α-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.12）能够将α-半乳寡糖、半乳甘露聚糖侧链、半乳糖脂和糖蛋白通过α-半乳糖苷键连接的非还原端的半乳糖苷残基逐个水解，释放出半乳糖[1-2]。该酶在食品、饲料等工业中有着广泛的应用[1]。在制糖工业中，α-半乳糖苷酶可以分解甜菜浆中的棉籽糖来提高蔗糖的回收率[3]。在饲料工业中，α-半乳糖苷酶可以分解饲料中的棉籽糖家族寡糖类抗营养物质，减少其在单胃动物饲喂中引起的腹胀和腹泻问题，同时又能提高饲料的利用率[2，4-8]。在造纸工业中，α-半乳糖苷酶还可以用来提高甘露聚糖酶对纸浆的漂白效果[3，9-10]。
α-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶（glycosidehydrolase，GH），根据其氨基酸序列的同源性，将其归入GH 4、GH 27、GH 36、GH 57、GH 97和GH 110家族，其中以GH 27和GH 36家族成员最多。α-半乳糖苷酶在动植物和微生物中广泛存在[2，11-16]，由于α-半乳糖苷酶的微生物来源最为广泛，易于基因工程操作，且大规模生产成本较低，所以得到了更广泛的关注[2]。细菌来源的α-半乳糖苷酶大部分归属于GH 36家族，能够水解分子质量较小的底物（包括人工合成的对硝基苯基底物和棉籽糖家族寡糖等），最适温度35℃～90℃各不相同，最适pH值一般在5.5～6.5[17-20]，而真菌来源的α-半乳糖苷酶的最适温度一般在50～75℃，pH值一般在4.0～5.5[3，21-23]。目前，α-半乳糖苷酶性质研究的主要手段是以其基因为出发点，选择合适的表达系统，进行酶的异源表达，从而高效、明确地了解α-半乳糖苷酶的分子基础及酶学性质，为后续通过基因工程、蛋白质工程等技术手段对其进行修饰改性，开发其工业化应用价值，以及相关酶系的生物信息学等研究提供理论支持。并且通过异源表达的酶易于特异性纯化，避免了从原生菌株中直接分离纯化蛋白的复杂操作。微生物α-半乳糖苷酶异源表达系统一般选用的表达宿主包括大肠埃希菌（Escherichia coli）[22]、巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）[3]以及丝状真菌如里氏木霉（Trichoderma reesei）等[24]，最高酶活可达1 900U/m L[3]。
本实验室保存的一株链球菌（Streptococcus）S1在含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-a-D-吡喃半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-a-D-galactopyranoside，X-α-gal）的培养平皿上呈现出明显的蓝色，说明其具有α-半乳糖苷酶活性。以该菌株含有的α-半乳糖苷酶基因为目的基因，在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行异源表达与重组酶的纯化，并对其酶学性质进行了研究，为寻找更多不同性质的α-半乳糖苷酶以适应不同的需求奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株和质粒
链球菌（Streptococcus）S1：本实验室分离保存；E.coli Top10感受态细胞、E.coli BL21（DE3）感受态细胞：全式金生物技术有限公司。
实验室改造质粒pET-M-3C：通过XbaⅠ和BamHⅠ双酶切，并经T4 DNA连接酶连接成新片段的方法去除质粒pET-32a的S-tag和Trx-tag，并将其thrombin（凝血酶）酶切位点替换为3C酶切位点（L-G-V-L-F-G-P）。
1.1.2 化学试剂
蛋白胨、酵母粉（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；NaCl（分析纯）：天津市恒兴化学制造有限公司；镍-琼脂糖凝胶、Tris饱和酚：北京索莱宝科技有限公司；对硝基苯（p-nitrophenyl，pNP）（分析纯）、对硝基苯-α-D-半乳糖苷（p-nitrophenyl-α-D-galactoside，pNPG）（纯度98%）、水苏糖（纯度98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蜜二糖（纯度99%）、棉籽糖（纯度99%）：上海麦克林生化科技有限公司；冰醋酸（分析纯）、正丁醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ：美国赛默飞世尔科技公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度定量试剂盒：北京市普利莱基因技术有限公司；氯仿、异戊醇（均为分析纯）：天津市瑞金特化学品有限公司；细菌基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒：美国OMEGA BIO-TEK公司；2Es Taq MasterM ix（Dye）试剂：北京康维世纪生物科技有限公司。
1.1.3 培养基
MRS肉汤培养基：北京索莱宝科技有限公司。
LB培养基：蛋白胨10 g/L；酵母粉5 g/L；NaCl5 g/L，调pH值至7.4，用去离子水定容至1 000m L，121℃条件下灭菌20min。降至室温加入氨苄青霉素，质量浓度为100μg/m L。
1.2 仪器与设备
HYG-A恒温摇床：太仓市豪成实验仪器制造公司；MULTIFUGEX1R台式离心机、3001全波长酶标仪：美国赛默飞世尔科技公司；Hema L1低温连接仪：珠海黑马医学仪器有限公司；Biometra TProfessional聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国伯乐公司；M ini PROTEAN 3Cell垂直电泳仪、DYCP-31D水平DNA电泳仪：北京六一仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 目的基因提取
（1）引物设计
利用细菌基因组提取试剂盒提取链球菌S1的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，以通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）为引物，用2Es Taq MasterM ix（Dye）试剂进行PCR扩增（95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30 s，72℃延伸2m in，共30个循环；72℃再延伸5m in；16℃保温）获得16S rDNA，送测序公司测序，测序结果在https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi网站与数据库中的已有菌株的16S rDNA进行比较，鉴定菌种。根据鉴定结果，在美国国家生物技术信息中心（national centerofbiotechnology information，NCBI）数据库中找亲缘关系较近菌种中的α-半乳糖苷酶基因序列，利用软件Primer Premier5设计引物。
（2）目的基因扩增
以提取的链球菌S1基因组DNA为模板，以Sagal-F（5'-AGGGATCCATGGGA ATTCGCATCGAAGG-3'）和Sagal-R（5'-AAACTCGAGTTATTGTTTCACGAAATAG-3'）为引物，用2Es Taq MasterM ix（Dye）试剂进行PCR扩增（95℃预变性5min；95℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸2m in，共30个循环；72℃再延伸5min；16℃保温），获得目的基因片段。
1.3.2 基因克隆与载体构建
用BamHⅠ和XhoⅠ限制性核酶内切酶分别酶切目的基因片段和载体pET-M-3C，抽提沉淀后用T4DNA连接酶连接，然后转化到E.coli Top10感受态细胞中，涂布在加有100μg/m L氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养16 h后，挑取单克隆，以Sagal-F和Sagal-R为引物进行菌落PCR筛选阳性克隆，挑取阳性克隆接种至含有100μg/m L氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养16 h后用质粒提取试剂盒提取质粒pET-M-C-Sagal，送测序公司测序。
1.3.3 蛋白表达与纯化
按E.coli BL21（DE3）感受态细胞转化操作说明书，将质粒pET-M-3C-Sagal转化到E.coli BL21感受态细胞中，涂布在加有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养16h后，挑取单克隆接种于5m L LB（含100μg/mL氨苄青霉素）液体培养基中，37℃、180 r/min培养6 h后转接入200m L LB（含100μg/m L氨苄青霉素）液体培养基中，37℃、180 r/min培养至OD600 nm值达到0.6左右，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.3mmol/L，16℃、180 r/min培养16 h。5000 r/min离心15min，收集细胞，用结合缓冲液（20mmol/L pH 7.9 Tris-HCl；150mmol/LNaCl；10mmol/L咪唑）重悬细胞，超声破碎（200W、15min）后15 000 r/min离心30min，收集上清液，0.2μm滤膜过滤后，将上清液加入到结合缓冲液平衡过的镍柱中（填充物为镍-琼脂糖凝胶）结合10min后，放掉上清，再用结合缓冲液漂洗柱子3次，之后用洗脱缓冲液（20mmol/L pH 7.9 Tris-HCl；150mmol/LNaCl；300mmol/L咪唑）洗脱，收集洗脱液，采用BCA法测定蛋白含量，每一步采集样品用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）检测。
1.3.4 pNPG法检测α-半乳糖苷酶活性
α-半乳糖苷酶酶活测定方法参照文献[3]进行了部分修改，在相应的反应温度预热2min后，取100μL待测酶液和100μL的pNPG溶液（10mmol/L）混合，相应温度下反应10min，加入800 μL 0.5mol/L的Na2CO3溶液终止反应，混匀后取200μL加入到96孔板中，用酶标仪测波长405 nm处吸光度值，代入预先用对硝基苯（pNP）测定的标准曲线回归方程，得出α-半乳糖苷酶的活力值。α-半乳糖苷酶酶活定义：一定条件下，每分钟水解pNPG产生1μmol的pNP所需的酶量定义为1个α-半乳糖苷酶酶活单位（U）。
1.3.5 α-半乳糖苷酶酶学性质
（1）最适pH值及pH值耐受性的确定
取不同pH的缓冲液（醋酸钠缓冲液（pH 3.5～6.0）、磷酸钠缓冲液（pH 6.5～7.50）、Tris-HCl缓冲液（pH 8.0～9.0）、甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 9.5～10.5）），在37℃条件下依照1.3.4的方法测定不同pH条件下（终浓度25mmol/L，pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）α-半乳糖苷酶（0.18 μg/m L）催化反应的酶活，确定其最适pH值。用不同的缓冲液（终浓度50mmol/L，pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）在冰上预处理α-半乳糖苷酶1h后测定α-半乳糖苷酶的残余酶活，确定其耐受pH范围以最高酶活为100%计算相对酶活。
（2）最适温度及温度耐受性的确定
pH 6.5条件下测定α-半乳糖苷酶在35～60℃温度范围内的酶活，确定其最适反应温度。在0～60℃的温度范围内预处理α-半乳糖苷酶1 h后测定其残余酶活来确定其耐受温度范围以最高酶活为100%计算相对酶活。
（3）α-半乳糖苷酶反应动力学
测定α-半乳糖苷酶催化不同浓度pNPG底物浓度（[S]=0.125mmol/L、0.250mmol/L、0.500mmol/L、1.250mmol/L、2.500mmol/L、5.000mmol/L）的水解速率V，以1/[S]（X）为横坐标，以1/V（Y）为纵坐标制作林-贝氏方程曲线（Y=K m/V max·X+1/V max），确定α-半乳糖苷酶的酶动力学数据（包括米氏常数K m和最大催化速率V max）。
1.3.6 α-半乳糖苷酶对蜜二糖、棉籽糖和水苏糖的水解活性
分别配制含有蜜二糖、棉籽糖和水苏糖的反应体系，反应体系中含有4mg/m L的糖、10U/m L的重组α-半乳糖苷酶和50mmol/L的pH 6.5的磷酸钠缓冲液，40℃反应，不同时间点（0、5min、15min、30min、1 h）取样，取出样品立即煮沸失活。参照文献中的薄层层析（thin-layer chromatography，TLC）方法[3]，用层析液（丙醇∶醋酸∶水=1∶1.5∶0.1，V/V）在硅胶层析板上展开样品（层析两次），喷洒显色液（甲醇∶浓硫酸=95∶5，V/V）后，将层析板置于105 ℃烘箱加热显色，根据迁移条带观察各寡糖水解情况。
1.3.7 数据处理
使用软件MEGA6基于16SrDNA序列构建系统进化树，使用Excel软件分析α-半乳糖苷酶酶活数据并制作图表。
2 结果与分析
2.1 链球菌α-半乳糖苷酶基因Sagal的获取
采用加X-α-gal的MRS肉汤培养基培养链球菌S1，菌落显示蓝色，证明链球菌S1具有α-半乳糖苷酶活性。采用软件Mega7.0构建该菌株的系统发育树，结果见图1。由图1可知，在链球菌范围内基于16SrDNA对菌株S1进行相似性比对，菌株S1与巴黎链球菌（Streptococcus lutetiensis）相似性为100%。因此，链球菌S1被鉴定为巴黎链球菌（Streptococcus lutetiensis）。
图1 菌株S1基于16S rDNA序列构建的系统进化树
Fig.1 Phylogenetic tree of strain S1 based on 16S rDNA sequences
以与链球菌S1菌株亲缘关系较近的Streptococcusequinus的α-半乳糖苷酶基因（GenBank：LPVR01000005.1）为模板设计引物Sagal-F（5'-AGGGATCCATGGGA ATTCGCATC-GAAGG-3'）和Sagal-R（5'-AAACTCGAGTTATTGTTTCACGAAATAG-3'），对链球菌菌株S1的基因组进行PCR扩增，获得了2 200 bp左右大小的DNA片段，如图2A所示，成功将其构建到载体pET-M-3C中。经酶切验证结果如图2B所示，经测序获得了该基因片段的DNA序列，如图3A所示，命名该基因为Sagal。将此链球菌S1基因序列与Streptococcus equinus的α-半乳糖苷酶基因（GenBank：LPVR01000005.1）进行相似性比对，显示有96%的同源性，氨基酸序列比对结果如图3B所示，鉴定此序列为一段来自链球菌S1的α-半乳糖苷酶基因（分子质量：80.4 kDa，等电点：pH 5.25）。
图2 α-半乳糖苷酶基因PCR扩增产物（A）和质粒酶切产物（B）琼脂糖凝胶电泳检测结果
Fig.2 Agarose gelelectrophoresis determ ination results of PCR product ofα-galactosidase(A)and plasm id enzyme cutting products(B)
图3 Sagal基因序列（A）及其蛋白与马链球菌的α-半乳糖苷酶氨基酸序列比对图（B）
Fig.3 Sagal DNA sequence(A)and am ino acid sequence comparison of its protein withα-galactosidase from Streptococcus equinus(B)
2.2 链球菌S1α-半乳糖苷酶的表达纯化
携带质粒pET-M-3C-Sagal的重组大肠杆菌BL21（DE3）经0.3mmol/L的IPTG诱导表达，经镍柱纯化的重组链球菌S1α-半乳糖苷酶的SDS-PAGE电泳结果如图4所示，可以看到Sagal在大肠杆菌中能够可溶性大量表达，重组蛋白能够结合镍柱，一步纯化后能够得到纯度较高的重组α-半乳糖苷酶，重组α-半乳糖苷酶含量＞100mg/L菌液。
图4 α-半乳糖苷酶纯化结果
Fig.4 Results of purification ofα-galactosidase
2.3 链球菌S1α-半乳糖苷酶最适pH值及pH稳定性
重组链球菌S1α-半乳糖苷酶在不同pH值条件下测定酶活，结果见图5。由图5A可知，37℃条件下，Sagal在pH 5.0～7.0范围内具有80%以上的活性，pH为8.0时酶活迅速显著降低至20%以下；在pH 6.5显示最大酶活，因此该重组酶最适pH值为6.5，是一种酸性α-半乳糖苷酶。由图5B可知，重组链球菌S1α-半乳糖苷酶在pH 7.5～10.5的条件下均比较稳定，1 h内仍能保留89%以上的活性。
图5 α-半乳糖苷酶的最适pH值（A）及pH稳定性（B）
Fig.5 OptimalpH value(A)and pH stability(B)ofα-galactosidase
2.4 链球菌S1α-半乳糖苷酶最适温度及温度稳定性
重组链球菌S1α-半乳糖苷酶在35～60℃反应测定酶活，结果见图6。由图6A可知，在40～55℃的温度范围内具有80%以上的活性，并且温度为50℃时，α-半乳糖苷酶活性最高。因此，最适反应温度为50℃。由图6B可知，α-半乳糖苷酶活性在≤40℃条件下处理1h比较稳定（酶活均能保持在95%以上），在45℃处理1 h后其酶活仅保留20%以下，说明该α-半乳糖苷酶在45℃以上的高温环境中稳定性较差，适宜保存在40℃以下的环境中。
图6 α-半乳糖苷酶的最适温度（A）及温度稳定性（B）
Fig.6 Optimal temperature(A)and temperature stability(B)of α-galactosidase
2.5 链球菌S1α-半乳糖苷酶对几种天然底物降解能力检测
由于链球菌S1α-半乳糖苷酶在40℃以上温度条件下不稳定，所以为了兼顾酶的稳定性与较高的活性，选取在40℃条件下分别以蜜二糖、棉籽糖和水苏糖作为α-半乳糖苷酶的底物进行反应，反应过程中不同时间点取样，样品立即在100℃加热失活，薄层层析法检测α-半乳糖苷酶对以上3种含有α-半乳糖苷键的寡糖的水解活性，结果见图7。
图7 薄层色谱检测α-半乳糖苷酶水解蜜二糖（A）、棉籽糖（B）和水苏糖（C）的效果
Fig.7 Determ ination of hydrolysis effect ofα-galactosidase on melibiose(A),raffinose(B)and stachyose(C)by thin layer chromatography
由图7可知，随着水解时间的增加α-半乳糖酶可逐渐水解蜜二糖（图7A，水解为葡萄糖和半乳糖）、棉籽糖（图7B，水解为蔗糖和半乳糖）和水苏糖（图7C，先水解为棉籽糖和半乳糖，后棉籽糖被进一步水解为蔗糖和半乳糖），1 h内所有底物中的α-半乳糖苷键基本全部水解，说明该酶可以有效地水解这些α-半乳寡糖，具有应用于食品和饲料等工业中来避免这些α-半乳寡糖所带来的干扰的价值。
2.6 链球菌S1α-半乳糖苷酶酶学性质比较
本文研究了链球菌来源的α-半乳糖苷酶的酶活性质，其最适pH值为6.5，最适温度为50℃，且具有较高比酶活，K m也较低，k cat/K m可达567.77 L/（mmol·s）。表1列出了一些来源于真菌和细菌的α-半乳糖苷酶的酶活性质，由表1可以看出，这些α-半乳糖苷酶各有特点，链球菌S1α-半乳糖苷酶也具有一些自身的特性，在细菌来源的α-半乳糖苷酶中，其催化效率相对较高，而相对于真菌α-半乳糖苷酶，其最适温度较低，最适pH接近于中性，这些α-半乳糖苷酶相互补充可以适用于不同的需求，结合开发使用这些α-半乳糖苷酶可以更加有效地服务于生产实际需要。
表1 Sagal与一些其他的α-半乳糖苷酶酶学性质比较
Table 1 Comparison of enzymatic property of Sagalwith otherα-galactosidases
种属 最适/耐受温度 最适/耐受pH值 K m/（mmol·L-1）V Max/（μmol·min-1·mg-1）k cat/（S-1）k cat/K m/[L·（mmol·s）-1]参考文献Streptococcusspecies Talaromyces leycettanus Neosartoryafischeri Neosartoryafischeri Thermomyces lanuginosus Penicillium canescens Bispora species Debaryomyceshansenii Rhizomucorm iehei Rhizomucorm iehei Brachybacterium species Bifidibacterium longum A lkalibacterium species Bacillusmegaterium Bifidibacterium breve 50 ℃/40 ℃（1 h）70 ℃/65 ℃（1 h）60 ℃/60 ℃（10m in）75 ℃/70 ℃（1 h）65～70 ℃/60 ℃（6 h）55 ℃/50 ℃（3 h）55 ℃/65 ℃（30min）55 ℃/40 ℃（1 h）55 ℃/55 ℃（30min）45 ℃/60 ℃（30min）40℃/40 ℃（5m in）42 ℃/40 ℃（2.5 h）55 ℃/55 ℃（1 h）37 ℃/40 ℃（2 h）45 ℃/50 ℃（30min）pH 6.5/pH 7.5～10.0 pH 4.0/pH 3.0～11.0 pH 4.5/pH 2.0～12.0 pH 4.0/pH 3.0～11.0 pH 4.5～5.0/pH 3.0～7.5 pH 4.0～5.0/pH 3.0～6.0 pH 3.5/pH 2.0～8.0 pH 5.0/pH 4.6～6.2 pH 5.5/pH 5.5～9.5 pH 4.5/pH 4.5～10.0 pH 6.0/pH 5.0～10.0 pH 5.0/pH 5.0～6.0 pH 5.5/pH 5.0～10.0 pH 6.8/pH 7.0～8.0 pH 4.0/pH 4.0～6.0 1.20 1.32 0.80 2.84 0.50 0.48 3.10 0.32 0.22 0.36-2.64 0.09 1.43 508.38 389.80 449.50 1 850.00 52.40 6.89 612.90 3.60 505.50 378.90-49.60 454.55 303.03 35.71 681.32 341.00 368.6 1621 49.80 7.00 470.90 3.29-6.32-347.73 567.77 258.40 460.80 570.80 99.60 14.60 651.90 10.28-17.50-本研究[23][21][25][26][27][28][29][3][22][17][30][31][32][33]
2.7 链球菌S1α-半乳糖苷酶反应动力学
重组链球菌S1α-半乳糖苷酶林-贝氏方程曲线如图8所示。由图8可知，测得米氏常数K m为1.20mmol/L，最大反应速率V max为508.38μmol/（min·mg），催化常数k cat为681.32S-1。
图8 α-半乳糖苷酶的林-贝氏方程曲线
Fig.8 Lineweaver-Burk equation curve ofα-galactosidase
3 结论
以本实验室从牛胃溶物中分离保存的一株链球菌S1为研究对象，基于16SrDNA的遗传信息获得了该菌株α-半乳糖苷酶基因序列，并在大肠杆菌中成功异源表达。通过镍枉纯化了该α-半乳糖苷酶，每升菌液可获得100mg以上的重组α-半乳糖苷酶，其酶活显著高于原始菌株。重组α-半乳糖苷酶的最适反应pH值为6.5，最适反应温度为50℃，在碱性环境中（pH 7.5～10.5）及在40℃以下温度条件下较为稳定，该酶可以有效地水解pNPG，K m为1.20mmol/L，最大反应速率V max可达到508.38μmol/（min·mg），催化常数k cat为681.32 S-1，还可以有效地水解天然底物蜜二糖、棉籽糖和水苏糖中的α-半乳糖苷键，是酶学性质优良的α-半乳糖苷酶。
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