浓香型白酒以固态窖泥发酵为特征，窖泥中微生物的生长代谢活动对白酒风味物质的形成具有重要影响[1]。浓香型白酒常以高梁或高粱、小麦、大米、玉米等作为发酵的主要原料，以大曲作为糖化发酵剂，经过30～60 d发酵后，用蒸汽蒸馏而得[2]。浓香型白酒的典型代表五粮液，其生产方式采用纯粮固态发酵，原料的配比为高粱36%、大米22%、糯米18%、小麦16%、玉米8%[3]。浓香型白酒以己酸乙酯为主体香，具有“窖香浓郁、绵甜爽净、香味协调、余味悠长”等典型特征。
酿酒大多以五谷为原料，熟料固态发酵与续糟发酵是我国浓香型白酒生产的传统工艺，一定程度上保证酒的品质与口感。但目前我国经济迅速发展，发酵所用粮食有限且生产成本高，生料液态发酵成为酒精发酵和酿酒工艺研究的热点与突破口，生料直接用于发酵不需要前期处理，节省大量成本，且工艺简单易操作。
生料发酵最早由日本人提出并应用于酿酒工业，早在20世纪80年代后期对利用玉米粉为原料的生料酿酒技术进行了研究，90年代后期得到推广应用[4]。李学英等[5]在细微玉米粉生料发酵生产酒精研究中，酒精度上升较快，发酵55 h即可达到酒精度为10.6%vol；李永博等[6]对玉米、大米生料发酵酿酒进行研究，生料发酵10 d时，大米、玉米酒精度分别达到11%vol、10%vol；以大米、玉米等谷物为原料，经糖化酶处理后进行生料发酵生产乙醇，与熟料发酵对比，生料发酵黏度低，流动性好，有利于实现高效发酵[7]。在小麦生料发酵中，生淀粉的糖化不经过蒸煮环节，利用淀粉酶极强水解特性将淀粉分解成可发酵性糖，经糖化酶糖化后淀粉表面形成无数个小孔，通过水解作用进行转化，提升了转化效率[8]。关于生料发酵生产酒精的研究表明，生料液态发酵酒精度可以达18%vol以上，淀粉利用率提高，且发酵醪液黏度小，料液输送性能良好，有利于实现高浓度发酵[9]。
本研究将浓香型新工艺酿酒专用曲用于生料液态发酵生产白酒，采取边糖化边发酵的方法，前期5种粮食分别进行单发酵，后期混合发酵，蒸馏分段取酒并陈酿。本研究主要考察室温条件（30±2）℃条件下生料液态发酵过程中残糖及乙醇的变化，结合出酒率、酒香成分含量等指标，对工艺进行评价。此发酵法为新工艺初步探究，以期为后续生料液态发酵的工艺优化研究提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
玉米粉、小麦粉、高粱粉、大米、糯米：市售；新工艺酿酒专用曲：四川新华扬山野生物有限公司；葡萄糖（分析纯）：内蒙古阜丰生物科技有限公司；亚甲基蓝（生化试剂）：天津市光复精细化工研究所；氢氧化钠（分析纯）：广东省化学试剂工程技术研究开发中心；酒石酸钾钠（分析纯）、五水合硫酸铜（分析纯）：汕头市西陇化工有限公司；盐酸（分析纯）：永州恒兴化工贸易有限责任公司；可溶性淀粉：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
HWY-2112全温度恒温调速摇床柜：上海智城分析仪器制造有限公司；UV-8000S紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；Panna A91气相色谱仪：常州磐诺仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 原料预处理[10]
大米、糯米加水浸泡后会充分吸水膨胀，不需要粉碎处理，玉米、高粱、小麦均为粉末。
1.3.2 5种原料单独发酵[11]
浓香型白酒五粮液发酵过程分3个阶段：1～7 d为升温阶段，8～14 d为高温保持阶段，15 d以后为降温阶段。选用25 L带密封盖玻璃瓶，将5种原料进行单发酵预实验，每2 d取样一次测定残糖含量，当发酵10 d时，残糖量降低速率明显减小，发酵16 d以后残糖含量基本稳定，且均低于15 g/L。根据残糖量的降低速率变化，结合发酵过程3阶段变化所需时间，初步确定单发酵时间为16 d。按照表1比例配制发酵培养基，将5种粮食在（30±2）℃条件下单独发酵16 d，取样测定发酵初始和结束时的残糖量，发酵开始3 d后每12 h搅拌一次，每2天取适量样液用于发酵过程中残糖和乙醇的变化情况分析。
表1 五种原料单独发酵配料表
Table 1 List of ingredients of 5 raw materials fermented separately
1.3.3 5种原料混合发酵
5种原料单独发酵16 d后，将发酵醪液按高粱∶小麦∶大米∶糯米∶玉米=4∶2∶2∶2∶1的比例，于室温（30±2）℃条件下进行混合发酵预实验，连续取样，待残糖量下降速率明显降低，且酒精度稳定后，确定混合发酵时间为6 d。混合发酵结束后，通过蒸酒器蒸馏分段取酒，产品取样用于酒精度测定及成分检测分析，剩余装瓶存放进行陈酿。
1.3.4 测定方法
5种原料淀粉含量测定采用NY/T 2639—2014《稻米直链淀粉的测定分光光度法》[12]。配制质量浓度梯度为0、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、6.0 mg/mL、8.0 mg/mL、10.0 mg/mL的淀粉标准液，按照标准要求操作，以淀粉质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制淀粉标准曲线。
称取5种原料细粉各50 mg，分别加入0.5 mL体积分数95%的乙醇，4.5 ml 1 mol/L的NaOH溶液，混合均匀后于沸水中水浴10 min，蒸馏水定容至50 mL，抽滤，滤液作为待测液。取待测液2.5 mL测定吸光度值，按照淀粉标准曲线回归方程计算淀粉含量。
残糖及糖醇转化率测定：将发酵过程取样的样液进行酸化处理，采用菲林滴定法测定总糖含量[13]，确保取样均匀，前期发酵液中颗粒状较多，取样后可进行研磨处理后再进行酸化。
酒精度及出酒率：采用酒精计法测定酒精度，将发酵液通过蒸酒器蒸馏，40 °以下的尾酒则进行复蒸一次，复蒸后低于40°的酒存放，不用于酒的勾兑。蒸馏时分段接收馏液，不同度数的酒分开存放。将蒸馏得到的白酒用酒精计进行酒精度测定[14]。于台式天平称量酒的质量，折算为55°合格酒量[15]计算原料理论出酒率、实际出酒率和出酒效率。酒精度换算及相关计算公式如下：
式中：0.798为乙醇密度；0.92为55°白酒密度；m1为原料所含淀粉质量，kg；m2为55°白酒产量，kg；M为原料总量，kg。
白酒中甲醇、总酸、总酯含量测定：总酸以乙酸计，总酯以乙酸乙酯计，总酸、总酯均采用指示剂法进行滴定，每组测量3次取平均值[12]。
甲醇采用气相色谱测定，其色谱条件为柱温：起始50 ℃保持3 min，3.5 ℃/min升至180 ℃，保持10 min[16]，检测室200 ℃，气化室180 ℃；N2、H2流速30 mL/min；分流模式：不分流；进样量0.5，测定3次，取平均值。
感官评价：由6名品评员组成评定小组，评价方法参考对浓香型白酒基础酒的感官品评价方法[17]，满分100分，具体评价标准见表2。
表2 浓香型白酒感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of sauce-flavor Baijiu
注：GA、GB、GC、GD分别为感官评定得分，温度低于10 ℃允许出现白色絮状物或失光。
2 结果与分析
2.1 5种原料淀粉含量
2.1.1 可溶性淀粉标准曲线绘制
通过NY/T 2639—2014法[12]所得可溶性淀粉标准曲线见图1，两者之间的回归方程：y=0.198 8x+0.0687，相关系数R2=0.995 3，由R值可看出，两者之间具有较好的线性关系。
图1 可溶性淀粉标准曲线
Fig.1 Standard curve of soluble starch
2.1.2 样品测定结果
根据可溶性淀粉标曲回归方程计算样品的淀粉含量，结果见表3。由表3可知，5种原料中小麦、玉米淀粉含量较高，分别为71.18%、70.35%；高粱淀粉含量最低，为64.64%。
表3 5种粮食淀粉含量测定结果
Table 3 Determination results of starch contents in 5 grains
2.2 5种原料单独发酵过程中残糖、乙醇含量的变化趋势
2.2.1 5种原料单独发酵残糖、乙醇曲线
5种原料单独发酵过程中残糖及乙醇含量变化结果，见图2。
图2 5种原料单独发酵残糖含量及乙醇产量变化曲线
Fig.2 Changes of residual sugar contents and ethanol production of 5 raw materials fermented separately
淀粉质原料发酵首先经过糖化（包括液化、糖化）过程，将淀粉转化为葡萄糖后由酿酒酵母利用产乙醇。由图2可知，5种原料单独发酵前8 d，残糖均呈迅速降低趋势，小麦、高粱残糖平均消耗速率在20（g/L）/d左右，玉米、大米和糯米总糖平均消耗速率在25（g/L）/d左右；8～16 d时，小麦、高粱残糖平均消耗速率降至6（g/L）/d左右，玉米、大米和糯米降至1.5（g/L）/d左右。0～8 d酒精度上升较快，8 d后酒精度基本稳定在75～85 g/L之间。因此，生料液态发酵原料利用及产醇主要阶段在8 d左右。
小麦发酵12 d后残糖接近50 g/L，其他4种原料发酵8 d时残糖均低于50 g/L，主要是因小麦中蛋白含量高，一般可达13%左右[18]，在液态发酵前期易产生大量泡沫而影响发酵效果。在发酵后期，除小麦外，其他4种原料中残糖均降至最低并趋于稳定，而小麦发酵10 d后残糖含量始终保持最高，糖化周期最长。
2.2.2 糖醇转化分析
分析5种原料单独发酵过程中，通过糖醇转化率分析发酵效果，结果见图3，发酵结束时指标分析见表4。
图3 5种原料单独发酵过程中糖醇转化率的变化
Fig.3 Changes of conversation rate of sugar to ethanol of 5 raw materials during fermentation process
表4 5种原料单独发酵后指标分析
Table 4 Index analyses of five raw materials after fermentation separately
发酵糖化效果由葡萄糖生成速率表示，产乙醇效果通过乙醇生成速率表示，总糖的降低量代表葡萄糖的消耗量，通过葡萄糖消耗量与酒精度计算糖醇转化率，评价发酵原料的利用率。
由图3、表4可知，高粱发酵前期糖醇转化率最高，保持在45%以上，小麦、玉米次之，达到40%左右，8 d后稍微降低；糯米整个发酵过程中糖醇转化率基本不变，保持在38%左右。由表4可知，单独发酵结束时，高粱发酵的平均糖醇转化率最高，达到47.34%，糯米次之，为41.07%。高粱、糯米最终发酵醪液酒精度分别达到82.85 g/L、87.26 g/L。
综上分析，高粱、糯米、玉米3者的糖醇转化率高，均达40%以上，单独发酵总糖消耗及乙醇积累期在8 d左右，且单独发酵结束时酒精度较高，均达到80 g/L以上。所以，高粱、糯米和玉米3种原料更适合室温条件下生料液态发酵，且周期短。
2.2.3 混合发酵期
5种原料单独发酵16 d后混合发酵，混合发酵过程中残糖及酒精度变化结果见图4。
混合后发酵醪液中的菌群生长环境改变，其代谢功能随之变化。由图4可知，混合3 d后酒精度明显升高，残糖迅速下降。混合5 d后，残糖及酒精度均趋于平稳，此时达到发酵终点。酒精度由初始72.70 g/L上升至89.97 g/L，由此可见，后期混合发酵促进了原料的利用和乙醇的进一步积累。
图4 混合发酵过程残糖、乙醇含量的变化
Fig.4 Changes of residual sugar and ethanol contents during mixed fermentation process
2.3 产品质量指标检测结果
蒸馏获得58°和65°白酒，白酒量换算为55°酒的量。计算原料的理论出酒率为80.36%，实际出酒率为41.16%，出酒效率为51.22%。与李永博等[6]利用大米、玉米进行生料发酵所得出酒率（41.8%、32.1%）相比，本试验出酒率较高，且尚未进行发酵工艺条件优化，预期经发酵条件优化可获得更佳产酒效果。
2.4 甲醇、总酸总酯含量测定
测定产品中甲醇、总酸、总酯及四大酯（己酸乙酯，丁酸乙酯，乳酸乙酯和乙酸丁酯）含量，总酸、总酯评价标准参考GB/T 20822—2007《固液法白酒》和GB/T 22211—2008《地理标志产品五粮液酒》，结果见表5；本产品甲醇及四大酯含量所得结果见表6。
表5 产品理化指标测定结果
Table 5 Determination results of physical and chemical indexes of the product
注：酒精度允许差为±1.0%。
表6 产品中甲醇及四大乙酯含量测定结果
Table 6 Determination results of methanol and four main kinds of ethyl esters in the product
由表5、表6可知，58°白酒中总酸为0.384 0 g/L，总酯为1.192 6 g/L，己酸乙酯为0.496 8 g/L，甲醇为0.156 2 g/L；65°白酒中总酸为0.322 4 g/L，总酯为1.453 9 g/L，己酸乙酯为1.017 5 g/L，甲醇为0.192 1 g/L，各成分均符合GB/T 20822—2007要求。此外，还对白酒中主要四大酯类（己酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯和乙酸丁酯）进行测定分析，所得结果含量偏低，但各酯类含量相比下己酸乙酯含量突出，符合浓香型白酒主体香味成分占主导的要求。适量乳酸乙酯对己酸乙酯有助香作用，当己酸乙酯和乳酸乙酯保持适当的比例（1∶0.5～0.9），能使主体香突出，香、味协调，酒体典型性强[19]，所得65°白酒中己酸乙酯与乳酸乙酯的比例适当，凸显浓香型白酒特色。
所得白酒中总酸、总酯含量未达到五粮液GB/T 22211—2008《地理标志产品五粮液酒》的要求，主要原因是所得产品为新酿酒，未经过陈酿及勾兑等处理。但满足固液法白酒GB/T 20822—2007《固液法白酒》的基本标准。后期工艺改进可参考目前酿酒促进酯类生成方法进一步研究，通过乳酸菌与醋酸菌的应用增加产酯量，且两种菌对酒的品质产生决定性影响[20]，改善白酒风味与口感。
2.5 感官评价
感官评分取6人评分的均值，结果见表7。
表7 感官评价结果
Table 7 Results of sensory evaluation
由表7可知，品酒人员一致评价58°白酒回味甘甜，刺激味轻微；65°白酒苦涩味、辛辣味偏重，具备刺激性。58°白酒总体口感协调，香气浓郁，口感更容易被接受，得分更高。
3 结论
本研究通过室温下生料液态发酵，对5种原料发酵过程中残糖和乙醇变化进行了分析，初步确定5种原料单独发酵糖化及产乙醇期为8 d。单独发酵结束时，总糖利用率均达90%以上，高粱糖醇转化率最高，达到47.37%。混合后发酵所得纯粮酿造的浓香型白酒出酒率为41.16%，甲醇含量符合标准要求，总酸总酯含量达到GB/T 20822—2007的理化指标，65°白酒中所含主体香味成分己酸乙酯高于58°白酒，但综合分析，58°白酒总酸、总酯含量更接近五粮液标准GB/T 22211—2008，且口味更佳。
综合所得结果分析，室温（30±2）℃条件下生料液态发酵具有可行性，且操作简单，成本降低。先进行单独发酵，单发酵期间不同原料菌群构成不同，后期混合后菌群交换，发酵更加充分，物质更加丰富。纯粮酿造在一定程度上保证了白酒的口感，在白酒行业具备一定发展潜力，需要进一步从发酵工艺、成本上进行合理改进与完善，本研究为纯粮酿造白酒的生料液态发酵提供一定研究参考依据。
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