风味的同时获得了更加协调、柔和的风味特征。
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