我国作为猕猴桃的原产国，野生资源丰富，拥有62个种，已有2 000多年的文字记载历史[1]。野生猕猴桃具有较高的营养价值和功能作用，是酿造果酒的优质资源，但因其含有较高的有机酸，造成酒体粗糙，酸味过重，通常还会伴随着酒体失光、浑浊等不良现象[2]。
苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF）是乳酸菌以L-苹果酸为底物，在苹果酸乳酸酶（malolactic enzyme，MLE）的催化作用下，转变成L-乳酸和CO2的过程[3-4]。其被认为是一个二次发酵过程，在大多数果酒的生产中发挥着不可或缺的作用。MLF可适当地降低酒体中的有机酸含量[5-6]，改善葡萄酒的稳定性[7]，降低果酒中某些有害成分[8]，是提高果酒柔和度和稳定性的重要工序，已在葡萄酒或苹果酒中广泛应用。
在传统的果酒发酵过程中，MLF是在酒精发酵刚刚完成之后进行的，可以是自然发酵，也可以是接种发酵剂发酵。然而，在复杂的酒体中，并非所有的细菌都容易生长，如低pH值（＜3.5）、高SO2（＞50mg/L）、高酒精度（＞4%vol）以及中链脂肪酸、酚类化合物（如酚酸、单宁）和酵母发酵副产物抑制蛋白质等均可以抑制乳酸菌的生长[9]。因此，筛选苹果酸-乳酸发酵的优良菌株，最基本的要求是具有良好的适应性和酿酒特性，并具有较强的苹果酸降解能力。目前，国内外猕猴桃酒优良MLF乳酸菌相关研究较少。以果酒为原料分离筛选优良MLF乳酸菌是MLF乳酸菌选育的主要手段之一[10]。
因此，本研究通过形态观察、生理生化试验从自然发酵的野生猕猴桃酒中分离筛选出能够进行MLF的乳酸菌，以商业用菌为对照菌株，对分离菌株的SO2、酒精、pH耐受能力进行研究，从而获得综合耐受能力较强的优良菌株。旨在为猕猴桃酒的工业生产提供MLF高耐受性优良菌株，同时为提高猕猴桃酒的质量和稳定性提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
野生猕猴桃果实：于2017年9月采摘自豫南大别山区，成熟度为八成。
1.1.2 菌株
果酒专用酵母：安琪酵母股份有限公司；商业乳酸菌（SY）（Leuconostoconos.b.V.D）：法国LALLEMANDS.A.公司。
1.1.3 化学试剂
过氧化氢、D-L苹果酸、乳酸、溴酚蓝、体积分数50%冰乙酸、正丁醇：国药集团化学试剂有限公司。所用试剂均为分析纯。
1.1.4 培养基
改良MRS培养基、改良番茄汁琼脂（tomato juice agar，TJA）培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；酸性番茄（acid tomato juice，ATB）培养基：招远拓普生物工程有限公司；糖发酵培养基：杭州微生物试剂有限公司；石蕊牛奶培养基：北青岛高科园海博生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
JC303型生化培养箱：南通嘉程仪器有限公司；SW-CJ-2F型双人双面净化工作台：杭州博大净化设备有限公司；JC101型电热鼓风干燥箱：西安安森智能仪器股份有限公司；WYT-J型手持糖度计：上海沪粤明科学仪器有限公司；LDZX-50FA型立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；TP310型pH计：北京时代新维测控设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 猕猴桃酒的发酵
选取新鲜、成熟的猕猴桃果实，破碎，打浆后加入0.2g/L活化果酒专用酵母启动酒精发酵。调节总SO2质量浓度为60mg/L，分装至2 L发酵罐中，在25℃条件下进行酒精发酵，待酒精发酵结束后去渣倒罐，利用猕猴桃酒体中的乳酸菌自然启动MLF。
1.3.2 苹果酸-乳酸发酵的监测
以1.5%乳酸标准液为对照，采用纸层析法[11]测定乳酸含量，进而对苹果酸-乳酸发酵进行监测。
1.3.3 苹果酸-乳酸发酵乳酸菌的分离
参照何志刚等[12]的方法，略作改动。在无菌条件下，取自然启动MLF的酒样，适当稀释后，吸取0.1m L酒样均匀涂布于ATB培养基，在28℃条件下培养5～6 d，挑取圆形且稍扁平的单菌落在MRS培养基上进行分离纯化，获得纯菌株进行编号。
1.3.4 形态观察
参照周安玲[13]的方法，略作改动。将适当稀释度的分离菌悬液分别涂布于TJA培养基，于25℃条件下恒温培养2～3 d，逐一观察菌落的形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、颜色等特点，并分别进行革兰氏染色，在油镜下观察细胞形态。
1.3.5 生理生化试验
对分离菌株进行乳糖发酵试验、触酶试验和石蕊牛奶试验，参照《伯杰细菌鉴定手册》[14]、《葡萄酒酿造微生物学-实验技术与规程》[15]及《乳酸细菌基础、技术和应用》[16]对试验结果进行分析，筛选出具有MLF能力的乳酸菌。
1.3.6 耐受性试验
一般情况下，乳酸菌代谢糖类的适宜温度为22～25℃，且MLF速度较快，挥发酸较多；在15～20℃条件下，MLF速度稍慢，酒体成分也会发生相应变化；10℃以下，乳酸菌的生长会受到抑制。因此，本试验选择在25℃条件下，参照段浩云等[17]的方法（略作改动）研究筛选菌株的耐受性。具体方法：挑取适量保存于TJA斜面的菌株分别接种于10mLATB液体培养基中，25℃条件下活化24～48h。取1m L种子液（107 CFU/m L）分别接种于9m L不同SO2质量浓度（40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L）、酒精度（8%vol、10%vol、12%vol、14%vol、16%vol）、pH值（2.8、3.0、3.2、3.4、3.6）的MRS液体培养基中，25 ℃条件下静置培养2 d，在显微镜下用血细胞计数板对活菌进行计数，筛选出综合耐受性能较好的乳酸菌。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌的分离筛选
对自然启动MLF的野生猕猴桃酒样中的乳酸菌进行分离、纯化，得到6株疑似乳酸菌，均呈革兰氏阳性，分别编号为R6、R7、R11、R14、R15、R18，6株疑似乳酸菌的菌落形态及细胞形态详细描述见表1。
表1 分离菌株的菌落和细胞形态结果
Table 1 Colonialand cellmorphology of isolated strains
菌株编号 菌落形态 细胞形态R6 R7 R11 R14 R15 R18 0.8～1.5mm，白色，中央凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，不透明1.0～1.8mm，白色，中央平整，边缘整齐，表面光滑，半湿润，不透明1.1～1.6mm，乳白色，中央平整，边缘整齐，表面光滑，湿润，不透明1.0～1.5mm，白色，中央平整，边缘整齐，表面不光滑，半湿润，不透明0.9～1.5mm，乳白色，中央凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，不透明1.0～1.6mm，灰白色，中央凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，不透明长杆形，成对或成链状短杆状，单个或链状排列短杆状，链状排列球形，成链排列短杆状，单个或链状排列球形，成链排列
由表1可知，分离得到的6株疑似乳酸菌菌落较小，菌落直径在0.8～1.8mm，圆形，白色、乳白色或灰白色，均不透明。其中菌株R6、R11、R15、R18菌落表面光滑、湿润；菌株R7和R14菌落表面半湿润；菌株R14菌落表面不光滑；菌株R6、R15、R18菌落中央凸起，菌株R7、R11、R14菌落中央平整。菌株R14和R18细胞呈球形，成链排列；其他菌株细胞形态为短杆状或长杆状，单个或成对或链状排列。
对6株分离菌株分别进行乳糖发酵试验、触酶试验、石蕊牛奶试验，结果表明，6株分离菌株触酶试验均为阴性，牛奶石蕊试验和乳糖发酵试验均为阳性。结合菌落形态和细胞形态初步鉴定6株菌均为乳酸菌。
2.2 分离菌株耐受性研究
2.2.1 SO2耐受能力
SO2是果酒酿造中广为使用的添加剂，其主要作用是防止酒体褐变和避免杂菌的污染。但是乳酸菌的生长对SO2较为敏感，在已报道的菌株中，大多菌株的SO2耐受能力＜60mg/L[18]，为防止酒体氧化褐变和杂菌大量繁殖而导致挥发酸含量升高，寻找具有耐受高SO2能力的乳酸菌株成为MLF进程中的关键。因此，以商业乳酸菌SY为对照，对分离得到的6株乳酸菌的SO2耐受性进行测定，结果见表2。
表2 分离菌株的SO2耐受性
Table 2 SO2 tolerance of isolated strains
注：以（A）b形式表示乳酸菌对SO2的耐受能力，其中，A表示活菌数增长倍数，A＞1表示活菌数呈正增长；A＜1表示活菌数呈负增长。b表示活菌数级别，“+++”、“++”、“+”、“-”分别表示平板记数法培养液中的菌体密度达108 CFU/m L、107 CFU/m L、106 CFU/m L、＜105 CFU/m L或不生长。下同。
菌株编号R6 R7 R11 R14 R15 R18 SY(3.8±0.10)++(2.7±0.20)+++(2.0±0.20)++(2.5±0.20)++(1.9±0.40)+++(2.4±0.20)++(2.6±0.20)++(5.4±0.18)+(6.1±0.60)+(4.7±0.10)+(4.2±1.50)+(2.7±0.20)++(3.2±0.80)-(8.0±0.20)+(1.4±0.18)+(2.4±0.10)+(2.1±0.20)-(2.6±0.10)-(1.3±0.40)+(2.1±0.20)-(1.6±0.40)+(0.8±0.02)-(1.0±0.19)+(0.9±0.02)-(1.2±0.32)-(0.2±1.06)-(0.9±0.20)-(1.0±0.18)-(0.2±0.04)-(0.7±0.02)-(0.3±0.10)-(0.6±0.06)-(0.5±0.12)-(0.3±0.02)-(0.6±0.20)-SO2含量/（mg·L-1）40 60 80 100 120
由表2可知，当SO2含量为40mg/L时，所有菌株活菌数＞107 CFU/m L，最高可达108 CFU/m L；当SO2含量为60mg/L时，除菌株R18外，其他菌株均表现出较强的SO2耐受能力，活菌数均＞106 CFU/m L；当SO2含量为80mg/L时，菌株R6、R7、R15表现出较强的SO2耐受能力，活菌数均＞106 CFU/m L；当SO2含量为100mg/L时，菌株R6、R11、R15、R18均呈现负增长趋势，且处于不生长状态，菌株R7仍表现出较好的耐受能力，菌株R14未出现负增长，但处于不生长状态；当SO2含量为120mg/L时，6株分离菌均呈现负增长趋势，且处于不生长状态。从杆菌与球菌之间来看，整体上杆菌对SO2的耐受能力高于球菌。以SO2质量浓度为80mg/L时，商业乳酸菌SY的增殖量为标准，可筛选确定SO2耐受能力较强的菌株为R6、R7和R15，其中，菌株R7的SO2耐受能力最强。
2.2.2 酒精耐受能力
在猕猴桃酒发酵过程中，酵母菌代谢的主要产物是乙醇，随着发酵的进行，猕猴桃酒中酒精度越来越高，一般可达10%vol～14%vol。酒精度是抑制乳酸菌生长的重要因素，过高的酒精度可影响乳酸菌的新陈代谢活动，抑制其生长。因此，以商业乳酸菌SY为对照，对分离得到的6株乳酸菌的酒精耐受性进行测定，结果见表3。
表3 分离菌株的酒精耐受性
Table 3 Alcohol tolerance of isolated strains
菌株编号R6 R7 R11 R14 R15 R18 SY(5.3±0.40)+++(6.7±0.60)+++(5.0±0.30)+++(3.9±0.20)++(4.6±0.20)+++(5.4±0.60)++(6.6±0.40)+++(1.4±0.10)+++(2.1±0.24)+++(1.8±0.17)++(8.2±1.50)++(1.7±0.60)++(6.9±0.28)+(8.0±0.20)++(6.7±0.20)+(4.4±0.80)++(2.1±0.20)+(5.2±0.10)+(7.3±0.26)+(3.8±0.20)-(5.6±0.10)++(1.8±0.12)+(2.0±0.60)+(4.9±0.60)-(2.2±0.40)-(1.8±1.24)-(3.3±0.20)-(4.0±0.30)++(1.1±0.09)-(1.3±0.60)-(3.4±0.02)-(1.6±0.06)-(2.5±0.12)-(6.3±0.11)-(1.2±0.02)+酒精度/%vol 8 10 12 14 16
由表3可知，酒精度对分离乳酸菌的生长均表现出一定程度的抑制作用，随着培养基中酒精度由8%vol逐渐增大，对乳酸菌的抑制作用逐渐增强，两者呈显著正相关（P＜0.05）。当酒精度为8%vol时，6株菌株的活菌数均＞107 CFU/mL，生长状况良好；当酒精度为10%vol时，菌株R11、R15、R18的活菌数下降一个级别，而菌株R6、R7的活菌数依然为108 CFU/m L；当酒精度增至12%vol时，所有分离菌株的活菌数均下降一个级别，其中菌株R18降至105 CFU/m L以下或不生长；当酒精度为14%vol时，6株分离菌株酒精耐受能力继续下降，大部分菌株不生长，而筛选菌株R6和R7的活菌数仍为106 CFU/m L，表现出较强的酒精度耐受力，但均低于商业乳酸菌SY；当酒精度增至16%vol时，分离菌的活菌数均降至105 CFU/m L以下或不生长。参照菌株SY在酒精度12%vol的活菌数，确定酒精度耐受性较强的菌株为R7，整体上杆菌对酒精的耐受能力高于球菌。
2.2.3 pH值耐受能力
不同乳酸菌对pH值的适应能力不同，大部分的乳酸菌最适生长pH接近中性[19]，也有一些种属如酒球菌属（Oenococcus）和乳杆菌（Lactobacillus）是嗜酸的[20]。猕猴桃酒体的pH值一般在2.8～3.6范围内变化，因此，以商业乳酸菌SY为对照，对分离得到的6株乳酸菌的pH值耐受性进行测定，结果见表4。
由表4可知，pH值对分离乳酸菌的生长均表现出一定程度的抑制作用，随着培养基中pH由3.6逐渐降低，对乳酸菌的抑制作用逐渐增强，两者呈显著负相关（P＜0.05）。当pH值为3.6时，6株乳酸菌活菌数均＞107 CFU/m L，总体生长较好，其中菌株R6、R15和R18的活菌数达到108 CFU/m L；当pH值下降到3.4时，除菌株R11、R18外，其他菌株活菌数均下降一个级别，活菌数开始显著下降；当pH值下降到3.2时，活菌数继续显著下降，其中，菌株R14下降到105 CFU/m L以下或不生长；当pH值下降到3.0时，活菌数继续显著下降，但菌株R15仍表现出较好的pH值耐受能力；当pH值下降到2.8时，分离菌株及商业乳酸菌SY的活菌数均不增长。整体上杆菌对pH的耐受能力高于球菌。参照商业乳酸菌SY，菌株R15的pH耐受性较好。
表4 分离菌株的pH值耐受性
Table 4 pH tolerance of isolated strains
菌株编号R6 R7 R11 R14 R15 R18 SY(4.3±0.20)-(3.1±0.08)-(5.8±1.30)-(2.2±0.10)-(6.7±0.60)-(3.1±0.20)-(5.6±1.28)-(1.7±0.10)-(6.0±0.30)-(2.6±0.20)-(4.2±0.20)-(1.9±0.42)+(5.3±0.60)-(10.5±0.80)-(3.2±0.20)+(2.4±1.26)+(1.8±0.20)+(8.1±0.10)-(4.0±0.20)+(3.8±0.20)+(3.4±0.10)+(2.2±0.10)++(6.8±1.70)+(4.9±0.60)++(2.5±0.40)+(2.3±0.60)++(3.9±0.20)++(5.1±1.13)++(1.8±0.23)+++(3.5±0.90)++(4.2±0.13)++(2.6±0.87)++(3.7±0.20)+++(8.4±0.60)++(2.3±0.20)+++pH值2.8 3.0 3.2 3.4 3.6
综上，可以初步认为在从自然启动MLF的野生猕猴桃酒中分离得到的6株乳酸菌中，菌株R6、R7和R15的SO2、酒精及pH耐受性较好，可以作为猕猴桃酒的生物降酸优良菌株，对果酒生物降酸技术的提升及果酒质量的提高有着重要意义。
3 结论
采用ATB培养基，通过形态观察及生理生化试验从自然启动MLF野生猕猴桃酒中初筛得到6株乳酸菌，分别为R6、R7、R11、R14、R15、R18。通过对6株乳酸菌的SO2、酒精及pH耐受性的研究发现，分离菌株中乳酸杆菌的耐受能力高于球菌。其中，3株乳酸菌（R6、R7、R15）具有较强的SO2、酒精及pH耐受能力，菌株R6、R15在SO2 80mg/L及菌株R7在SO2 100mg/L可维持生长；菌株R6、R7在酒精度14%vol及菌株R15在酒精度12%vol可维持生长；菌株R6、R7在pH值3.2及菌株R15在pH 3.0时可维持生长。结果表明，菌株R6、R7、R15可以作为MLF优良乳酸菌进一步开发与应用的研究对象。
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