番石榴为桃金娘科植物番石榴（Psidium guajava L.）的果实，产于热带或亚热带地区，我国广东、广西、福建等地多有种植[1]。番石榴具有极高的食用和药用价值，其果实、叶、根等不同部位均可以入药[2-6]；番石榴果实多汁，味道酸甜，风味特异，富含维生素C、多酚和黄酮类等多种生物活性物质[7-10]，具有收敛止泄、调节消化功能、广谱抗菌、抗氧化等功效。
番石榴果实皮嫩，易破损，采后易失水，不耐贮存，因此，亟需开发番石榴深加工产品，以期提高番石榴的利用效率[11-12]。目前，国内番石榴加工产品稀缺，市面上仅有番石榴饮料产品颇为常见，然而其番石榴果肉含量低，产品单一，不能满足消费者对产品营养、口味和功能等多方面的需求。近年来，酸乳因其营养丰富、整肠功效明显，已经成为消费者餐桌必不可少的乳制品，研究证实长期食用酸乳具有维持肠道菌群平衡、提高免疫力等功效[13-16]。MALDONADO RR等[17]对比4种热带水果对乳酸菌发酵的影响，研究发现番石榴果浆和芒果浆均能促进乳酸菌的生长和繁殖，并且其制成的发酵饮料具有较好的色、香、味；李晓乐等[18]研究巴氏杀菌、乳酸菌发酵等工艺对番石榴果浆中多酚类物质的影响，发现经巴氏杀菌后番石榴果浆中新产生五种酚类物质，经乳酸菌发酵后番石榴果浆中新产生二种酚类物质和另外两种生物活性物质，其研究为番石榴果浆在酸乳中的应用提供了理论支持。
本研究将番石榴果浆与牛乳进行混合发酵制备番石榴酸乳，采用响应面优化法和模糊数学评价法优化番石榴酸乳的制作工艺，并利用回归模型、矩阵模型、感官评价、产品检测等多种分析方式研究番石榴酸乳的感官品质，为番石榴的加工应用提供新思路，也为功能性酸乳的开发提供新研究依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红心番石榴：购自广西玉林；鲜牛乳：上海广泽食品科技股份有限公司；精幼砂糖、酸奶发酵剂：安琪酵母股份有限公司；琼脂粉：国药集团化学试剂北京有限公司；牛肉粉、蛋白胨：北京奥博星生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
CRS300实验室乳化机：上海驰翔新能源设备科技有限公司；JJ2B组织捣碎匀浆机：常州荣华仪器制造有限公司；GNP9080恒温培养箱：常州菲普实验仪器厂；HH-W 600电热恒温水浴箱：金坛市医疗仪器厂；SW-CJ-1D超净工作台：苏州净化设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程
1.3.2 操作要点
番石榴果浆的制备：挑选新鲜、外表为绿色的番石榴，清洗干净，去皮去籽，保留红色果肉，使用组织捣碎匀浆机8 000 r/min处理10min，制成可溶性固形物含量为8.73%的番石榴果肉原浆[19]。
调配：在鲜牛乳中添加番石榴果浆15%～25%，再向其中加入砂糖8%，搅拌至砂糖溶解。
乳化和杀菌：使用高速乳化机1 200 r/min处理乳液20m in，然后将乳液加热至85℃，保温杀菌6m in。
接种和发酵：杀菌处理后，乳液立即冷却至42℃。将酸奶发酵剂从冷冻条件下置于室温20min后加入乳液中，酸奶发酵剂（保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌=2∶1）添加量为0.1%，搅拌均匀，将乳液置于恒温培养箱中，在42℃条件下，发酵8～12 h[20]。
后熟和成品：待乳液由流动的液态变为凝固态后，将其置于冷藏4℃条件下，进行后熟12～24h，即制成番石榴酸奶。
1.3.3 番石榴酸乳制作工艺条件的确定
在前期单因素试验基础上，以乳清析出率和感官评价为响应值，采用响应面优化设计法和模糊数学评价法研究番石榴果浆添加量（A）、发酵时间（B）和后熟时间（C）3个因素对番石榴酸乳感官品质的影响，进而确定番石榴酸乳制作工艺条件。利用响应面应用软件Design Expert对番石榴酸乳的工艺条件进行优化设计，具体因素与水平见表1[21-22]。
表1 番石榴酸乳工艺条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for process conditions optim ization of guava yogurt
水平 A番石榴果浆添加量/% B发酵时间/h C后熟时间/h-1 0 1 15 20 25 8 10 12 12 18 24
1.3.4 番石榴酸乳感官品质评价方法
番石榴酸乳感官评价方法参考GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》，挑选食品类专业从业人员10人（男女各5人）组成感官评价小组，分别对番石榴酸乳从色泽、组织状态、口感和风味三个方面进行感官品质综合评分；每个酸乳样品的感官综合评分结果为去掉一个最高分和去掉一个最低分后所有分数求和的平均值，具体评分标准见表2[23-24]。
表2 番石榴酸乳感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standard of guava yogurt
项目 评分标准 分值与等级色泽组织状态口感和风味颜色淡红色或淡粉色，色泽均匀颜色较深或较淡，色泽不均匀特有颜色不明显或颜色分层明显凝乳组织细腻、黏稠性好，没有或只有微量乳清析出凝乳组织较细腻、黏稠性较好，有少量乳清析出凝乳组织粗糙，有大量乳清析出具有番石榴特有的清香风味，口感滑润、酸甜适口特有风味较淡，口感较润滑、酸甜较适口特有风味淡薄，口感粗糙、酸甜不适口25～30优20～24中≤19差30～40优20～29中≤19差25～30优20～24中≤19差
1.3.5 番石榴酸乳模糊数学评价法
本研究选择番石榴酸乳的色泽、组织状态、口感和风味为因素集，确定评语集为优、中、差，根据番石榴酸乳各样品感官评价结果，建立3个单因素矩阵模型，利用模糊数学评价法对矩阵模型进行分析[25-27]。
因素集U=｛色泽u1，组织状态u2，口感和风味u3｝；评语集V=｛优v1，中v2，差v3｝。因素集｛u1，u2，u3｝中三个评价因素（色泽、组织状态、口感和风味）的权重系数集K=｛k1，k2，k3｝根据番石榴酸乳感官评价标准确定。
模糊数学评价模型Y=K×X，其中Y评价集，K为权重系数，X为模糊矩阵。采用响应面优化设计进行试验制成的17个番石榴酸乳样品，根据表2中三项感官评分标准，由感官评价小组对番石榴酸乳样品进行评分，并确定样品每项得分所隶属的等级，然后将所有样品的得分结果采用归一化处理，得到17个三阶模糊矩阵X i（其中i为样品编号）。
1.3.6 乳清析出率的测定
乳清析出是酸乳加工常见的质量问题，是乳液体系不稳定的表现之一。采用直接称量法测定番石榴酸乳样品的乳清析出率[28]，计算公式如下：
式中：m1为番石榴酸乳样品中的乳清质量，g；m2为番石榴酸乳样品的质量，g。
1.3.7 番石榴酸乳理化性质及微生物检测
番石榴酸乳蛋白质含量的检测方法参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法；脂肪含量的检测方法参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中碱水解法，酸度值的检测方法参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》中电位滴定法；番石榴酸乳微生物限量检测分别参照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》中平板计数法、GB 4789.10—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》中定性检验、GB 4789.4—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》，即对酸乳样品中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等致病菌进行检测；番石榴酸乳中乳酸菌活菌数检测参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》。
2 结果与分析
2.1 番石榴酸乳工艺条件响应面优化结果分析
2.1.1 回归模型的建立和显著性验证
以番石榴果浆添加量（A）、发酵时间（B）和后熟时间（C）为研究因素，以乳清析出率（R1）和感官评价（R2）为响应值，进行响应面优化设计，试验结果取3次重复试验结果的平均值，响应面优化试验结果见表3。
表3 番石榴酸乳工艺条件优化响应面试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of response surface experiments for process conditions optim ization of guava yogurt
试验号A番石榴果浆添加量/%B发酵时间/h C后熟时间/h R1乳清析出率/%R2感官评价/分1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 15 15 20 20 20 20 20 15 25 20 20 25 25 20 25 15 20 12 10 12 8 10 8 10 10 8 10 10 10 12 12 10 8 10 18 12 12 24 18 12 18 24 18 18 18 24 18 24 12 18 18 6.93 4.42 6.85 1.97 1.14 3.95 1.28 1.73 2.02 0.93 1.02 1.76 5.38 6.52 2.88 2.23 1.09 61.88 73.73 67.24 87.59 89.21 73.18 87.92 86.23 85.83 87.56 89.08 91.66 73.32 69.34 85.64 76.31 88.62
利用Design Expert对试验数据进行拟合，得到三元二次回归方程：
对回归方程进行方差分析，结果如表4所示。
表4 番石榴酸乳工艺条件优化响应面试验方差分析
Table 4 Variance analysis of response surface experiments for process conditions optim ization of guava yogurt
注：“**”表示因素对结果影响为极显著（P＜0.01）；“*”表示因素对结果影响为显著（P＜0.05）。
方差来源模型A B C A B AC BC A2 B2 C2残差失拟项净误差总和74.82 1.34 30.07 4.68 0.45 0.62 0.68 0.90 28.17 5.51 0.40 0.34 0.069 75.22 R2=0.987 7 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 1 6 CV=7.85 8.31 1.34 30.07 4.68 0.45 0.62 0.68 0.90 28.17 5.51 0.058 0.11 0.017 143.8 23.12 520.17 80.99 7.77 10.66 11.77 15.51 487.28 95.32 6.48 1 391.22 183.36 326.78 153.39 0.92 10.50 37.88 18.26 612.42 18.22 5.16 3.09 2.07 1 396.39 R2=0.991 6 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 1 6 CV=1.06 154.58 183.36 326.78 153.39 0.92 10.50 37.88 18.26 612.42 18.22 0.74 1.03 0.52 209.67 248.70 443.24 208.05 1.25 14.24 51.38 24.77 830.66 24.71 1.99＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.300 4 0.007 0 0.000 2 0.001 6＜0.000 1 0.001 6 0.258 2乳清析出率/%平方和 自由度 均方值 F值感官评价/分平方和 自由度 均方值 F值 P值P值＜0.000 1 0.001 9＜0.000 1＜0.000 1 0.027 0 0.013 8 0.011 0 0.005 6＜0.000 1＜0.000 1 0.051 4
由表4可知，方程一次项A（番石榴果浆添加量）、B（发酵时间）和C（后熟时间）对响应值R1（乳清析出率）、R2（感官评价）的影响均为极显著，各因素对番石榴酸乳乳清析出率影响程度的主次顺序为B＞C＞A，其中发酵时间对番石榴酸乳样品的乳清析出率影响最大；同时，各因素对番石榴酸乳感官评价影响程度的主次顺序为B＞A＞C，同样是发酵时间对番石榴酸乳样品的感官质量影响最大。回归方程二次项A2、B2、C2对响应值R1、R2的影响均为极显著；交互项AB、AC、BC对R1的影响均为显著（P＜0.05），交互项AC、BC对R2的影响为极显著（P＜0.01），而交互项AB对R2的影响不显著（P＞0.05）。根据试验结果可以得出，3因素A、B、C与响应值R1、R2不是单纯的线性关系，模型中三元二次回归关系为极显著（P＜0.01），两个回归方程模型的相关系数分别为0.987 7和0.991 6，变异系数分别为7.85和1.06，失拟项P值均大于0.05，即失拟不显著，表明回归方程模型能够较好的反应各因素与响应值之间的关系，利用回归方程可以得到优化番石榴酸乳品质的最优工艺条件。
2.1.2 各因素交互作用及预测结果验证
根据响应面优化设计得到多元回归方程，分别建立各试验因素与番石榴酸乳乳清析出率和感官评价的三维曲面图，确定最低乳清析出率和最高感官评价的番石榴酸乳制作工艺，如图1和图2所示。
图1 各试验因素交互作用对番石榴酸乳乳清析出率影响的响应面及等高线
Fig.1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on whey separation rate
图2 各试验因素交互作用对番石榴酸乳感官评价影响的响应面及等高线Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory evaluation
由图1可知，番石榴果浆添加量、发酵时间和后熟时间三者之间的交互作用对番石榴酸乳乳清析出率的影响为显著（P＜0.05），图中曲面较为陡峭。由图2可知，番石榴果浆添加量和后熟时间以及发酵时间和后熟时间的交互作用对番石榴酸乳感官评价的影响为极显著（P＜0.01），图中曲面陡峭，而番石榴果浆添加量与发酵时间的交互作用对番石榴酸乳感官评价的影响不显著（P＞0.05），图中曲面平缓，这与表4方差分析结果一致。
通过回归模型分析，以乳清析出率为响应值的最佳发酵工艺条件组合的预测回归模型为番石榴果浆添加量17.70%，发酵时间9.18 h，后熟时间20.22 h，在此工艺条件下，模型预测酸乳样品的乳清析出率为0.78%。以感官评价为响应值的最佳发酵工艺条件组合的预测回归模型为番石榴果浆添加量24.15%，发酵时间9.00h，后熟时间20.22 h，在此工艺条件下，模型预测酸乳样品的感官评价为92.87分。综合考虑上述优化试验结果，结合实际操作条件，选择番石榴酸乳制作工艺条件为番石榴果浆添加量20%，发酵时间9 h，后熟时间20 h，在此条件下进行3次验证试验，得到番石榴酸乳的乳清析出率为0.67%，感官评分为92.53分。
2.2 模糊数学评价法分析
根据表2感官评分标准，感官评价小组（10人）对番石榴酸乳样品进行感官评价及投票，具体结果见表5。
表5 番石榴酸乳感官评价结果
Table 5 Sensory evaluation results of guava yogurt
样品号1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 4 4 5 6 6 5 5 5 8 6 6 7 6 5 7 4 6 5 6 4 3 4 4 5 4 2 3 4 3 4 4 2 5 3 3 6 2 8 7 6 8 7 6 8 8 9 2 2 7 6 8 3 3 4 2 3 3 2 2 4 2 1 1 3 5 3 3 1 3 4 3 5 7 6 7 6 8 8 9 9 2 2 6 5 6 3 4 4 4 3 3 2 4 1 2 1 1 2 3 3 5 3 4 2 3 1 0 1 1 0 1 0 0 0 6 5 1 0 1色泽优 中组织状态优 中口感和风味优中差1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 4 1 4 0 0 1 0 1 0 0 1 0 5 3 0 1 1差差
在番石榴酸乳样品的感官评价投票结果中，以样品1色泽为例，4人选择优，5人选择中，1人选择差，因此得到x色泽=（0.4，0.5，0.1）；同理得到x组织状态=（0.3，0.3，0.4）、x口感和风味=（0.3，0.4，0.3），所以样品1的评价模糊矩阵为X1=
，同理可以得到样品2～17的评价模糊矩阵：
2.3 建立模糊数学综合评价集
根据模糊数学评价模型Y=K×X，其中权重系数K根据表2番石榴酸乳感官评分标准确定[29-30]，感官评价项目色泽、组织状态、口感和风味的总分值分配分别为30分、40分、30分，因此，色泽、组织状态、口感和风味的权重系数相应为0.3、0.4、0.3，总和为1，即番石榴酸乳模糊数学评价模型的权重系数K=（0.3，0.4，0.3）。
同理得到：Y2=（0.48，0.42，0.10），Y3=（0.32，0.37，0.31），Y4=（0.65，0.29，0.06），Y5=（0.67，0.33，0），Y6=（0.57，0.33，0.10），Y7=（0.68，0.29，0.03），Y8=（0.61，0.32，0.07）；Y9=（0.72，0.25，0.03）；Y10=（0.82，0.23，0.03）；Y11=（0.77，0.19，0.04）；Y12=（0.84，0.16，0）；Y13=（0.32，0.30，0.38）；Y14=（0.29，0.41，0.30）；Y15=（0.67，0.27，0.06）；Y16=（0.51，0.42，0.07）；Y17=（0.68，0.22，0.10）。
为得到模糊数学评价的总分，划分感官评价等级分值区间为：优81～100分，中61～80分，差为41～60分，因此建立感官评价评语集V=（81，61，41），则番石榴酸乳模糊数学评价总分为Ti=Yi×V（i=1，2，3，…，17），因此，T1=Y1×V=（0.33，0.39，0.28）×（81，61，41）=62.0，同理，T2=68.6，T3=61.2，T4=72.8，T5=74.4，T6=70.4，T7=74.0，T8=71.8，T9=74.8，T10=81.68，T11=75.6，T12=77.8，T13=59.8，T14=60.8，T15=73.2，T16=69.8，T17=72.6。
根据上述计算结果可以发现，样品号10的模糊数学评价总分81.68分，属于等级优；样品号13的模糊数学评价总分59.8分，属于等级差；其他样品总分值在61～81之间，均属于等级中。17个番石榴酸乳样品模糊数学评价优劣排序为10号＞12号＞11号＞9号＞5号＞7号＞15号＞4号＞17号＞8号＞6号＞16号＞2号＞1号＞3号＞14号＞13号。
采用模糊数学评价法计算得到的最高分样品（10号），其工艺条件与响应面优化法（以乳清析出率为考查指标）的试验结果相同；模糊数学评价法计算得到的次高分样品（12号）其工艺条件与响应面优化法（以感官评价为考查指标）的试验结果一致。因此，利用模糊数学评价法对影响番石榴酸乳品质的工艺条件（番石榴果浆添加量、发酵时间、后熟时间）进行计算和分析，能够降低人为主观因素影响，适合区分多样品感官质量评价差异。本研究发现，模糊数学评价法能够体现番石榴酸乳样品的客观品质，兼具体现评价者的感官体验，进而从不同角度验证了试验结果的准确性。
2.4 理化性质及微生物检测结果
根据响应面优化试验得到的番石榴酸乳制作工艺（番石榴果浆添加量20%，发酵时间9 h，后熟时间20 h）制成番石榴酸乳，其感官评分为92.53分，乳清析出率为0.67%。检测发现，番石榴酸乳蛋白质含量2.46 g/100 g、脂肪含量2.58 g/100 g，酸度82.71 °T，乳酸菌数为1.90×106 CFU/g，大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等致病菌均未检出。由于番石榴果肉脂肪含量低（0.41%），所以制成的番石榴酸乳是一种低脂发酵乳；番石榴酸乳的其他指标均符合GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》和GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》。
3 结论
本研究采用响应面优化设计结合模糊数学评价法优化番石榴酸乳工艺条件，利用感官评价、回归模型分析、矩阵模型分析等多种方式研究优化条件对番石榴酸乳品质的影响，使试验结果更具可靠性。结果表明，利用响应面设计的最优工艺条件制备的番石榴酸乳，其感官品质评价结果与模糊数学评价得到的最优结果基本一致；研究确定番石榴酸乳最适宜工艺条件：番石榴果浆添加量20%，砂糖添加量8%，发酵温度42℃，发酵时间9 h，后熟时间20 h，其成品感官评分92.53分，乳清析出率0.67%，蛋白质含量2.46 g/100 g，脂肪含量2.58 g/100 g，酸度82.71 °T，乳酸菌数为1.90×106 CFU/g，致病菌未检出；酸乳呈均匀的淡红色，酸甜可口并具有番石榴独特风味，是一种营养丰富、外观诱人、风味特异的新型发酵乳制品。
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