黑糯米酒在我国有着悠久的酿造和饮用历史，其富含矿物质元素、γ-氨基丁酸和黄酮类化合物等，具有预防老年痴呆等功效[1]。此外，黑糯米酒中的花色苷类物质增强了黑糯米酒的抗氧化能力，同时也使得黑糯米酒的颜色与众不同[2]。
目前，对于花色苷测定方法的研究较多，其中以pH示差法、单一pH法和差减法的应用较为普遍，但精密度差异较大。翦祎等[3]比较了以上3种方法测定干红葡萄酒花色苷结果的差异性，发现3种方法的测定结果无显著差异。唐琳等[4]对单一pH法和pH示差法测定玫瑰花花色苷的方法进行了研究，发现单一pH法受溶剂影响较大，测定时必须在同一溶剂中进行；pH示差法的准确性较高，但测定时要保证样品吸光度值在0.2以上。霍琳琳等[5]比较了直接分光光度法和pH示差法，发现两种方法无显著差异。花色苷测定方法的选定是花色苷后续研究的基础，以黑糯米酒花色苷为研究对象，通过对以上3种测定方法进行综合比较，得到黑糯米酒花色苷测定最佳方法和最优条件，给后续黑糯米花色苷测定提供一些有益的参考。
由于在黑糯米酒的发酵、陈酿以及贮藏等过程中，其花色苷种类和含量会随发酵微环境、介质温度、外界光照等变化而发生改变，而且花色苷的组成较为复杂，其最大吸收波长始终处于动态变化的过程中，因此，一般均选用花色苷标准品来表示黑糯米酒中总花色苷含量。矢车菊素在自然界中分布最为广泛且含量最为丰富[6]，相关研究表明，黑糯米种皮中富含矢车菊-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside），而且矢车菊素在黑糯米酒中含量较高[7-8]，因此以矢车菊-3-O-葡萄糖苷为标准品来表示黑糯米酒总花色苷。通过对黑糯米酒花色苷的测定方法的研究，以期得到一种适合黑糯米酒总花色苷测定的方法，对更深入地研究花色苷有着重要的意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑糯米、酒曲：贵州永红酒厂提供；黑糯米酒：实验室自酿。
柠檬酸、柠檬酸三钠、亚硫酸钠、酒石酸钾钠（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；氯化钾、三水合乙酸钠、氢氧化钠、葡萄糖（分析纯）：广州化学试剂厂；盐酸（分析纯）：大丰市俐科发特种化学试剂厂；矢车菊-3-O-葡萄糖苷标准品：北京世纪奥科生物技术有限公司。
缓冲液（pH 0.5～2.0：将HCl逐滴滴入0.1mol/L柠檬酸；pH 0.8缓冲液0.2mol/L KCl∶0.3mol/L HCl=29∶40；pH 4.5缓冲液0.2mol/L NaAc·3H2O：0.2mol/LHAc=1∶1；pH 3.0缓冲液0.1mol/L柠檬酸∶0.1mol/L柠檬酸钠=82∶18；pH 4.0缓冲液0.1mol/L柠檬酸∶0.1mol/L柠檬酸钠=59：41；pH 5.0缓冲液0.1mol/L柠檬酸∶0.1mol/L柠檬酸钠=35∶65；pH 6.0缓冲液0.1mol/L柠檬酸∶0.1mol/L柠檬酸钠=12∶88）。
1.2 仪器与设备
TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；SP-02恒温培养箱：黄石市恒丰医疗器械有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：上海泰坦科技股份有限公司；PB-10酸度计：赛多利斯科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 黑糯米酒花色苷测定波长的选定
配制质量浓度为500mg/L的矢车菊-3-O-葡萄糖苷标准溶液，从中吸取1m L用去离子水稀释6倍，再吸取1m L稀释后溶液并用pH 0.8缓冲液定容至10m L。以pH 0.8缓冲液作为空白，于波长350～710 nm区间对酒样进行全波段扫描，确定其最大吸收波长，并测定吸光度值。
1.3.2 测定条件选定
缓冲液pH的选定：在11支比色管中各加入1m L的酒样，再加入9m L pH为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0的缓冲溶液，30℃恒温水浴平衡40m in后，以去离子水作为空白，测定其最大吸收波长处吸光度值。
平衡温度和平衡时间的选定：向6个100m L容量瓶中加入酒样10m L，其中3个容量瓶中加入pH 0.8缓冲溶液并定容至100m L，另外3个容量瓶中加入pH4.5缓冲溶液并定容至100m L。分别置于20℃、30℃、40℃的水浴锅中，每隔20min在波长511 nm条件下测定吸光度值。
1.3.3 矢车菊-3-O-葡萄糖苷标准曲线的绘制
将500mg/L的花色苷标准品溶液用去离子水分别稀释2、4、6、8、10、20、40倍（质量浓度分别为250mg/L、125mg/L、83.33mg/L、62.5mg/L、50mg/L、25mg/L、12.5mg/L），从中各吸取1m L并用pH 0.8缓冲液定容至10m L，在30℃恒温水浴平衡40min，以pH 0.8的缓冲溶液作为空白，在波长350～710 nm区间对样品进行全波段扫描，并记录曲线。在最大吸收波长处测定吸光度值，绘制标准曲线。
1.3.4 3种方法测定黑糯米酒总花色苷
pH示差法：分别量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0m L酒样于10个10mL容量瓶中，设A、B两组平行。A组：加入pH 0.8的缓冲液并定容，B组：加入pH 4.5的缓冲液并定容。于30℃恒温水浴平衡40min后，以去离子水作为空白，在波长511 nm和700 nm处测定其吸光度值[9-10]。
单一pH法：分别量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0m L酒样于10个10m L容量瓶中，再用pH 0.8缓冲液定容。于30℃恒温水浴平衡40m in后，以去离子水作为空白，在波长511 nm和700 nm处测定吸光度值。
差减法：分别量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0m L酒样于10个10m L容量瓶中，再用pH 0.8的缓冲液定容。另外量取上述相同体积的酒样于10个10m L容量瓶中，添加0.8m L20%的Na2SO3溶液，再用pH 0.8的缓冲液定容至10m L。置于30℃水浴锅中平衡40min后，以去离子水作为空白，在波长511 nm和700 nm处测定吸光度值。
1.3.5 总花色苷计算方法
pH示差法[9-10]测定花色苷含量公式：
式中：A=Aλmax；M w为矢车菊-3-O-葡萄糖苷分子量，449.38g/mol；DF为稀释倍数；ε为矢车菊-3-O-葡萄糖苷摩尔消光系数，26 900 L/（mol·cm）-1；I为比色杯光程/1cm；A1和A2分别为使用亚硫酸钠漂白前和漂白后所测得的酒液吸光度值；k为用矢车菊-3-O-葡萄糖苷绘制的标准曲线斜率。
1.3.6 黑糯米酒酒精含量对测定结果的影响
用无水乙醇配制酒精含量为20%vol、40%vol、60%vol、80%vol、100%vol的酒精溶液。分别吸取1m L酒样于18个10m L容量瓶中，各加入1m L上述酒精，并分为A、B、C共3组，每组6个。向A组和B组容量瓶中分别加入pH 0.8和pH 4.5的缓冲液并定容，向C组中先添加0.8m L 20%亚硫酸钠溶液，再用pH 0.8的缓冲溶液定容。将这18个容量瓶放入30℃水浴锅中，40min后，以去离子水作为空白，于波长511 nm和700 nm处测定吸光度值。
1.3.7精密度和加标回收率试验
吸取2m L酒样于3个20m L容量瓶中，往其中2个容量瓶中分别加入pH 0.8和pH 4.5的缓冲溶液并定容，向剩下1支容量瓶先加入1.6m L 20%的亚硫酸钠溶液，再用pH 0.8缓冲液定容。于30℃恒温处理40m in后，以去离子水为空白，于波长511 nm和700 nm处测定吸光度值。
分别从已知花色苷浓度黑糯米酒中吸取1m L至两个容量瓶里，然后用pH 0.8的缓冲溶液定容至10m L，向其中一个容量瓶中再添加1m L稀释6倍的矢车菊-3-O-葡萄糖苷标准品溶液，于30℃恒温处理40min，以去离子水作为空白，于波长511 nm和700 nm处测定吸光度值。
2 结果与分析
2.1 黑糯米酒花色苷的光谱特性
图1 矢车菊-3-O-葡萄糖苷的紫外可见吸收光谱图
Fig.1 UV-visible absorption spectra of cyanidin-3-O-glucoside
从图1可以看出，波长350～511 nm处吸光度值不断增大，直至511 nm附近趋于稳定；波长511～600 nm处吸光度显著降低，波长600～710 nm处吸光度值基本保持在0附近。当波长为511 nm附近时，矢车菊-3-O-葡萄糖苷出现强烈的吸收峰（吸光度值为0.402），因此选定最大吸收波长λmax=511 nm作为黑糯米酒花色苷的测定波长。卢钰等[11-12]也选用矢车菊-3-O-葡萄糖苷为标样，最大吸收波长为520 nm。
2.2 测定条件选定
2.2.1 缓冲液pH的选定
由于自身结构特性，花色苷只有在pH＜7的环境中保持稳定，故仅需考察缓冲溶液pH＜7的条件下花色苷的吸光度值[3]。从图2可以看出，在pH=0.8时吸光度值最高，在pH=4.5时所测得的吸光度值最低，pH＞4.5时所测得吸光度值基本不变，原因可能是pH＞4.5时花色苷在波长511 nm处无吸收并且转化成无色结构。pH示差法中，两个pH条件下的吸光度值差距最大且能保持稳定，通过这两个示差pH可计算得到花色苷含量[13]。黑糯米酒花色苷在pH值为0.8和4.5时的吸光度值的差值是最大的，并且在pH 0.8和pH 4.5左右的吸光度浮动较小，所以本实验选择缓冲液pH 0.8和pH 4.5来检测黑糯米酒样品花色苷的吸光度值。
图2 缓冲液pH值对花色苷的影响
Fig.2 Effect of buffer solution pH on anthocyanin
2.2.2 平衡温度和平衡时间的选定
花色苷溶液加入pH缓冲液后，需要放置一段时间，待达到平衡之后方可用于检测[14]。研究显示，花色苷在高于40℃的介质中稳定性很差[15]，所以选择在低于40℃条件下进行平衡。
图3 pH值为0.8（A）、pH值为4.5（B）时平衡温度、时间对花色苷影响
Fig.3 Effect of equilibrium temperature and time on anthocyanin at pH 0.8(A)and 4.5(B)
由图3可知，在pH 0.8的缓冲介质中，20℃和30℃条件下，样品的吸光度值随时间延长整体呈上升趋势，40min后慢慢趋于平缓，其中30℃条件下的吸光度值始终高于20℃的吸光度值。40℃条件下吸光度值随着时间延长吸光度值先增加，但在40min时达到平衡后减少，60min后趋于平缓。在pH 4.5缓冲介质中，20℃、30℃、40℃条件下的吸光度值随着时间延长整体呈下降趋势，分别在60min、40min和60m in后逐渐趋于平缓。其中，在40℃条件下，20m in时达到平衡一段时间后继续呈下降趋势，可能是由于花色苷被O2氧化，从而影响了吸光度值。
综上所述，当3个温度最后达到平衡时，黑糯米酒花色苷在30℃条件下，在不同pH值缓冲液的吸光度差值最大且最稳定，并于40min时基本呈稳定状态，因此平衡温度和时间选定为30℃、40min。
2.3 标准曲线的绘制
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准曲线方程为y=0.044 9x+0.02，R2=0.996 4，表明矢车菊-3-O-葡萄糖苷质量浓度在11.39～221.72mg/L范围内，与溶液的吸光度值呈现良好的线性相关。
2.4 3种总花色苷测定方法的比较
由图4可知，3种测定方法曲线均呈现出良好的线性相关，相关系数（R2）均大于0.99，表明3种方法都可以检测黑糯米酒中的总花色苷。
图4 pH示差法（A）、单一pH法（B）、差减法（C）测总花色苷含量比较
Fig.4 Comparison of totalanthocyanin content determ ined by pH differentialmethod(A),single pH method(B)and subtraction method(C)
2.5 酒液pH对测定结果的影响
由图5可知，酒液pH为4时，3种方法所测得的花色苷吸光度值均为最大值，并且酒液pH4附近时所测得的吸光度值差距很小。酒液pH为1和6时，3种方法所测得的吸光度值低于其他pH条件下吸光度值。综上所述，用3种方法测定酒液样品吸光度值时，首先要保证所测的酒液样品pH在4附近（pH为3～5）。经测定，所用黑糯米酒的pH值为3.70，在其范围内，因此不需调整pH。
图5 酒液pH值对3种方法测定结果的影响
Fig.5 Effectofwine pH on determ ination results of three kinds ofmethods
2.6 黑糯米酒乙醇体积分数对测定结果的影响
由图6可知，3种方法所得结果的曲线没有明显的变化趋势，而且差距不大。单一pH法、pH示差法、差减法测定黑糯米酒花色苷吸光度值的标准偏差依次为0.010、0.009 9、0.004 4。可见黑糯米酒中的酒精含量基本不影响测定结果的准确性，可以不计加热时乙醇挥发对测定结果带来的影响。
图6 酒精含量对3种方法测定结果的影响
Fig.6 Effect of alcohol content on determ ination results of three kinds ofmethods
2.7 3种方法精密度试验
采用优化后pH示差法、单一pH法和差减法对样品重复测6次，从表1可知，其相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为0.83%、1.60%和1.24%，表明这3种方法测定黑糯米酒花色苷的精密度良好，其中pH示差法精密度最高。
单一pH法比另外两种方法的操作更加简便、步骤更少、数据处理相对较简易，在花色苷定量检测中应用广泛[16]，但存在不全面、方向单一，针对性不强等缺点。此外，在精密度试验中单一pH法的相对标准偏差最高为1.60%，精密度相对另外两种方法稍差。
表1 3种方法精密度试验结果
Table 1 Precision test results of three kinds ofmethods
序号1 2 3 4 5 6标准差平均值RSD/%38.42 38.09 37.59 37.59 37.92 38.26 0.31 37.98 0.83 52.29 54.46 53.79 54.79 53.96 53.29 0.86 53.86 1.60 56.35 57.01 55.01 57.02 56.79 56.12 0.70 56.38 1.24花色苷含量/（mg·L-1）pH示差法 单一pH法 差减法
pH示差法和差减法的优势在于仪器廉价，操作简单，实用性强。由于差减法需要用到漂白剂，操作过程相对比较复杂，容易造成误差。此外，漂白剂的添加会使得干扰物的吸光度值下降，导致最终结果比实际值偏大，偏差相对较大[17]。pH示差法方便、快捷、精确，适用于有干扰物的溶液中花色苷检测，可以排除非花色苷类物质对测定结果的影响[18]。王颖等[19-20]均使用该方法对有色马铃薯总花色苷进行检测。因此选择pH示差法对黑糯米酒花色苷测定。2.8 pH示差法加标回收率试验
表2 加标回收率试验结果
Table 2 Results of standard recovery rate test
酒液花色苷含量/（mg·L-1）加标量/（mg·L-1）测得量/（mg·L-1）回收率/%平均回收率/%标准偏差/%RSD/%84.95 85.73 85.93 79.29 79.29 79.29 163.07 164.24 163.82 98.52 99.01 98.28 98.60 30.01 0.38
由表2可知，加标回收率平均值达98.60%，RSD为0.38%，表明该优化条件后的方法可靠、准确，适用于黑糯米酒中总花色苷测定。
3 结论
对黑糯米酒花色苷的测定方法进行了研究。结果表明，pH示差法、单一pH法和差减法所测标准曲线的相关系数为0.997 7、0.998 5、0.999 4，线性关系较好，均可用于测定黑糯米酒中总花色苷含量。3种方法测定黑糯米酒花色苷的平衡温度为30℃，平衡时间为40min，测定波长为511 nm。单一pH法和差减法的最适pH为0.8，pH示差法最适pH为0.8和4.5。3种方法可直接测定黑糯米酒总花色苷含量，且精密度良好，其中pH示差法精密度最高，相对标准偏差（RSD）为0.83%。pH示差法加标回收率试验结果RSD为0.38%，表明该优化条件后的方法可靠、准确，适用于黑糯米酒中总花色苷测定。
[1]张元，白卫东，刘功良，等.黄酒生物活性成分及其功能研究进展[J].中国酿造，2017，36（7）：5-9.
[2]刘媛媛.黑米及黑米酒中抗氧化成分分析[D].杨凌：西北农林科技大学，2013.
[3]翦祎，韩舜愈，张波，等.单一pH法、pH示差法和差减法快速测定干红葡萄酒中总花色苷含量的比较[J].食品工业科技，2012，33（23）：323-325.
[4]唐琳，李子江，赵磊，等.两种pH值法测定玫瑰花花色苷含量的比较[J].食品科学，2009，30（18）：310-313.
[5]霍琳琳，苏平，吕英华.分光光度法测定桑葚总花色苷含量的研究[J].酿酒，2005，32（4）：88-89.
[6]刘达玉，马艳华，王新惠，等.黑米酒的酿造及其品质分析研究[J].食品研究与开发，2012，56（9）：86-91.
[7]ELISIA I,HUC,POPOVICHDG,etal.Antioxidantassessmentof an anthocyanin-enriched blackberry extract[J].Food Chem,2007,101(3)：1052-1058.
[8]赵旭.酶协同微生物发酵黑糯米酒工艺研究[D].贵阳：贵州大学，2016.[9]WROLSTAD R E,CULBERTSON JD,CORNWELL C J.Detection of adulteration in blackberry juice concentratesand wines[J].J Assoc Anal Chem,1982,65(6)：1417-1423.
[10]LEEJ,DURSTRW,WROLSTADRE.Determination of totalmonomeric anthocyanin pigment content of fruit juices,beverages,natural colorants,and winesby the pH differentialmethod：Collaborative study[J].J Aoac Int,2005,88(5)：1269-1278.
[11]卢钰，董现义，杜景平，等.花色苷研究进展[J].山东农业大学学报（自然科学版），2004，35（2）：315-320.
[12]李安文.蓝莓花色苷稳定性及分离纯化技术研究[D].长沙：湖南农业大学，2011.
[13]FULEKIT,FRANCISFJ.Quantitativemethods foranthocyanins：1.Extraction and determination of total anthocyanins in cranberry juice[J].J Food Sci,1968,33(1)：72-77.
[14]MARKAKISP.Anthocyaninsas food colors[J].Food Sci Technol,1983,21(4)：509.
[15]DANGLESO,SAITON,BROUILLARDR.Kinetic and thermodynamic control of flavylium hydration in the pelargonidin-cinnam ic acid complexation.Origin of the extraordinary flower color diversity of Pharbitis nil[J].J Am Chem Soc,1993,115(8)：3125-3132.
[16]刘洪海，张晓丽，杜平，等.pH示差法测定烟73葡萄中花青素含量[J].中国调味品，2009，34（4）：110-111.
[17]孙婧超，刘玉田，赵玉平，等.pH示差法测定蓝莓酒中花色苷条件的优化[J].中国酿造，2011（11）：171-174.
[18]石岳，张秀玲，邹阳.pH示差法测定黑莓残渣中花青素含量的研究[J].中国食品工业，2007（12）：56-57.
[19]王颖，潘哲超，李先平，等.不同肉色马铃薯花色苷含量及总抗氧化能力的分析研究[J].中国食物与营养，2017，23（2）：66-69.
[20]张玥，龙君，文云，等.紫色马铃薯花色苷定量分析方法的比较[J].湖南农业科学，2012（9）：25-28.