冰酒是将成熟后的葡萄延迟采收，在气温低于-7℃的自然条件下冷冻浓缩，并在结冰状态下采收、压榨，最终发酵酿制而成的一种高档甜型葡萄酒[1]。挂果期的反复冻融及失水浓缩使得最终酿制而成的冰酒具有独特的风格，深受消费者的喜欢。甜酸平衡对冰酒的和谐感极其重要，若酸度过低会使得冰酒过于甜腻，但若酸度过高，将会使冰酒口感酸涩、粗糙、生硬，酒体不和谐。在桓仁产区，由于其特殊的气候，威代尔冰酒酸度偏高，且有50%都是苹果酸[2]，因此，可进行适当的降酸，以提高冰酒的品质。
苹乳发酵（malo-lactic fermentation，MLF）法是一种柔和的生物降酸方式，其不仅能降低酸度，还能提高生物学稳定性、修饰风味，使最终葡萄酒变得柔和、圆润，为了保证苹乳发酵的顺利进行，并达到预期的酿造目标，很多已经开始人为接种乳酸菌来启动苹乳发酵。目前，常用的乳酸菌接种方式为有同时接种发酵和顺序接种发酵（se-inoculation fermentation，Se-F）[3]。对冰酒发酵来说，由于其特殊的保糖发酵酿造工艺，在酒精发酵结束后很难做到既抑制酵母代谢，又保证乳酸菌（Lactobacillus）正常繁殖代谢，因而酵母菌（Saccharomyces）并不适合顺序接种发酵法。而在酒精发酵旺盛期接种乳酸菌并不合适，因为此时酵母菌已占据绝对的优势，营养物质减少，SO2、乙醇的存在以及酵母代谢产生的有害物质（如中长链脂肪酸），会抑制乳酸菌的生长[4]，因此，在冰酒中最好采用酵母菌和乳酸菌同时接种法进行苹乳发酵。目前尚未有在高糖高渗透压的冰葡萄汁中进行苹乳发酵的相关研究报道。
香气物质是葡萄酒中具有挥发性且能够产生一定气味的呈香物质的总称，是构成葡萄酒感官特性的一类重要风味物质，挥发性香气物质的种类、含量、阈值及其相互之间的作用决定了葡萄酒的风格和典型性，影响着葡萄酒的质量。葡萄酒的风味物质主要包括了高分子量的非挥发性物质和低分子质量的挥发性物质，这些物质间的协调、累加、削减等作用决定了葡萄酒最终的质量[5]。此外有机酸含量是葡萄酒中重要的质量指标，在很大程度上决定了葡萄酒的酸度，其种类、浓度以及比例不仅影响着葡萄酒的口感、色泽，还影响着其生物稳定性[6]。本实验通过对中国辽宁桓仁产区的威代尔冰葡萄汁进行酒精和苹果酸-乳酸同时发酵（co-incoluation fermentation，CO-F），以单一酒精发酵（alcoholic fermentation，AF）为对照，采用液相色谱（liquid chromatography，LC）、顶空固相微萃取（headspacesolidphase microextraction，HS-SPME）和气相色谱-质谱（gaschromatograph-mass spectrometer，GC-MS）联用技术，测定威代尔冰葡萄酒中有机酸和挥发性香气物质含量，并进行感官评定，探究苹果酸-乳酸发酵对威代尔冰酒香气的影响，以期达到降酸和改良葡萄酒风味的目的，为后续生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料与菌株
威代尔葡萄原料：采自辽宁桓仁满族自治县二棚甸子镇，原料树龄5年，小棚架栽培，株行距0.5 m×2.0 m，每亩产量控制在500kg左右。活性干酵母R2、直投式乳酸菌Oenoi1：法国Lallemand公司。
1.1.2 化学试剂
草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸（均为色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司；葡萄糖、酒石酸、氯化钠、磷酸氢二铵、磷酸（均为分析纯）：北京国药集团化学试剂有限公司；4-甲基-2-戊醇、乙酸乙酯、异戊酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸苯乙酯、十二酸乙酯、异戊醇、己醇、顺式-3-己烯醇、反式-3-己烯醇、顺式-2-己烯醇、反式-2-己烯醇、辛醇、2,3-丁二醇、癸醇、苯甲醇、苯乙醇、己酸、辛酸、癸酸、里那醇、4-松油醇、香茅醇、香叶醇、紫罗兰酮、萘（纯度均＞97.0%）：美国Sigma公司；正构烷烃C7～C4（0500mg/L于己烷）：上海安谱实验科技有限公司；乙醇（色谱级）：香港J&K贸易有限公司。
1.2 仪器与设备
BSA124S-CW分析天平：德国塞利多斯公司；GL-20G-II型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；LC 20A-二极管阵列检测器（diode array detector，DAD）：日本岛津公司；TechMate C18-ST色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）：北京泰克美公司；Aglient 7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪、DB-WAX 毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国Agilent公司；聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）/碳筛（Carboxen，CAR）/二乙苯烯（divinylbenzene，DVB）萃取头：美国Supelco公司。
1.3 方法
1.3.1 威代尔冰酒发酵工艺
冰葡萄→压榨→冰葡萄汁→回温→接种→控温发酵→终止发酵→澄清→过滤→灌装→成品
操作要点：葡萄在-8℃以下采摘后，采用压榨机立即低温压榨，压榨完后冰葡萄汁加热回温至20℃，转入10 L的发酵罐，接入300 mg/L酵母进行单一酒精发酵（AF），对照处理在接入300 mg/L酵母菌48 h后，接入20 mg/L乳酸菌同时进行酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵（MLF），发酵温度控制在（20±2）℃，定时取样200 mL于-40℃冰箱中冷冻保存，待分析。待酒精度达到10.5%vol左右时，向发酵液中加入80mg/L的偏重亚硫酸钾（SO2）终止发酵，并加入400mg/L的皂土澄清、过滤、室温（20±2）℃灌装后，酒窖中陈酿3个月，得威代尔冰葡萄酒。
1.3.2 威代尔冰酒基本理化指标测定
还原糖、可滴定酸、pH、酒精度、挥发酸等指标参照国标GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行检测。
1.3.3 威代尔冰酒中有机酸含量的测定
有机酸含量的测定采用液相色谱法，参考JIN Q等[7]的实验方法，酒样在室温下解冻，混合均匀后，冷冻离心（4℃、6 000 r/min、10 min），用流动相稀释20倍后过0.22 μm尼龙滤膜，利用液相色谱法进行检测，色谱柱为TechMate C18-ST（4.6mm×250mm，5μm），柱温为21℃。流动相为0.02mol/L磷酸氢二铵，用磷酸调溶液pH值至2.5，等度洗脱，流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL，检测时间15 min，检测波长为210 nm。采用保留时间定性，外标法定量。
1.3.4 威代尔冰酒中挥发性香气成分分析
挥发性香气成分测定采用气质联用法，参照CAIJ等[8]的检测方法，稍作修改。顶空固相微萃取（HS-SPME）：取5mL酒样、1gNaCl和10μL内标（4-甲基-2-戊醇，1.280g/L）于15 mL的样品瓶中，并加入磁力搅拌转子，立即用带有聚四氟乙烯隔垫的瓶盖拧紧，置于磁力搅拌加热台上，在40℃条件下平衡30min。随后将经过活化的PDMS/CAR/DVB三相萃取头插入样品瓶的顶空部分，萃取头距离液面大约l cm，在40℃条件下加热搅拌30 min，使样品瓶中的香气物质达到气、液、固三相平衡，然后将萃取头插入气相色谱（GC）的进样口热解吸8 min。
气相色谱条件：毛细管色谱柱为DB-WAX（60 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度为250℃，气相色谱升温程序为：50℃保持1 min，以3℃/min的速度升温至220℃，载气为高纯氦气（He），流速1 mL/min，不分流进样。质谱条件：质谱接口温度为280℃，离子源温度为230℃，电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，质量扫描范围为29～350 amu。
定性、定量分析：对于有标准物质的，直接采用标准物质进行定性；没有标准物质的，根据由正构烷烃计算出的保留指数（retentionindex，RI）和质谱信息，结合美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）标准谱库进行对比，对化合物进行定性；在进行RI计算时，计算得到的RI与标准库的差值的绝对值＜50时，可定性为该化合物；定量分析时，对于有标准品的物质，利用其在模拟酒溶液中的标准曲线进行定量，无标准品的物质，利用与其化学结构相似、官能团类似、碳原子数相近的标准物质进行定量。
香气活性值（odouractivityvalue，OAV）计算：是由该物质的含量除以其嗅觉阈值而得到，用以表征挥发性化合物对实际香气的贡献大小。其是评价挥发性化合物对实际香气贡献大小所普遍采用的一个指标，一般来讲，OAV＞1，表示该化合物对葡萄酒香气有贡献[10]。虽然目前并没有关于在冰酒的高糖环境中香气阈值的文献报道，但是也可通过采用与普通葡萄酒相近酒精度中的阈值来研究冰酒中的主体呈香物质[11]。
1.3.5 感官评价
从中国农业大学葡萄与葡萄酒专业学生中，筛选出具有一定的品评经验的20名感官品评员（10男10女），参照GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，主要从外观、香气、口感三个方面，按表1的评分标准给冰酒酒样打分（满分为9分）[9-10]。
表1 冰酒感官品评标准
Table 1 Sensory evaluation standards of Vidal ice wine
项目 判断标准外观香气口感浑清度/分（满分9分）色泽/分（满分9分）果香/分（满分9分）花香/分（满分9分）蜜香/分（满分9分）干果香/分（满分9分）化学味/分（满分9分）酸度/分（满分9分）甜酸平衡感/分（满分9分）整体评分/分（满分9分）混浊（0～3分）；澄清透亮（3～6分）；澄清透亮（6～9分）浅绿色（0～3分）；浅黄色（3～6分）；金黄色（6～9分）果香（菠萝、水蜜桃等）非常弱（0～3分）；果香中等（3～6分）；果香非常强（6～9分）花香非常弱（0～3分）；花香中等（3～6分）；花香非常强（6～9分）蜜香非常弱（0～3分）；蜜香中等（3～6分）；蜜香非常强（6～9分）干果香非常弱（0～3分）；干果香中等（3～6分）；干果香非常强（6～9分）化学味非常弱（0～3分）；化学味中等（3～6分）；化学味非常明显（6～9分）无酸味（0～3分）；酸度适中（3～6分）；酸度突出（6～9分）甜酸平衡感差（0～3分）；甜酸平衡感欠佳（3～6分）；甜酸平衡感好（6～9分）香气单一，余味短，平衡感差（0～3分）；香气清新且较复杂，余味较长，平衡感较好（3～6分）；香气清新、复杂，余味长，酸甜平衡感好（6～9分）
1.3.6数据分析
采用SPSS12.0数理分析统计软件进行方差分析和主成分分析，采用SigmaPlot 12.0进行统计作图。
2 结果与分析
2.1 威代尔冰葡萄酒基本理化指标分析
冰葡萄汁和发酵结束后的酒样的基本理化指标检测结果见表2。
表2 同时发酵对威代尔冰酒基本理化指标的影响
Table 2 Effect of simultaneous fermentation on basic physical and chemical indexes of Vidal ice wine
注：同一行中，不同字母表示显著性差异（P＜0.05）。
指标 葡萄汁 CO-F AF还原糖（以葡萄糖计）/（g·L-1）滴定酸（以酒石酸计）/（g·L-1）可溶性固形物/°Bx pH值酒精度/%vol挥发酸（以乙酸计）/（g·L-1）甘油/（g·L-1）385.8±0.00a 12.8±0.21b 37.8±0.10a 3.23±0.01c 0.00±0.00b 0.12±0.00b 4.10±0.12b 184.2±1.80b 12.5±0.07b 20.9±0.20b 3.43±0.00a 10.44±0.19a 1.25±0.05a 12.51±0.30a 178.5±2.70b 13.3±0.06a 20.3±0.00b 3.36±0.02b 10.46±0.37a 1.20±0.15a 12.13±0.15a
甘油是酒精发酵的副产物，一般餐酒中甘油含量为1.4～10.6 g/L，而在冰酒的高糖高渗透压中，酵母往往会代谢产生大量的甘油来保护自己，导致冰酒中的甘油含量增加，本实验中甘油含量为12.50 g/L左右，这与NURGEL C等[11]的研究结果一致。在加拿大冰酒中，酒精度大约为10.5%vol[11]，本实验中的酒精含量与其接近。挥发酸是接种乳酸菌的冰酒中值得关注的物质，在高糖的条件下，乳酸菌可能会利用糖异型发酵代谢产生乙酸，从而增加挥发酸的含量[12]。CO-F中稍多的乙酸可能是由于乳酸菌对柠檬酸等物质的代谢，这在一定程度上有助于生成更多的酯类香气物质，从而赋予冰酒更浓郁的果香[13]。苹果酸乳酸发酵对冰酒中的还原糖、甘油、酒精度、挥发酸、可溶性固形物等基本理化指标都没有显著性的影响，这与前人研究结果一致[14-15]。同时发酵使得总酸显著降低了0.8 g/L，pH增加了0.07。一般来讲，苹乳发酵会使葡萄酒总酸降低1～3g/L，pH增加0.1～0.3个点[16]。
2.2 不同的发酵方式对冰酒有机酸含量的影响
有机酸在很大程度上决定了葡萄酒的酸度，其种类、浓度以及比例不仅影响着葡萄酒的口感、色泽，还影响着其生物稳定性，因而决定了葡萄酒的类型和品质[6]。采用LC技术对单一酒精发酵和酒精发酵与苹果酸-乳酸同时发酵的冰酒中有机酸种类和含量进行对比分析，以峰面积（x）为横坐标，有机酸含量（y）为纵坐标，测定冰酒中各有机酸的保留时间、标准曲线回归方程、相关系数及其含量见表3。由表3可知，苹果酸是最主要的有机酸，其含量为有机酸总量的50%。与仅进行酒精发酵的冰酒相比，经过苹果酸-乳酸发酵的冰酒中苹果酸、琥珀酸、柠檬酸含量显著降低，分别降低26%、26%、23%，乳酸含量显著增加50%。苹果酸是一种具有生青味的酸，带涩味，琥珀酸具有苦味，这两种酸含量的降低，有利于提高冰酒的口感[15]。乳酸的酸味柔和，其含量的升高有利于冰酒风味质量的提高。苹乳发酵可以适当地降酸，有利于冰酒品质的提高。
表3 不同发酵方式对威代尔冰酒有机酸含量的影响
Table 3 Effect of different fermentation mode on organic acid contents in Vidal ice wine
注：a，b，c不同字母表示结果差异显著（P＜0.05）。
有机酸 保留时间/min线性方程相关系数R2草酸酒石酸苹果酸乳酸乙酸柠檬酸琥珀酸3.133 3.567 4.513 5.529 5.906 7.842 9.534 y=3e-7x-0.087 2 y=1e-6x-0.030 5 y=3e-6x-0.026 7 y=5e-6x-0.002 5 y=5e-6x-0.016 6 y=2e-6x-0.006 4 y=4e-6x-0.003 3 0.991 1 0.995 2 0.994 9 0.994 5 0.994 9 0.995 5 0.997 6含量/（g·L-1）CO-F AF 0.47±0.07b 1.16±0.13a 7.04±0.55c 0.30±0.04a 1.34±0.03a 0.85±0.05b 0.95±0.00b 0.62±0.06b 1.59±0.15a 9.50±0.13b 0.20±0.00b 1.30±0.04a 1.10±0.08a 1.28±0.04a
2.3 不同发酵方式对威代尔冰酒挥发性香气成分的影响
2.3.1 发酵方式对香气成分种类和含量的影响
葡萄汁、单一发酵威代尔冰酒和酒精与苹果酸-乳酸共发酵威代尔冰酒中挥发性香气物质种类和含量测定及OAV结果见表4。
由表4可知，采用HS-SPME和GC-MS技术，并根据标准物质、RI和质谱信息，结合NIST标准谱库比对共鉴定出威代尔冰酒58种香气成分，其中包括醇类20种、酯类19种、酸类5种、萜类9种、其他类5种。
C6醇通常具有生青味，对葡萄酒香气产生不良影响。与果汁相比，酒样中的C6醇总量较低。在两个酒样中，C6醇总量没有显著性的差异，说明在本实验中苹乳发酵对冰酒C6类物质影响不大。本实验中共检测出了16种高级醇，其中含量较多的有左旋-2,3丁二醇、异戊醇、异丁醇、苯乙醇，分别占高级醇总量的40%、30%、10%和2%，其中苯乙醇给冰酒带来愉悦的花香和蜜香，形成冰酒典型的香气特征。苹果酸-乳酸发酵能显著降低冰酒中高级醇的总量（12.19%），其中显著降低了戊醇（呈现出苦杏仁味）的含量，有利于冰酒香气质量的提高。苹乳发酵能显著降低冰酒中高级醇的总量，可能是因为乳酸菌抑制了酵母对氨基酸的利用[13，23]。
表4 葡萄汁及不同发酵方式对威代尔冰酒香气成分及香气活度值的影响
Table 4 Effect of grape juice and different fermentation modes on aroma components and odor activity value of Vidal ice wine
序号 化合物 阈值[1，8，17-22]/（μg·L-1） 特征描述[8，18，21]1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 7 500 160 1 500果香，酯香香蕉味苹果味、樱桃味乙酸酯乙酸乙酯乙酸异戊酯乙酸己酯乙酸-3-己烯酯乙酸庚酯乙酸苯乙酯脂肪酸乙酯丁酸乙酯戊酸乙酯己酸乙酯庚酸乙酯乳酸乙酯辛酸乙酯壬酸乙酯癸酸乙酯丁二酸二乙酯9-癸烯酸乙酯月桂酸乙酯其他酯辛酸甲酯水杨酸甲酯1 400 250果香、玫瑰花香20香蕉、菠萝、草莓味80香蕉、青苹果11 12 13 14 15 16 17 14 000 580果香、奶油味香蕉、梨、花香200 200 000 100 1 500葡萄、果香、脂肪香果香、瓜香果香、脂肪香脂肪味、果香18 19 200柑橘香葡萄汁3 778.98±20.55b 3 726.22±21.17b 23.31±0.72c 5.61±0.29c trace trace 23.85±1.51b 1 750.74±0.43c 22.89±1.14c 7.61±0.20a 21.49±1.20c trace 512.65±2.26c 250.29±4.24b 5.37±0.07c 362.35±7.29c 66.14±4.94b 304.06±2.00b 197.89±2.16c 1.12±0.12a trace 1.12±0.12a含量/（μg·L-1）CO-F 葡萄汁OAV CO-F AF 60 209.78±1 980.54a 58 738.83±1 935.39a 1 279.33±64.22a 54.19±2.70a trace 4.16±0.34 133.26±4.61a 7 454.22±164.18a 130.130 75±10.46a 7.84±0.14a 178.29±15.89a 2.20±0.09a 3 623.87±347.09a 761.19±71.29a 9.29±0.65a 1 392.99±112.64a 132.09±10.69a 365.88±23.82a 850.45±19.00a 1.26±0.09a trace 1.26±0.09a AF 57 138.22±2 606.29a 56 165.12±2 578.23a 826.71±48.06b 25.01±1.95b trace trace 121.37±10.68a 4 867.59±182.41b 95.85±5.42b 7.40±0.39a 94.70±2.74b 1.26±0.10b 2 215.99±131.98b 235.23±10.31b 8.28±0.30b 1 202.15±55.57b 132.17±12.86a 346.71±19.10a 527.84±17.90b 1.14±0.06a trace 1.14±0.06a 0.50 0.15 0.00 7.83 8.00 0.04 7.49 5.17 0.02 0.00 0.10 0.00 0.53 0.00 0.49 1.146.514.79 0.272.231.18 0.04 0.43 0.26 1.31 0.16 0.41 1.81 0.00 3.04 0.13 6.96 0.00 3.66 0.57 6.01 0.00 3.47 0.35
续表
注：“trace”表示痕量；“nd”表示未检测到。不同处理间同一化合物含量数据标注不同字母（a，b，c）表示差异显著（P＜0.05）。
序号 化合物 阈值[1，8，17-22]/（μg·L-1） 特征描述[8，18，21]葡萄汁含量/（μg·L-1）CO-F 葡萄汁OAV CO-F AF 20 21 22 23 1 100 400 400青草味、生青味青草味、生青味生青味、脂肪味1.67 0.01 1.13 0.91 0.05 0.77 0.86 0.05 0.77 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 000 150 000 30 000 80 000 70 50 000酒精、溶剂、生青药味，酚味溶剂、酒精、指甲油味苦杏仁味、香脂味霉味，蘑菇味辛辣、溶剂、生青C6醇2-己醇己醇反式-3-己烯醇顺式-3-己烯醇高级醇异丁醇丁醇异戊醇戊醇2-庚醇3-甲基-1-戊醇3-辛醇2-辛醇1-辛烯-3-醇庚醇左旋-2,3-丁二醇辛醇内消旋-2,3-丁二醇反式-2-辛烯醇苯甲醇2-苯乙醇脂肪酸乙酸戊酸己酸庚酸辛酸萜类萜品烯顺式-玫瑰醚橙花醇氧化物里那醇脱氢芳樟醇4-萜烯醇α-萜品醇香茅醇β-大马士酮其他乙偶姻苯甲醛苯乙醛萘苯酚0.16 0.01 0.11 0.02 0.38 0.00 1.54 0.03 6.53 0.04 0.17 0.00 1.63 0.03 6.82 0.04 0.16 0.00 120 20 200 150 000 40 150 000蘑菇味油腻味奶油味、果香味茉莉、柠檬味奶油味、果香味0.22 50.52 0.88 0.66 0.10 0.02 0.10 18.05 0.17 1.43 0.09 0.43 0.09 19.16 0.20 1.79 0.08 0.50 200 000 10 000烘烤味、果香味玫瑰味、蜂蜜味0.00 0.65 0.00 1.38 0.00 1.48 40 41 42 43 44 200 000 300 420 3 000 500醋酸、脂肪味酸腐味、奶酪味脂肪味酸腐、奶酪味、脂肪味0.02 0.40 1.36 0.02 1.72 0.07 0.47 2.35 0.02 11.66 0.07 0.49 2.16 0.02 10.43 45 46 47 48 49 50 51 52 53 5 0.2 80 15 110 110 250 100 0.14花香荔枝花香1.08 73.07 0.19 0.87 0.52 2.15 383.15 0.48 1.05 0.51 2.06 266.66 0.44 0.99 0.47百合花香玫瑰花香花香、煮苹果味0.02 0.10 545.78 0.02 0.11 460.53 0.02 0.10 464.67 54 55 56 57 58 150 000 2 000 1奶油味、脂肪味烘烤味、苦杏仁味花香、蜜香2 304.09±38.62b 10.52±0.91b 1 839.01±33.27a 2.46±0.25b 452.10±5.57a 122 458.45±193.13c 6 477.32±23.83b 1 173.60±15.83b 3 282.57±27.47b 1 931.84±32.65c 26.85±1.50a trace 100.46±5.03a 26.56±1.00a 1 010.42±1.50a 175.41±3.06a 98 587.47±185.73b 3.85±0.22a 2 852.87±10.82ab 57.86±2.27a 242.74±6.81b 6 508.64±73.50b 5 395.57±79.02b 3 778.05±49.54b 121.50±9.32b 572.06±6.86c 62.53±1.61a 861.44±33.31c 260.41±9.63c 5.41±0.21b 14.61±0.76c 15.40±1.37b 13.08±0.75b 57.27±1.29a 73.91±3.21a 5.42±0.36a 10.25±0.49a 65.05±3.51b 531.54±12.76c 506.12±12.06c trace 22.47±1.26a 1.52±0.06b 1.43±0.14b 1 356.60±73.98a 24.99±0.27a 1 005.87±48.34b 19.41±0.38a 306.34±27.85b 558 491.01±22 039.58b 61 789.57±4 212.54a 4 195.82±337.87a 196 004.00±7 584.39a 29 35.57±23.79b 11.77±0.30b trace 62.57±5.12b 11.69±0.51b 361.04±25.35b 33.87±2.55b 213 807.25±18 752.00a 3.53±0.35ab 65 235.44±3 005.17b 8.45±0.18b 273.03±6.94a 13 756.08±307.39a 20 702.02±720.27a 13 688.98±657.07a 139.83±6.61a 986.59±32.31a 54.67±1.47b 5 831.95±136.95a 344.25±17.96a 10.73±0.67a 76.63±4.85a 38.47±2.51a 15.76±1.15a 55.57±1.19a 55.45±5.06b 4.40±0.37b 10.84±0.51a 76.41±3.24a 75 584.37±1 569.13a 75 564.39±1 569.78a 8.15±0.52b 8.40±0.34b 1.84±0.08a 1.59±0.02a AF 1 300.96±22.07a 25.85±0.97a 945.86±15.30c 19.59±1.40a 309.67±14.23b 635 989.33±23 713.16a 65 394.80±3 494.35a 4 447.47±332.38a 204 695.00±8 198.09a 3 116.78±86.86a 11.45±0.77b trace 60.62±2.85b 10.24±0.92c 383.26±18.98b 40.46±2.45b 268 479.56±12 112.56a 3.30±0.15b 74 324.99±3 185.78a 8.73±0.46b 253.54±20.79ab 14 759.15±1 071.00a 19 909.00±1 365.31a 13 585.50±142.67a 147.80±9.87a 906.04±44.26b 57.86±4.47b 5 212.70±222.61b 291.91±10.03b 10.32±0.58a 53.33±1.82b 35.53±2.42a 14.85±0.37a 51.73±3.37b 46.85±4.08c 4.67±0.40b 10.16±0.25a 64.47±3.65b 65 474.61±2 778.84b 65 451.19±2 779.28b 14.22±0.67a 5.78±0.40c 1.83±0.08a 1.59±0.022a 0.00 0.00 22.47 0.50 0.00 8.40 0.44 0.01 5.78
酯类物质是葡萄酒中仅次于高级醇的第二大类香气成分，主要包括乙酸酯和乙酯两大类，是葡萄酒果香最主要的来源，在一定的浓度范围内可提高葡萄酒的风味品质[24]。与果汁相比，酒样中的酯类物质含量较高，苹乳发酵能显著提高冰酒中酯类物质的含量（34.71%）（P＜0.05）。其中苹乳发酵中乳酸乙酯含量显著增加（P＜0.05），其增加主要与前体物质乳酸的形成有关，接入乳酸菌后，乳酸菌会代谢苹果酸产生乳酸，再与乙醇形成乳酸乙酯，给冰酒带来果香和奶油香；同时苹果酸乳酸发酵中辛酸乙酯的含量是单一酒精发酵酒样的3.2倍，这与前人研究结果相似[25]。
葡萄酒中的挥发性有机酸主要是由发酵过程中微生物（酵母和乳酸菌）代谢产生的，当其浓度过高时，会产生不愉快的酸味和臭味[26]。与果汁相比，酒样中的有机酸含量较高。本实验中共检测到了5种挥发性酸，包括乙酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸。苹果酸乳酸发酵在一定程度上增加了辛酸、己酸等脂肪酸的含量（12%、9%），可能是因为实验组在发酵前期乙酸含量较高，从而代谢生成了更多的乙酰辅酶A和脂肪酸辅酶A，最终导致辛酸、己酸等脂肪酸含量增加[13，15]。
萜类物质通常赋予葡萄酒愉悦的果香和花香，虽其含量不大，但由于阈值一般较低，因此对葡萄酒香气也有较大的贡献。萜类物质主要来源于葡萄果实，且主要以结合态的形式存在[27]。本实验中共检测出了9种萜类物质，共有4种物质的含量大于阈值，包括β-大马士酮、cis-玫瑰醚、萜品烯、里那醇，赋予冰酒愉悦的果香（荔枝）和花香。苹果酸乳酸发酵能显著增加萜类物质的总量（15.2%）。这可能是因为乳酸菌代谢释放出了糖苷酶，将糖苷态的萜类物质释放出来，从而增加了游离态萜类物质的总量[28]，提高了冰酒的品质。
2.3.2 不同发酵方式对香气OAV值的影响
OAV值是评价挥发性化合物对实际香气贡献大小所普遍采用的一个指标，一般来讲，OAV＞1，表示该化合物对葡萄酒香气有贡献[29]。虽然目前并没有关于在冰酒的高糖环境中香气阈值的文献报道，但是也可通过采用与普通葡萄酒相近酒精度中的阈值来研究冰酒中的主体呈香物质[17]。由表3冰酒香气的OAV值可以得知，冰酒中的主要呈香物质（OAV＞1）总共有20种，其中β-大马士酮（OAV＞450）是冰酒中最主要的香气物质，赋予冰酒愉悦的花香，其也被报道是加拿大威代尔冰酒中最主要的香气物质[29]；cis-玫瑰醚、苯乙醛、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯等也是冰酒主要的呈香物质，赋予冰酒愉悦的花香、果香、蜜香。发酵结束后冰酒的香气主要以花香、果香、焦糖香为主，其次为脂肪、泥土、化学、生青味。与发酵前相比，除泥土味外，其余香味在发酵结束后都明显增加。同时发酵可以明显提高冰酒的花香、果香，并降低化学味，从而提高冰酒的香气质量。
2.4 同时发酵对冰酒感官分析结果的影响
对两种发酵方式的冰酒进行感官评定，采用SigmaPlot 12.0绘制雷达图，结果见图1。由图1可知，在外观方面，实验组和对照组基本无差异，均澄清透亮，呈浅黄色带绿色色调；在香气方面，两酒样均有果香（菠萝、水蜜桃、青苹果等）、花香、蜜香、干果香，花香、果香更突出，化学味更低，但是经过苹乳发酵的香气更加纯正、清新、复杂且奔放；在口感方面，入口均甜润，经过苹乳发酵的酒样酸度更低，甜酸平衡感较好，余味持久，而仅经过酒精发酵的酒样尾味酸味突出，且略有涩感，平衡感欠佳。综合评价经过苹乳发酵的酒样的整体评分为8分，高于对照组。
图1 同时发酵（A）与酒精发酵（B）中冰酒感官品评结果雷达图
Fig.1 Radar map of sensory evaluation of ice wine by simultaneous fermentation(A)and alcoholic fermentation(B)
3 结论
以单一酒精发酵的冰酒为对照，在高糖高渗透压的威代尔冰葡萄汁中同时接种酵母菌和乳酸菌进行同时酒精-苹乳发酵，结合仪器分析和感官分析对冰酒风味进行综合评价。结果表明：同时发酵对冰酒中的还原糖、甘油、挥发酸、酒精度等无显著性的影响，能显著降低冰酒中的苹果酸、琥珀酸、柠檬酸含量，使乳酸含量显著增加50%；能显著提高冰酒中酯类物质和萜类物质含量，显著降低戊醇等高级醇类物质含量（12.19%），能提高冰酒的花香、果香、焦糖香，显著降低化学味；感官分析结果表明，苹乳发酵能增加冰酒中的果香、花香，降低冰酒酸度，提高糖酸平衡感，从而提高其整体接受度。综上所述，同时酒精、苹乳发酵能改善冰酒的风味，是一种有效降低酸度、提高冰酒质量的方法。
[1]CRANDLES M,REYNOLDS A G,KHAIRALLAH R,et al.The effect of yeast strain on odor active compounds in Riesling and Vidal blanc icewines[J].LWT-Food Sci Technol,2015,64(1)：243-258.
[2]唐柯，王蓓，马玥，等.不同酵母与温度发酵的威代尔冰葡萄酒有机酸分析[J].食品与发酵工业，2015，41（8）：153-158.
[3]GALLANDER J F.Effect of time of bacterial inoculation on the stimulation of malolactic fermentation[J].Am J Enol Viticult,1979,30(2)：157-159.
[4]FIA G,ROSI I,CANUTI V.Influence of different pH values and inoculation time on the growth and malolactic activity of a strain ofOenococcus oeni[J].Aust J Grape Wine Res,2003,9(3)：194-199.
[5]马玥.威代尔冰葡萄酒关键香气组分及其对冰酒感官贡献的研究[D].无锡：江南大学，2015.
[6]REGMI U,PALMA M,BARROSO C G.Direct determination of organic acids in wine and wine-derived products by Fourier transform infrared(FT-IR)spectroscopy and chemometric techniques[J].Analytica Chimica Acta,2012,732：137-144.
[7]JIN Q,CHEN L,LI Z,et al.Effect of diammonium phosphate supplementation on the amino acid metabolism during fermentation and sensory properties of fresh spine grape(Vitis davidiiFoex)wine[J].Food Sci Biotechnol,2015,24(6)：2051-2057.
[8]CAI J,ZHU B,WANG Y,et al.Influence of pre-fermentation cold maceration treatment on aroma compounds of Cabernet Sauvignon wines fermented in different industrial scale fermenters[J].Food Chem,2014,154(2)：217.
[9]YANG Y,XIA Y,WANG G,et al.Effect of mixed yeast starter on volatile flavor compounds in Chinese rice wine during different brewing stages[J].LWT-Food Sci Technol,2017,78：373-381.
[10]YU H,ZHAO J,LI F,et al.Characterization of Chinese rice wine taste attributes using liquid chromatographic analysis,sensory evaluation,and an electronic tongue[J].J Chromatogr B,2015,997：129-135.
[11]NURGEL C,PICKERING G J,INGLIS D L.Sensory and chemical characteristics of Canadian ice wines[J].J Sci Food Agr,2004,84(13)：1675-1684.
[12]ALEXANDRE H,COSTELLO P J,REMIZE F,et al.Saccharomyces cerevisiae-Oenococcus oeniinteractions in wine：current knowledge and perspectives[J].Int J Food Microbiol,2004,93(2)：141-154.
[13]CHEN D,LIU S.Transformation of chemical constituents of lychee wine by simultaneous alcoholic and malolactic fermentations[J].Food Chem,2016,196：988-995.
[14]FLEET G.Yeast interactions and wine flavor[J].Int J Food Microbiol,2003,86(1-2)：11-22.
[15]TANIASURIF,LEE PR,LIU S Q.Induction of simultaneous and sequential malolactic fermentation in durian wine[J].Int J Food Microbiol,2016,230：1-9.
[16]李华，王华，袁春龙.葡萄酒工艺学[M].北京：科学出版社，2007：107-108.
[17]MA Y,TANG K,XU Y,et al.Characterization of the key aroma compounds in Chinese Vidal icewine by gas chromatography-olfactometry,quantitative measurements,aroma recombination,and omission tests[J].J Agr Food Chem,2017,65(2)：394-401.
[18]JIANG B,ZHANG Z,Volatile compounds of young wines from cabernet sauvignon,cabernet gernischet and chardonnay varieties grown in the loess plateau region of China[J].Molecules,2010,15(12)：9184-9196.
[19]TAO Y,LI Z.Intensity prediction of typical aroma characters of Cabernet Sauvignon wine in Changli County(China)[J].LWT-Food Sci Technol,2010,43(10)：1550-1556.
[20]GÓMEZ-MÍGUEZ M J,CACHO J F,FERREIRA V,et al.Volatile components of Zalema white wines[J].Food Chem,2007,100(4)：1464-1473.
[21]NOGUEROL-PATO R,M GONZÁLEZ-ÁLVAREZ,C GONZÁLEZBARREIRO,et al.Aroma profile of Garnacha Tintorera-based sweet wines by chromatographic and sensorial analyses[J].Food Chem,2012,134(4)：2313-2325.
[22]GUTH H.Quantitation and sensory studies of character impact odorants of different white wine varieties[J].J Agr Food Chem,1997,45(8)：3027-3032.
[23]MAARMAN B C.Interaction between wine yeast and malolactic bacteria and the impact on wine aroma and flavor[D].Cape town：Stellenbosch University,2014.
[24]SWIEGERS J H,BARTOWSKY E J,HENSCHKE P A,et al.Yeast and bacterial modulation of wine aroma and flavor[J].Aust J Grape Wine Res,2005,11(2)：139-173.
[25]BOIDO E,MEDINA K,FARINA L,et al.The effect of bacterial strain and aging on the secondary volatile metabolites produced during malolactic fermentation of tannat red wine[J].J Agr Food Chem,2009,57(14)：6271-6278.
[26]SÁNCHEZ-PALOMO E,GÓMEZ GARCÍA-CARPINTERO E,ALONSO-VILLEGAS R,et al.Characterization of aroma compounds of Verdejo white wines from the La Mancha region by odour activity values[J].Flavour Fragr J,2010,25(6)：456-462.
[27]D'INCECCO N,BARTOWSKY E,KASSARA S,et al.Release of glycosidically bound flavour compounds of Chardonnay byOenococcus oeni during malolactic fermentation[J].Food Microbiol,2014,21(3)：257-265.
[28]HERNANDEZ-ORTE P,CERSOSIMO M,LOSCOS N,et al.Aroma development from non-floral grape precursors by wine lactic acid bacteria[J].Food Res Int,2010,42(7)：773-781.
[29]BOWEN A J,REYNOLDS A G.Odor potency of aroma compounds in Riesling and Vidal blanc table wines and icewines by gas chromatography-olfactometry-massspectrometry[J].J Agr Food Chem,2012,60(11)：2874-2883.