红曲色素是一种由红曲菌发酵而成的优质天然食用色素，是红曲霉的次级代谢产物，具有良好的安全性以及耐光、耐热、耐化学性[1]，因而被广泛应用于食品行业、医药工业、纺织[2]。此外，红曲色素还具有抗菌、防腐、抗癌、抗炎、调节胆固醇以及预防和治疗糖尿病等功效[1，3-6]，李泳宁等[7]的研究结果表明，富含红曲色素的微生物发酵饲料是一种较为理想的蛋鸡微生态制剂。
三七（Panax notoginseng）是一种传统的药食两用植物，提取有效成分后的三七渣含有丰富的淀粉、蛋白质、氨基酸、多种微量成分等营养物质。目前，三七渣的处理仍主要采用焚烧、填埋和堆放等传统方法，既污染环境又浪费资源。鉴于此，部分学者开展了三七渣资源化的研究工作，如林晓等[8]采用超声波辅助提取三七渣中总黄酮，谭显东等[9-10]以三七渣为原料发酵生产灵芝菌质和蛋白饲料。利用三七渣替代粮食作物作为发酵基质生产红曲色素，不仅可以降低生产成本，节约粮食，还能实现固体废弃物的资源化，有助于中成药生产企业实现清洁生产[11]。红曲色素是多种色素的混合物，主要有红色系和黄色系两大类。本研究对固态发酵三七渣生产红曲红色素的工艺条件进行了优化，旨在提高曲红色素的产量。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
紫色红曲霉（Monascus purpureus）：四川省微生物资源平台菌种保藏中心；三七渣：四川省某中成药厂；葡萄糖、磷酸二氢钾（均为分析纯）、蛋白胨、琼脂粉（均为生化试剂）：成都市科龙化工试剂厂。
种子液培养基：葡萄糖6%，蛋白胨2%，NaNO3 1%，MgSO4·7H2O 0.5%、KH2PO4 1%，pH自然。
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextroseagar，PDA）培养基：土豆20 g，葡萄糖2.0 g，琼脂粉2.0 g，蒸馏水100m L。
三七渣固态培养基：过60目筛三七渣10g，蛋白胨0.3g，磷酸二氢钾1%，培养基初始含水量60%，pH自然。
1.2 仪器与设备
UV-2550紫外可见分光光度计：日本SHIMADZU公司；PYX-280H-C恒温恒湿生化培养箱：广东韶关科力实验仪器有限公司；LDZX-50KB高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SF-130中药分析研磨机：长沙中南制药机械厂；VT1300L-U超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 三七渣固态发酵产红曲色素工艺流程及操作要点
三七渣→过筛→预处理→接入种子液→发酵→烘干→研磨→成品
过筛：将三七渣过60目筛，筛下物料用于后续发酵。
预处理：在高压灭菌锅内采用121℃高温蒸汽对发酵基质进行预处理。
接入种子液：将斜面紫色红曲霉菌种接入PDA培养基中，于30℃条件下恒温培养5～6 d。将在PDA平板培养基上打孔得到的红曲霉菌接种于种子液培养基中，在150 r/m in、30℃条件下培养5 d。将一定量的种子液接种到三七渣发酵培养基上。
发酵：在微生物培养箱内进行发酵。
烘干：发酵结束后，将发酵培养物于60℃烘干至质量恒定。
研磨：采用分析研磨机将烘干后的发酵培养物粉碎至可以通过60目筛，收集成品装袋备用。
1.3.2 三七渣固态发酵工艺优化单因素试验
影响红曲红色素产量的主要因素有装样量、接种量、培养温度、预处理时间、培养时间。因此，先进行装样量（5g、7.5g、10 g、12.5 g、15 g、17.5g）、接种量（1%、5%、10%、15%、20%、25%）、培养温度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃）、预处理时间（20min、40min、60m in、80m in、100m in、120m in）、培养时间（6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d、12 d）单因素试验，对发酵工艺条件进行初步筛选。初始发酵工艺条件为接种量10%、培养温度30℃，预处理时间40m in、培养时间10 d。
1.3.3 三七渣固态发酵工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，以接种量（A）、装样量（B）、培养温度（C）为影响因素，以红曲红色素色价为考察指标，对固态发酵三七渣的工艺条件进行L（933）正交试验设计，正交试验因素与水平见表1。
表1 固态发酵三七渣工艺条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonalexperiments for technological condition optim ization of Panax notoginseng residue by solid-state fermentation
水平 A接种量/% B装样量/g C培养温度/℃123 10 15 20 7.5 10.0 12.5 30 32 34
1.3.4 红色素色价测定方法
准确称取1.00 g发酵培养物（成品）置于250m L带塞锥形瓶中，加入50m L体积分数70%的乙醇溶液在60℃条件下水浴提取60min，于波长500 nm处测定OD500nm值[12]。红色素色价参照下式计算：
红色素色价
式中：50为乙醇提取液体积，m L。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果与分析
2.1.1 装样量对红色素色价的影响
装样量对红色素色价的影响如图1所示。
图1 装样量对红色素色价的影响
Fig.1 Effect of loading volume on color value of red pigment
由图1可知，在装样量≤10g之前，随着装样量的增加，红色素色价增大；在装样量为10g时，色价达到最大值16.6U/g，继续增大装样量对红色素的生产反而有抑制作用；彭真等[13]以大米为底物发酵生产红曲色素时，也发现存在类似规律。发酵过程中微生物的新陈代谢活动会导致水分的释放和基质的分解，使得物料黏度变大，通透性降低，散热困难，造成物料温度升高，进而影响微生物的新陈代谢[14]。因此选择最佳装样量为10 g。
2.1.2 接种量对红色素色价的影响
接种量对红色素色价的影响如图2所示。
图2 接种量对红色素色价的影响
Fig.2 Effect of inoculum on color value of red pigment
由图2可知，在接种量≤15%之前，随着接种量的增加，红色素色价增大；在接种量为15%时，色价达到最大值19.2U/g，继续增大接种量对红色素的生产反而有抑制作用，这与彭真等[13，15-16]的研究结果相似。原因可能是采用较大的接种量有利于生产出更多的菌体蛋白和代谢产物。但是另一方面，采用过高的接种量也会带来负面影响，如由于菌体过快增殖而积累的大量代谢产物对发酵过程会产生反馈抑制作用；同时，这些代谢产物还会使发酵基质的黏度增加，从而妨碍传质过程，最终影响菌体生长和代谢产物的生成。因此选择最佳接种量为15%。
2.1.3 培养温度对红色素色价的影响
培养温度对红色素色价的影响如图3所示。
图3 培养温度对红色素色价的影响
Fig.3 Effect of culture temperature on color value of red pigment
由图3可知，在培养温度低于30℃之前，随着培养温度的升高，红色素色价增大；在培养温度为30℃时，色价达到最大值17.4U/g，继续升高培养温度红色素色价反而下降，这与采用玉米芯为原料的试验结果[17]相似。而蒋冬花等[18]采用大米为原料，发现培养温度为32℃时红色素色价最高。温度过高或过低均会造成微生物新陈代谢速度减慢、酶活性减弱，最终导致红色素的产量下降。考虑到节能，因此选择最佳培养温度为30℃。
2.1.4 预处理时间对红色素色价的影响
三七渣中含有大量的天然高分子聚合物，为了便于微生物对其进行利用，可以对三七渣进行高温蒸汽预处理，预处理时间对红色素色价的影响如图4所示。
图4 预处理时间对红色素色价的影响
Fig.4 Effect of pre-treatment time on color value of red pigment
由图4可知，在预处理时间＜40min之前，随着预处理时间的延长，红色素色价增大；在预处理时间为40m in时，色价达到最大值17.9U/g，继续延长预处理时间红色素色价反而下降。预处理时间过长和过短都不利于红色素的合成。原因可能是高温蒸汽预处理可以破坏发酵基质中高分子聚合物的物质结构[19]，有助于糖化过程，但预处理时间太长，高分子聚合物水解速率越快，发酵体系中葡萄糖的生成速率就会高于消耗速率，导致系统中葡萄糖浓度过高而产生反馈阻遏效应，进而影响相关色素合成酶的活动，使得色素色价降低。因此，选择最佳预处理时间为40m in。
2.1.5 培养时间对红色素色价的影响
培养时间对红色素色价的影响如图5所示。
图5 培养时间对红曲色素色价的影响
Fig.5 Effect of culture time on color value of red pigment
由图5可知，在培养时间＜11 d之前，随着培养时间的延长，红色素色价总体变化趋势是逐渐增大，但在发酵第7～10天时红色素色价基本维持不变，发酵第11天时，红色素色价急剧增加，在培养时间为12 d时，色价达到最大值15.8U/g。培养时间直接影响到发酵产品的质量、收率和生产成本，在不同的培养时间区段内，红色素色价的变化趋势有较大的差异：这与程哲灏等[16，20]的研究结果相似。以大米和玉米粒为原料固态发酵产红色素时，在发酵第13天时色价达到最大值[16]；贾氏臣等[21]以大米为原料固态发酵产红色素时，在发酵第6天时色价达到最大值。因此，选择最佳培养时间为12 d。
2.2 正交试验结果与分析
为确定最优发酵工艺条件，在单因素试验的基础上，研究接种量、装样量、培养温度对固态发酵三七渣产红色素的影响，以红色素色价为评价指标，进行L9（33）正交试验设计，正交试验结果见表2，方差分析见表3。
由表2、表3可知，接种量、装样量、培养温度3个因素对发酵结果的影响都极显著（P＜0.01），影响程度的排序为培养温度＞装样量＞接种量。最佳发酵工艺条件为接种量15%，装样量12.5 g，培养温度34℃，在此优化条件下，发酵培养物中红色素色价可达14.53U/g。
表2 固态发酵三七渣工艺条件优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonalexperiments for technologicalcondition optim ization of Panax notoginseng residue by solid-state fermentation
试验号A B C红色素色价/（U·g-1）123456789k1k2k3R 111222333 13.44 13.69 13.62 0.25 123123123 13.15 13.75 13.85 0.70 123231312 13.05 13.65 14.05 1.00 12.65 14.20 13.47 12.63 14.50 13.95 14.17 12.55 14.13
表3 正交试验方差分析
Table 3 Variance analysis of orthogonalexperiments
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值ABC交互作用误差区组校正的总计0.309 2.580 4.521 7.149 0.621 0.021 15.201 22221 622 6 0.154 1.290 2.260 3.574 0.039 0.010 3.979 33.231 58.225 82.079 0.265 0.004 0.000 0.000 0.000 0.771
3 结论
通过本研究发现，发酵工艺条件对三七渣固态发酵产红色素的影响较大，接种量、装样量、培养温度对发酵结果的影响极显著（P＜0.01），这3个因素对发酵结果影响程度的排序为培养温度＞装样量＞接种量。最佳发酵工艺条件为接种量15%，装样量12.5 g，培养温度34℃，预处理时间40min，培养时间12 d。在此条件下，发酵培养物中红色素色价可达14.53U/g。
[1]王文风，袁兵兵，徐玲.红曲的研究现状[J].发酵科技通讯，2014，43（1）：39-44，50.
[2]王艳，邱树毅，王啸，等.紫色红曲霉FBKL3.0018液态发酵产红曲色素条件的优化研究[J].中国酿造，2017，36（12）：57-62.
[3]周文斌，贾瑞博，李燕，等.红曲色素组分、功效活性及其应用研究进展[J].中国酿造，2016，35（7）：6-10.
[4]杜甫军，胡伟莲，冯纬，等.米醋废渣发酵红曲色素的条件研究[J].中国酿造，2015，34（11）：71-74.
[5]苏东晓，张瑞芬，张名位，等.红曲色素生物活性研究进展[J].河南工业大学学报（自然科学版），2017，38（2）：129-136.
[6]康珏，左嚞伟.红曲霉及红曲的功能性研究[J].四川农业科技，2011（1）：67-69.
[7]李泳宁，朱宏阳，吴焜，等.一种富含红曲色素微生物发酵饲料在蛋鸡养殖中的应用[J].粮食与饲料工业，2015，12（2）：52-54.
[8]林晓，于恩江，刘珊珊，等.三七渣总黄酮提取及其抗氧化活性的研究[J].食品研究与开发，2015（11）：43-46.
[9]谭显东，胡伟，王浪，等.利用三七渣固态发酵灵芝菌的研究[J].环境污染与防治，2015，37（7）：61-65.
[10]谭显东，段娅宁，胡伟，等.三七渣混菌发酵生产蛋白质饲料的工艺条件研究[J].中国饲料，2014（2）：20-23.
[11]谭显东，黄凡，林巧玉，等.培养基特性对三七渣发酵产红曲色素的影响[J].环境工程学报，2017，11（7）：4293-4297.
[12]JOHNSM R,STUART D M.Production of pigmentsby Monascus purpureus in solid culture[J].J Ind M icrobiol,1991,8(1)：23-28.
[13]彭真，吴振强，李运南，等.红曲黄色素固态发酵条件的研究[J].现代食品科技，2009，25（6）：669-673.
[14]CARVALHO JC D,PANDEY A,OISHIB O,et al.Relation between growth,respirometric analysisand biopigments production from Monascus by solid-state fermentation[J].Biochem Eng J,2006,29(3)：262-269.
[15]董文宾，郑丹，于琴，等.红曲霉固态发酵产生红曲色素工艺研究[J].食品研究与开发，2005，26（2）：57-59.
[16]程哲灏.红曲黄色素固态发酵的研究[D].广州：华南理工大学，2010.
[17]VELMURUGAN P,HURH,BALACHANDAR V,etal.Monascus pigmentproduction by solid-state fermentationwith corn cob substrate[J].J Biosci Bioeng,2011,112(6)：590-594.
[18]蒋冬花，孙蕾，陈璨，等.高产色素红曲霉菌株的筛选、鉴定和固体发酵条件优化[J].浙江农业学报，2015，27（9）：1639-1645.
[19]樊世漾.水热预处理及酸/碱-水热预处理对玉米秸秆酶解产糖及厌氧发酵的影响[D].北京：北京林业大学，2016.
[20]HU ZQ,ZHANG X H,WU ZQ,etal.Perstraction of intracellular pigments by submerged cultivation of Monascus in nonionic surfactantmicelleaqueoussolution[J].Appl M icrobiol Biot,2012,94(1)：81-89.
[21]贾氏臣.红曲菌固态发酵产红曲黄色素影响因素的研究[D].天津：天津科技大学，2016.