苦水玫瑰产自甘肃苦水，花色较深，香型独特[1]，富含多酚类物质[2]，通常用于提炼玫瑰油，但对苦水玫瑰深加工研究尚少[3-4]。玫瑰酒的历史可上溯至明代，直至21世纪，科研人员对玫瑰酒的研究仍在继续[5-6]。如彭涛等[7]从苦水玫瑰花瓣中分离优质菌种，筛选得到了发酵能力强的酵母菌，于倩等[8]通过比较分析苦水玫瑰和霞多丽玫瑰酒的香气成分，结果表明，苦水玫瑰有利于提高酒的花香品质。
冬枣别名苹果枣、雁来红、冰糖枣等，并富含多酚类物质、维生素C和钙、镁等多种矿物质，营养价值较高[9]。但冬枣含糖量高，不耐储藏，因此适宜发酵制酒。张陈云等[10]利用冬枣清汁酿制冬枣酒，颜色翠绿，果香浓郁；杨启贤[11]则用冬枣皮渣混合酿酒，虽制得营养丰富的冬枣果酒，但口感青涩，略失醇厚。因此，对冬枣酒发酵工艺的研究仍在继续。随着消费观念的转变和健康食品的发展，人们对混合果酒的需求不断增加。以苦水玫瑰和冬枣为原料混合发酵制酒，不仅在颜色和香气上形成互补，而且有利于提高果酒营养价值[12]。
本研究拟以果酒酒精度和感官评分为评价指标，对酵母接种量、蔗糖用量、苦水玫瑰用量和发酵时间等进行单因素试验，并设计4因素3水平的正交试验，以此进一步完善苦水玫瑰冬枣酒的发酵工艺。苦水玫瑰冬枣酒的研制不但丰富了果酒的种类，满足了人们对果酒营养和口感日益增加的需要，而且还为促进苦水玫瑰深加工产业的发展提供了一种新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
冬枣：采购于黄骅市枣园；苦水玫瑰（干制花蕾）、蔗糖：市售；安琪果酒专用酵母：安琪酵母股份有限公司。
果胶酶（100 000 U/g）、α-淀粉酶（20 000 U/g）、糖化酶（50 000 U/g）：河北格贝达生物科技有限公司；壳聚糖、柠檬酸（食品级）：河南万邦实业有限公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
DH-600AB电热恒温培养箱：北京中兴伟业仪器有限公司；FA2004电子分析天平：上海衡平仪器仪表厂；LB32T糖度计：广州恩测电子科技有限公司；YP2001N型电子天平：上海精密仪器仪表有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 苦水玫瑰冬枣酒的工艺流程[13-18]
冬枣洗净，破碎，加入4倍质量的水，用料理机破碎榨汁。加入适量苦水玫瑰、0.45‰果胶酶和0.45‰淀粉酶，45℃酶解1 h，加入0.45‰糖化酶，60℃酶解2 h。过滤，冷却至30℃时，根据液体的总量接入一定比例的已活化的酵母，25℃恒温发酵。发酵24 h后，加入适量蔗糖。在试验过程中，根据发酵情况排气。发酵结束后，60℃加热30min进行灭菌，过滤后加入壳聚糖进行澄清。再次过滤后放置15 d进行陈酿，得产品。
1.3.2 发酵工艺优化单因素试验设计
（1）优化酵母接种量
蔗糖用量150g/L、苦水玫瑰用量15g/L、25℃发酵144h，其他工艺按1.3.1操作，分别接种0.05‰、0.15‰、0.25‰、0.35‰、0.45‰的酵母，以酒精度和感官评分为评价指标，确定酵母接种量。
（2）优化蔗糖用量
酵母接种量0.15‰时，分别添加50g/L、100g/L、150g/L、200 g/L、250 g/L的蔗糖，其他按（1）操作，确定蔗糖用量。
（3）优化苦水玫瑰用量
酵母接种量0.15‰时，分别添加10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L的苦水玫瑰，其他按（1）操作，确定苦水玫瑰用量。
（4）优化发酵时间
酵母接种量0.15‰时，分别发酵48 h、72 h、96 h、120 h和144 h，其他按（1）操作，确定发酵时间。
1.3.3 发酵工艺优化正交试验设计
在单因素试验基础上，以酒精度和感官评分为评价指标，进行4因素3水平正交试验，确定最佳的发酵条件。正交试验因素与水平见表1。
表1 发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization
水平 A酵母接种量/‰B蔗糖用量/（g·L-1）C苦水玫瑰用量/（g·L-1）D发酵时间/h 1 2 3 0.05 0.15 0.25 100 150 200 15 20 25 72 96 120
1.3.4 苦水玫瑰冬枣酒的澄清试验
分别向果酒中加入0.1～1.2g/L的壳聚糖进行澄清[19-20]，搅拌后静置24 h，离心10 min（3500 r/min），取上清液，测定透光率。
1.3.5 理化指标测定
酒精度采用GB5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中的酒精计法[21]；糖浓度采用手持糖度计法[22]；透光率采用分光光度计法[19]，以蒸馏水为对照，用紫外分光光度计测定；总酚采用Folin-Ciocalteu酚法[23-25]。以没食子酸为标准品，建立标准曲线，得到的标准曲线回归方程为：y=0.096 8x-0.0178，y为吸光度值，x为没食子酸质量浓度（μg/mL），相关系数R2=0.996 2。
1.3.6 感官指标评价方法
依据NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》、GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》和相关研究[26]确定苦水玫瑰冬枣酒感官评价标准，满分100分。选择10名经过感官评定培训的食品专业人员，进行感官评价。
表2 苦水玫瑰冬枣酒感官品评标准
Table 2 Sensory evaluation standard of Kushui rose and winter jujube wine
评价项目 感官评价标准 评价域差中良优外观（20分） ＜1010～1314～1718～20香气（20分） ＜1010～1314～1718～20滋味（40分）典型性（20分）红褐色、酒液清亮、无明显沉淀物和悬浮物具有果香和玫瑰香味，气味协调悦人醇厚纯净、回味绵延、酒体协调风格独特、优雅无缺＜25＜10 25～30 10～13 31～35 14～17 18～20 18～20
1.3.7 微生物指标测定
依据GB 4789.2—2016《菌落总数测定》和GB 4789.3—2016《大肠菌群计数》对果酒进行微生物检测。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果与分析
2.1.1 酵母接种量的优化
酵母菌接种量对果酒的酒精度和感官评分的影响结果见图1。从图1可知，随着酵母接种量的增加，果酒的酒精度呈先上升后下降至平缓的趋势。酵母的接种量在0.05‰～0.15‰范围内时，接入的酵母越多，利用糖类产生酒精的能力越强，酒精度越高。当酵母接种量超过0.15‰时，更多的糖类被用于生长繁殖，酒精度下降。从图中还可以发现果酒的感官评分虽有差异，但差异不大，所以酵母接种量的变化对果酒感官的影响较小。综合考虑酒精度和感官评分，当酵母接种量为0.15‰时，果酒的品质最佳。
图1 酵母接种量对果酒的酒精度和感官评分的影响
Fig.1 Effect of yeast inoculum on alcohol content and sensory score of fruit wine
2.1.2蔗糖用量的优化
蔗糖用量对果酒酒精度和感官评分的影响结果见图2。如图2所示，在一定范围内蔗糖对酵母有抑制作用。随着蔗糖用量的增加，果酒的酒精度不断下降，这很可能是因为渗透压的不断增加，影响了细胞水分活度及细胞质组成，从而抑制了酵母的活力[27-29]。当蔗糖用量超过150 g/L时，蔗糖对酵母的抑制作用加强，果酒的酒精度大幅下降。蔗糖用量对果酒的感官评分影响很大，随着蔗糖用量的增加，果酒的感官评分不断上升，这是因为果酒中的苦涩味降低，口感更适宜。但当蔗糖用量超过200g/L时，果酒中的酒精度过低而残留的糖浓度过高，影响了果酒的感官评分。综合考虑酒精度和感官评分，蔗糖的用量选择150 g/L较理想，此时果酒的酒体协调而且酒精度较高。
图2 蔗糖用量对果酒的酒精度和感官评分的影响
Fig.2 Effect of sucrose addition on alcohol content and sensory score of fruit wine
2.1.3苦水玫瑰用量的优化
苦水玫瑰用量对果酒酒精度和感官评分的影响结果见图3。由图3可知，当苦水玫瑰的用量在10～20 g/L范围内时，果酒的酒精度不断升高。当苦水玫瑰用量超过25g/L时，果酒的酒精度反而大幅度降低。试验过程中，随着苦水玫瑰用量的不断增加，果酒的颜色逐渐加深，苦水玫瑰独特的香气愈加明显，感官评分不断增加。综合考虑酒精度和感官评分，苦水玫瑰的用量选择25 g/L为宜。
图3 苦水玫瑰用量对果酒的酒精度和感官评分的影响
Fig.3 Effect of Kushui rose addition on alcohol content and sensory score of fruit wine
2.1.4 发酵时间的优化
发酵时间对果酒酒精度和感官评分的影响结果见图4。如图4可知，当发酵时间在48～96 h时，发酵时间越长，感官评分越高，这是因为在此过程中，酒精和风味物质的含量不断上升。当发酵时间超过96 h，酒精度趋于稳定，发酵过程基本结束。随着发酵时间的进一步延长，感官评分下降，这是因为产生了不良气味，果酒的澄清度也降低了。因此，最佳发酵时间为96 h。
图4 发酵时间对果酒的酒精度和感官评分的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content and sensory score of fruit wine
2.2 正交试验发酵工艺优化
根据单因素试验结果，进行4因素3水平正交试验，综合考察酵母接种量、蔗糖用量、苦水玫瑰用量、发酵时间对果酒酒精度和感官评分的影响。苦水玫瑰冬枣酒的正交试验结果见表3，评价指标的极差分析见表4，方差分析见表5。
由表4、表5可知，B、D对酒精度和感官评分均有显著影响（P＜0.05）。各因素对两个指标影响的大小顺序相同，其顺序为B＞D＞C＞A。以酒精度为评价指标，最优条件组合为A1B1C3D3；以感官评分为评价指标，最优条件组合为A1B3C3D2或A2B3C3D2。按照上述三组条件酿造果酒，并测定酒精度和感官评分。A1B1C3D3果酒的酒精度为12.5%vol，感官评分为87分；A1B3C3D2果酒的酒精度为10.8%vol，感官评分为93分；A2B3C3D2果酒的酒精度为10.4%vol，感官评分为91分。所以选择的最优条件组合为A1B3C3D2，此时感官评分最高，且酒精度符合NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》的要求。
表3 发酵工艺优化正交试验结果
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization
试验号 A B C D 酒精度/%vol 感官评分/分1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 1 2 3 3 1 2 2 3 1 10.5 10.1 9.5 11.4 9.4 8.7 11.3 10.9 7.5 82 83 89 79 84 91 85 73 92
表4 正交试验结果极差分析
Table 4 Range analysis of orthogonal experiment results
指标 因素 k1 k2 k3 R酒精度感官评分A B C D A B C D 10.03 11.07 10.03 9.13 84.67 82.00 82.00 86.00 9.83 10.13 9.67 10.03 84.67 80.00 84.67 86.33 9.90 8.57 10.07 10.60 83.33 90.67 86.00 80.33 0.20 2.50 0.40 1.47 1.33 10.67 4.00 6.00
表5 正交试验结果方差分析
Table 5 Variance analysis of orthogonal experiment results
指标 因素 偏差平方和 自由度 F值 P值--2 2 2 2 - 2 2 2 2 A B C D误--酒精度52.429 1.714 1.930 0.019 0.368 0.035差A B C D误差7.340 0.240 3.860 0.140-192.889 24.889 68.222 3.556- -- -感官评分54.250 7.000 19.188-0.018 0.125 0.050-
2.3 苦水玫瑰冬枣酒的质量指标检测
感官指标：酒液清亮，香气协调，有独特的风格，感官评分为93分。
理化指标：酒精度为10.6%vol；总酚质量浓度为2.20 mg/mL，透光率92%，糖度为8.9°Bx。
微生物指标：菌落总数＜50CFU/mL，大肠杆菌未检出。
2.4 澄清试验结果与分析
图5 壳聚糖澄清试验结果
Fig.5 Results of chitosan clarification experiments
由图5可知，随着壳聚糖用量的增加，苦水玫瑰冬枣酒的透光率先上升后下降。当壳聚糖的用量在0.2～0.6 g/L范围内时，澄清效果最好。壳聚糖的用量继续增加时，果酒的透光率下降。考虑到澄清效果及成本，壳聚糖的最佳用量为0.2 g/L。
3 结论
本试验对苦水玫瑰冬枣酒的发酵工艺进行了研究，通过单因素试验和正交试验最终确定最佳工艺条件为酵母接种量0.05‰，蔗糖用量200 g/L，苦水玫瑰用量25 g/L，发酵时间96 h，壳聚糖用量0.2 g/L。在此优化条件下，得到的苦水玫瑰冬枣酒酒液清亮，色泽诱人，果香酒香协调。本研究对苦水玫瑰及冬枣的深加工进行了有益的探索，为后续的研究提供一定的依据。
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