金银花（Lonicera japonica Thunb），亦称为双化、银花，忍冬等，是一种忍冬科半常绿藤木植物，其性甘寒、气芳香，在中医药学中多作为宣散风热、清解血毒等配方，对治疗热毒疮痈、咽喉肿痛、发疹等各种热性病具有很好的效果[1-2]。
湖北罗田县位于大别山南麓，具有典型的山地气候特征，野生金银花资源丰富，“罗田金银花”香气浓郁、挥发油含量高，2011年获批中国地理标志产品，且罗田金银花种植面积已达2.1万亩，推动了地方以金银花露加工为代表的金银花产业发展[3-5]。金银花露加工后的蒸馏剩余物中含黄酮、绿原酸等生物活性成分[6]，本地的金银花加工企业都面临蒸馏剩余物资源化利用的问题。
现代研究表明，黄酮类化合物具有抗肿瘤[7-8]、清除自由基[9]、抗突变[10]、抗菌、抗病毒[11]、调节免疫、保肝利胆、防治血管硬化[12-13]、降血糖和抗人类疫缺陷病毒（human im munodeficiency virus，HIV）活性[14-15]等功能。近年来人们越来越关注微生物转化植物次生代谢产物[16]，其在天然产物和中药活性物质成分的开发及工业化应用方面应用前景广阔[17-19]。本试验拟以地方企业加工金银花露后的蒸馏剩余物为材料，筛选转化总黄酮的微生物并探讨其最佳转化工艺条件，从而为地方企业综合利用金银花资源提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
金银花蒸馏剩余物：湖北楚天舒药业有限公司提供，过滤后滤液备用；枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、黑曲霉（Aspergillusniger）：均由黄冈师范学院生物与农业资源学院生物工程实验室提供。
芦丁标准品（纯度≥95%）：上海金橞生物科技有限公司；乙醇（分析纯）：上海山浦化工有限公司；NaNO2（分析纯）、Al（NO3）3（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；NaOH（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司。
察氏培养基[20]：NaNO3 3.0 g，K2HPO4 1.0 g，KCl0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，蒸馏水1 L，pH自然，121℃灭菌20m in。
1.2 仪器与设备
VarianCary100Scan型紫外可见分光光度计：美国Varian公司；Ax-205METTLERTOLEDO型电子天平：瑞士梅特勒-托利多集团；H/T18MM型台式高速离心机：湖南赫西仪器装备有限公司；HYG-B型全温度摇瓶柜：太仓市实验设备厂；YM 50型不锈钢立式电热灭菌器：上海三申医疗器械有限公司；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 芦丁标准曲线制备及总黄酮含量测定
根据陈瑶等[21-22]报道的方法，准确称取芦丁标准品10.66mg，用体积分数60%乙醇溶液配制成母液，分别取母液0、1.00m L、2.00m L、3.00m L、4.00m L、5.00mL、6.00m L于25m L容量瓶中，加入体积分数60%乙醇溶液5.50mL，加入5%亚硝酸钠1m L后摇匀放置6min，加入10%硝酸铝溶液1mL之后摇匀放置6min，最后加入4%氢氧化钠溶液10m L，并用体积分数为60%乙醇溶液定容至刻度线，放置15m in后，以未加入标准品溶液的试剂为空白，在波长509 nm处检测其吸光度值，以芦丁质量浓度（C）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，制得芦丁标准曲线回归方程A=12.197C+0.004 2，R2=0.999 5，芦丁质量浓度在8.6～59.7 μg/m L范围内与吸光度值线性关系良好。
样液按照芦丁标准曲线制备方法进行处理，并在波长509 nm处测定其吸光度值，根据标准曲线回归方程计算总黄酮含量，试验重复3次。
1.3.2 菌种筛选
据刁欢等[23-24]的研究发现，黑曲霉和枯草芽孢杆菌对总黄酮的转化有促进作用，本验试分别在相同的试验条件下测定其总黄酮增量，筛选出能使发酵液相比于母液总黄酮增量最高的一种菌用于后续试验。
1.3.3 总黄酮转化工艺条件优化单因素试验
取150m L液体察氏培养基于500m L锥形瓶，灭菌后接入黑曲霉，放入转速为150 r/min的摇床30℃培养3 d左右至长出菌丝制得黑曲霉菌液。
根据溶氧量设定液体发酵液容器为500m L锥形瓶，总发酵液体系为150m L：先加入察氏液体培养基30m L和一定体积的蒸馏剩余物液，121℃条件下灭菌20m in，冷却，按0.92×106 CFU/m L接入黑曲霉菌液，蒸馏剩余物液和菌液总体积为120m L。之后放入转速150 r/m in，温度30℃的摇床培养6 h，离心，测定总黄酮含量。
根据样品液与对照液（不接菌种，其他条件与样品液一致）的总黄酮含量，计算样品液在菌种发酵作用下的总黄酮增量。以总黄酮增量为评价指标，通过单因素试验分别考察不同发酵时间（4 h、6 h、8 h、10 h、12 h）、接种量（0.61×106 CFU/m L、0.92×106 CFU/m L、1.23×106 CFU/m L、1.38×106 CFU/m L、1.47×106 CFU/m L）、发酵温度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）和转速（0、50 r/m in、150 r/m in、200 r/m in、250 r/min）对总黄酮增量的影响。
1.3.4 总黄酮转化工艺条件优化正交试验
在单因素试验结果的基础上，选取对总黄酮增量影响较显著的发酵时间、接种量、发酵温度和转速这四个因素进行正交试验设计，因素与水平如表1所示。
表1 总黄酮生物转化工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonalexperiments for total flavonoids bioconversion process optim ization
水平 A发酵时间/h B接种量/（×106 CFU·m L-1）C发酵温度/℃D转速/（r·m in-1）1 2 3 8 10 12 0.92 1.23 1.38 25 30 35 100 150 200
2 结果与分析
2.1 菌种筛选
枯草芽孢杆菌和黑曲霉发酵金银花蒸馏剩余物后总黄酮含量变化情况见表2。由表2可知，枯草芽孢杆菌对总黄酮含量的增加无效果，而黑曲霉对总黄酮含量有较明显作用，总黄酮增加0.32 g/L，因此，转化菌株宜选黑曲霉。
表2 2种菌种对总黄酮增量的影响
Table 2 Effect of two strains on the increment of total flavonoids
注：“-”表示相比对照组总黄酮含量降低。
菌种 枯草芽孢杆菌 黑曲霉总黄酮增量/（g·L-1）-0.23±0.13 0.32±0.02
2.2 总黄酮生物转化工艺优化单因素试验
2.2.1 发酵时间对总黄酮增量的影响
由图1可知，在其他条件相同的情况下，当发酵时间从4 h延长到8 h时，总黄酮增量增长缓慢，且发酵6 h到8 h总黄酮增量无显著差异（P＞0.05），发酵8 h到10 h期间总黄酮增量迅速增加，在10 h时增量达到峰值，即0.41 g/L，继续增加发酵时间，总黄酮增量逐渐降低。可能由于培养时间过长，菌体数量过多，导致菌株营养和溶氧不足，发酵转化总黄酮能力下降，故以发酵时间10 h为宜。
图1 发酵时间对总黄酮增量的影响
Fig.1 Effect of fermentation time on the increment of total flavonoids
2.2.2 接种量对总黄酮增量的影响
由图2可知，随着接种量的逐渐增加，即同等体系下菌液占比的逐渐增加而金银花蒸馏剩余物液占比的逐渐减少，总黄酮增量呈先升高后降低的趋势，总黄酮增量在接种量为1.23×106 CFU/m L条件下达到峰值，为0.44 g/L。继续增加接种量，总黄酮增量下降。这主要是由于接种量过高，黑曲霉菌体生长迅速，大量营养物质被消耗，不利于总黄酮的转化。因此，接种量以1.23×106 CFU/m L为宜。
图2 接种量对总黄酮增量的影响
Fig.2 Effect of inoculum on the increment of total flavonoids
2.2.3 发酵温度对总黄酮增量的影响
图3 发酵温度对总黄酮增量的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on the increment of total flavonoids
温度可以直接影响着各微生物的生长、生化反应速率及黄酮的提取率、稳定性[25]。由图3可知，发酵的温度＜30℃之前，随着温度的升高，总黄酮增量逐渐升高，总黄酮增量在30℃的恒温条件下达到峰值，为0.50g/L。继续升高发酵温度至40℃，总黄酮增量随着发酵温度的升高而明显下降，可能是因为温度过高消耗营养物质速度加快，菌体更易衰老，从而影响菌体的生长最终导致总黄酮增量降低。因此，发酵温度以30℃为宜。
2.2.4 转速对总黄酮增量的影响
由图4可知，随着转速的增加，总黄酮增量逐步上升，当转速增加至150 r/min时总黄酮增量达到最大，为0.33 g/L。继续增加转速，总黄酮增量略有下降。主要是因为剪切力太大导致菌丝体断裂从而不利于黑曲霉的生长，导致总黄酮增量降低。因此，转速以150 r/min为宜。
图4 转速对总黄酮增量的影响
Fig.4 Effect of rotating speed on the increment of total flavonoids
2.3 总黄酮生物转化工艺优化正交试验
根据单因素试验结果，以发酵时间（A）、接种量（B）、发酵温度（C）、转速（D）为变量因子，以总黄酮增量为评价指标，设计L9（43）正交优化试验，试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 总黄酮生物转化工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonalexperiments for total flavonoids bioconversion process optim ization
试验号A B C D总黄酮增量/（g·L-1）123456789k1k2k3R 111222333 0.46 0.89-0.07 0.97 123123123 1.38-0.07-0.03 1.46 123231312 0.56 0.74-0.02 0.77 123312231 0.42 0.09 0.77 0.68 1.54-0.06-0.11 2.51-0.07 0.24 0.10-0.09-0.23
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonalexperim ents results
注：“-”表示对结果影响不显著（P＞0.05）。
方差来源 偏差平方和 自由度 F比 F0.05临界值 显著性发酵时间接种量发酵温度转速误差1.401 4.128 0.963 0.688 7.180 22228 0.781 2.300 0.536 0.383 4.460 4.460 4.460 4.460- - - -
由表3的极差分析结果可知，各因素对总黄酮增量的影响次序为B＞A＞C＞D，即接种量＞发酵时间＞发酵温度＞转速。表4方差分析也表明各个因素对总黄酮增量的影响次序是B＞A＞C＞D，但各因素的影响均不显著（P＞0.05），获得最佳发酵工艺条件为A2B1C2D3，即发酵时间10 h，接种量0.92×106 CFU/m L，发酵温度30℃，转速200 r/min。
2.4 验证试验
最佳发酵工艺条件，即发酵时间10 h，接种量0.92×106 CFU/m L，温度30 ℃，转速200 r/m in，为表3中的4号试验，其总黄酮增量最高；在此条件下平行验证试验3次，总黄酮增量为（2.54±0.48）g/L，与理论值2.51 g/L结果较一致，表明正交设计所确定的黑曲霉发酵条件为最优选。
3 结论
针对本地企业加工金银花露后的蒸馏剩余物液，利用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉四种微生物进行发酵试验，发现黑曲霉能明显转化提高蒸馏剩余物液中总黄酮含量，为优选转化菌株。以总黄酮增量为评价指标，利用正交试验优化黑曲霉发酵工艺为发酵时间10h，接种量0.92×106 CFU/m L，发酵温度30℃，转速200 r/min。在此优化条件下，黑曲霉转化金银花蒸馏剩余物中总黄酮增量可高达（2.54±0.48）g/L。该工艺简单有效，适合工业化生产，从而为地方企业对加工金银花露后的蒸馏残液进行资源化利用提供了依据。
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