腐乳是利用大豆制备的一种经微生物发酵的干酪型产品[1]。腐乳按其色泽风味可分为红腐乳、白腐乳、青腐乳和各种花色腐乳[2]，其中毛霉型白腐乳滋味鲜美，风味独特，营养丰富[3]，可佐餐，亦可调味[4]。近年来，科研人员一直不懈地改进腐乳生产工艺，并对腐乳发酵体系中的微生物进行了大量研究。凃婧等[5]研究指出，腐乳发酵是一个复杂的过程，需要多种微生物和酶的协同参与。蒋芳芳等[6]研究指出，腐乳特殊的色、香、味主要是毛霉（Mucor）和其他微生物共同发酵作用的结果。腐乳作为一种典型“生物活性”发酵食品[7]，体系中微生物的多样性对其风味品质形成起着决定性的作用[8]。鲁绯[9]通过在发酵过程中添加乳酸菌，促进了腐乳的成熟，改进了产品风味。杨佐毅等[10]研究了腐乳发酵体系中的细菌短杆菌属（Brevibacterium）和酵母菌（Saccharomycetes），发现细菌菌株均具有较高的内肽酶活力，酵母菌则具有较高的氨肽酶和羧肽酶活力。由此可知，传统白腐乳发酵体系中含有大量的有益微生物，其对白腐乳风味的形成具有重要的贡献。
然而，现代白腐乳生产厂家多采用人工接种纯种毛霉，产品质量相对稳定，但由于采用纯毛霉发酵导致腐乳发酵体系中菌群相对单一[11]，且酶活力不高，进而造成白腐乳产品风味普遍不足，满足不了现代人们的饮食需求。为了解决目前毛霉型白腐乳纯种发酵模式下导致其他有益微生物的缺失从而引起产品风味存在明显不足的问题，本试验尝试利用选择性培养基从市售风味良好的白腐乳中分离风味细菌，并对其进行鉴定；研究其生产特性、耐受性及应用，以期建立一种提升白腐乳风味的方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 白腐乳样品
5种品牌白腐乳商品信息如下：品牌A麻油白腐乳（基本组成为水、黄豆、食用盐、白酒、芝麻油）；品牌B白腐乳（基本组成为水、黄豆、食用盐、食用酒精、芝麻油）；品牌C麻油白腐乳（基本组成为水、黄豆、食用盐、食用酒精、植物油）；品牌D麻油白腐乳（基本组成为水、非转基因大豆、白酒、食用盐、芝麻油）；品牌E白腐乳（基本组成为水、黄豆、食用酒精、食用盐）。
1.1.2 培养基
风味菌富集培养基：白腐乳汁（按照1.1.1节白腐乳，倾倒、过滤后熟45 d的白腐乳样品汁液即可）200 mL，煮沸10 min去除汁中酒精，冷却至常温后，调整白腐乳汁中NaCl含量至（70±0.5）g/L，pH调节至6.5±0.2，121 ℃灭菌15 min，以筛选出能够适应白腐乳发酵体系的风味菌。
风味菌分离培养基：在风味菌富集培养基的基础上添加2%的琼脂粉，121 ℃灭菌15 min。
LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，氯化钠10 g/L，加水1 000 mL，121 ℃灭菌15 min。
1.1.3 化学试剂
硝酸银（分析纯）：天津市银恒化工有限公司；盐酸、氢氧化钠、无水乙醇（均为分析纯）：广州化学试剂厂；琼脂、蛋白胨、酵母抽提物（均为生化试剂）：广东环凯微生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
SHP-250型生化培养箱：广东环凯微生物科技有限公司；BS323S电子天平：德国赛多利斯仪器系统有限公司；BX53F奥林巴斯显微镜：日本奥林巴斯有限公司；2K15冷冻高速离心机：德国西格玛公司；pH计PB-10：德国赛多利斯科学仪器有限公司。759S紫外可见分光光度计：上海棱光技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 白腐乳加工工艺流程及操作要点
豆腐坯→接种→培养→毛坯→搓毛→腌坯→装瓶→封口→后熟→白腐乳
操作要点：市售黄豆室温条件下经水浸泡、磨浆，过筛得豆浆；豆浆经加热后，用酸水作为点浆剂，经蹲脑后，压榨沥水成豆腐，最终含水量控制在75%左右，切成适当的小块制成豆腐坯。豆腐坯接种菌株为毛霉ZG701，保藏编号：GDMCC NO.60183；培养条件为25 ℃，霉菌培养箱静置培养36 h形成毛坯。毛坯经搓毛后，使用25%的无菌盐水常温腌制12 h后装瓶，加入“白汤”（食盐10%，食用酒精10%）封口，进入后熟阶段（60 d），即得白腐乳。
1.3.2 白腐乳的感官评价
召集8位经专业培训鉴评人员对市售白腐乳进行感官评分[12]。感官评价满分10分，白腐乳感官评价标准见表1。
表1 白腐乳感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of white sufu
续表
1.3.3 目的菌株的富集和分离
经过感官鉴评后，挑选感官较佳（感官评分＞9分）的毛霉型发酵白腐乳成品，在无菌条件下将其汤液按照2%（V/V）的接种量接种至风味菌富集培养基中；置于25 ℃恒温培养箱中，静置培养72 h获得风味菌富集菌液。
在无菌条件下，用无菌水将风味菌富集菌液浓度稀释至10-5、10-6、10-7，涂布于风味菌分离培养基上，于25 ℃倒置培养72 h后。挑选单菌落，进行平板划线分离，如此重复4～5次，直至获得纯的单菌落，分离获得1株生长优势菌，编号ZH910。于4 ℃冰箱内保存，备用。
1.3.4 菌株ZH910的菌落、菌体形态的鉴定
将分离获得的生长优势菌株ZH910划线接种于风味菌分离培养基中，25 ℃恒温培养箱中倒置培养48 h，观察菌落形态、色泽、质地。挑取待测菌菌苔进行革兰氏染色，使用10×100油镜，观察菌体形态。
1.3.5 菌株ZH910的分子鉴定及遗传分析
将纯化好的菌株ZH910送交生工生物工程（上海）股份有限公司进行16S 核糖体脱氧核糖核酸（ribosomal deoxyribonucleic acid，16S rDNA）测序。将测序获得的16Sr DNA序列置于美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）中，使用Blast程序进行对比，从GenBank数据库获得与菌株ZH910相似性较高的菌株序列，利用MEGA 4.1软件构建微生物系统进化树。
1.3.6 菌株ZH910生长特性及耐受性
种子液的制备：将菌株ZH910接种（约106 CFU/mL）至LB培养基（100 mL装液量/300 mL）中，于25 ℃条件下静置培养48 h，获得菌株ZH910种子液，含菌量约为108 CFU/mL。
菌株ZH910生长特性：按1%的接种量（约106 CFU/mL）将菌株ZH910种子液接种至装液量为100 mL/300 mL的LB培养基中，分别在pH值自然（6.5）、10～50 ℃的温度范围内（以5 ℃的温度梯度递增）恒温静置培养、初始pH在3～9范围内静置培养48 h后，测定其在波长600 nm处的吸光度值（OD600nm值），评估菌株ZH910生长特性。
菌株ZH910耐受性：调整NaCl（2～20g/100g，以2 g/100 g NaCl的浓度梯度递增）和乙醇的含量（2%vol～8%vol，以2%vol乙醇的浓度梯度递增），按1%的接种量（约106CFU/mL）接种菌株ZH910种子液于LB培养基（100 mL装液量/300 mL三角瓶）中，于最适宜初始pH和温度条件下（具体参数由1.3.5菌株ZH910生长特性决定），恒温静置培养48 h，测定其在波长600 nm处的吸光度值（OD600nm值），评估菌株ZH910对NaCl和乙醇的耐受性。
1.3.7 菌株ZH910在白腐乳生产中的应用
（1）菌株ZH910的扩大培养
采用装液量100 mL/300 mL，将获得的菌株ZH910接种（约106CFU/mL）至风味菌富集培养基中扩培，25 ℃条件下，恒温静置培养48 h，在4 ℃、8 000 r/min 条件下离心10 min，取沉淀，获取菌株ZH910的菌体。
（2）菌株ZH910发酵制作白腐乳
参见1.3.1节白腐乳的生产工艺流程，将获取的菌株ZH910菌体使用“白汤”复溶制备成“含菌白汤”（含菌量约108 CFU/mL）。将“含菌白汤”按照1%（V/V）的比例与“白汤”混合，在装瓶时加入白腐乳发酵体系中，进入后熟阶段。
（3）菌株ZH910发酵效果评价
以不加入“含菌白汤”的白腐乳作为对照，发酵过程中取腐乳块对样品感官、理化指标进行跟踪检测，以评估风味菌株ZH910在白腐乳发酵过程中的应用效果。
1.3.8 理化指标检测
氨基酸态氮含量、NaCl含量的测定均按照中华人民共和国商业行业标准SB/T 10170—2007《腐乳》中的方法进行；总酸含量的测定按照国标GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的方法进行。
2 结果与分析
2.1 市售白腐乳理化指标及感官评价结果
对市售五种品牌白腐乳乳块的理化及感官指标进行检测，结果见表2。由表2可知，市售白腐乳品牌的理化指标一定程度上存在差异，pH值为5.7～6.4；氨基酸态氮含量为0.45～1.06 g/100 g，其含量能够直接反映白腐乳乳块的细腻、润滑程度。白腐乳乳块氨基酸态氮含量越高，口感越细腻[13]。食盐含量为7.0～11.0 g/100 g，在白腐乳发酵体系中的食盐可以起到防腐和调味作用[14]。测定结果显示，5个品牌白腐乳样品均满足SB/T 10170—2007《腐乳》中对于白腐乳的各理化指标含量的要求（氨基酸态氮含量≥0.35g/100g，食盐含量≥6.5 g/100 g）。
表2 白腐乳理化指标及感官评价结果
Table 2 Results of physicochemical indexes and sensory evaluation of white sufu
由表2可知，在香气和滋味评分上，品牌B样品具有毛霉型白腐乳特有香气，腐香浓郁、协调，无不良风味，口感细腻，综合最佳，因此样品B样品感官评分最高，为9.1分。而品牌E样品香气不准确，口感略粗糙，感官评分最低为7.7分。品牌A样品香气不准确，略有异味，口感不协调，感官评分8.0分；品牌C样品香气浓郁度稍弱，口感鲜味不足，略咸，感官评分8.4分；品牌D样品口感过咸，香气偏弱，不明显，感官评分8.3分。综上，选择品牌B样品作为风味菌的筛选来源。
2.2 菌株ZH910的菌落、菌体形态的观察
将品牌B样品汤液在无菌条件下接种至无菌富集培养基中，25 ℃条件下，静置培养72 h后。使用分离培养基对风味菌富集菌液进行划线分离、纯化，最终获得1株具有明显生长优势的菌株ZH910。对菌株ZH910进行菌落、菌体形态观察，结果见图1。由图1A可知，菌株ZH910的菌落突起，呈圆形，直径1～3 mm，灰白色，不透明，湿润光滑；由图1B可知，菌株ZH910 革兰氏染色结果呈阳性（G+），球菌，呈葡萄状排列。
图1 菌株ZH910的菌落形态（A）及细胞特征（B）
Fig.1 Colony morphology (A) and cell characteristics (B) of strain ZH910
2.3 菌株ZH910的分子生物学鉴定
图2 基于16S rDNA序列构建的菌株ZH910系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of strain ZH910 based on 16S rDNA sequences
将菌株ZH910的16SrDNA基因序列导入NCBI，通过Blast程序获得的GenBank数据库中与待测菌株相似度高的菌株均为葡萄球菌属。通过对系统发育树的分析（见图2）得出菌株ZH910与Staphylococcus saprophyticus strain FDAARGOS 355亲缘关系最近，相似度为99.65%。结合菌株ZH910形态学分析结果，因此，菌株ZH910被鉴定为腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）。葡萄球菌在中国传统发酵食品中具有广泛的存在，并发挥着重要作用[15-18]。
2.4 菌株ZH910的生长特性
研究不同温度及初始pH条件下，菌株ZH910在LB液体培养基中的生长情况，结果见图3。
图3 菌株ZH910在不同温度（A）及初始pH（B）条件下的生长情况
Fig.3 Growth situation of strain ZH910 at different temperature (A)and different initial pH (B)
由图3A可知，菌株ZH910在15～40 ℃较宽的温度范围内均可以较好的生长，在25 ℃时，其生长情况最佳；当温度超过40 ℃时，菌株的生长受到明显的抑制。因此，选用25 ℃作为菌株ZH910的后续培养生长温度。
由图3B可知，在pH4～6范围内，菌株ZH910的OD600nm值随着pH值的升高而增加，pH6时，OD600nm值达到最高；当pH6～10时，菌株的生长繁殖随着pH的升高而受到抑制。因此，选择pH6作为后续菌株ZH910培养生长初始pH。
2.5 菌株ZH910对NaCl和乙醇的耐受性
腐乳发酵体系中的食盐不仅起到调味作用，还可以抑制不耐盐微生物的生长，起到防腐作用；乙醇是腐乳发酵体系中“白汤”的重要组成成分，一方面参与腐乳特有风味的形成，另一方面和食盐协同作用起到防腐作用[19-21]。
确定LB培养基的初始pH值6，培养温度25 ℃，改变培养基体系中的NaCl含量进行单因素试验，评估菌株ZH910的耐受食盐及乙醇能力，结果见图4。
图4 菌株ZH910在不同NaCl（A）和乙醇（B）含量下的生长情况
Fig.4 Growth situation of strain ZH910 under different NaCl (A)and alcohol (B) contents
由图4A可知，菌株ZH910的生长受NaCl含量影响较大。当NaCl含量为4%时，菌体生长繁殖达到最适食盐含量，随着体系食盐含量的继续增加，菌株ZH910生长繁殖受到显著的抑制。然而，当NaCl含量达到18%时菌株ZH910仍能生长繁殖，表现出菌株ZH910具有非常强的耐食盐能力。朱雯娟[22]从发酵梅香鱼中分离获得一株的腐生葡萄球菌，其可耐受20%NaCl。鉴于市售5种品牌腐乳成品体系的食盐含量为7.0～11.0 g/100 g，可知菌株ZH910可以耐受白腐乳发酵体系的食盐环境。
由图4B可知，乙醇对菌株ZH910的生长繁殖具有明显的抑制作用，但其对乙醇的耐受能力达到6%vol，意味着菌株ZH910能够在白腐乳发酵体系中发挥作用。在乙醇含量达到6%vol时，菌株ZH910仍具有微弱的生长繁殖能力。
2.6 目的菌株在白腐乳中的应用效果
将风味菌富集培养基扩培、离心获得的菌株ZH910菌体加入白腐乳的后熟体系中，静置发酵60 d。对其后熟周期内的腐乳进行理化指标检测及感官鉴评，结果见表3。
表3 添加菌株ZH910的毛霉型白腐乳理化及感官评价结果
Table 3 Results of physicochemical indexes and sensory evaluation of Mucor-white sufu with strain ZH910
由表3可知，随着后熟周期的延长，腐乳的氨基酸态氮含量、香气及口感得分逐渐增加；与对照腐乳相比，菌株ZH910加入到毛霉型白腐乳发酵体系中，体系的产香速率明显提升：在后酵60 d后，其乳块腐香浓郁、协调，评分4.5分；另外，其口感鲜、咸协调，细腻、润滑，评分4.8分。均显著优于对照3.6分和3.2分的香气偏弱，不明显；鲜味不足，偏咸，略粗的口感。对乳块氨基酸态氮含量进行检测，可以发现后熟阶段试验样氨基酸态氮指标均优于对照样，较高的氨基酸态氮含量可以赋予白腐乳更加细腻、鲜美的口感，这可能与菌株ZH910具有一定的水解蛋白能力有关，有待于进一步研究。菌株ZH910加入到毛霉型白腐乳发酵体系中，可明显提升白腐乳品质。
3 结论
本试验从市售品牌白腐乳中筛选获得了一株腐生葡萄球菌ZH910，经过形态学观察、分子生物学鉴定其为腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）。研究发现，该菌株适宜在温度15～40 ℃，初始pH 5～7的范围内生长，且最适生长温度为25 ℃、最适生长初始pH值为6；具有能够耐受18%食盐和6%vol乙醇的能力。常温下，将该菌株接种至腐乳后熟体系中，经过30～60 d的发酵，能够显著提升白腐乳氨基酸态氮含量和产品感官品质，加快产香速度。为解决工业化纯种生产模式下导致的白腐乳发酵体系中有益微生物缺失，风味不足问题提出了一种可行的方案。
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