沙蟹汁是北海特有的传统美食，是以沿海滩涂野生沙蟹为原料，通过天然发酵的方法制成的一款纯天然、无任何添加剂的绿色食品。该产品有两百多年的历史，具有味道鲜美、口感醇厚等特点，深受沿海地区消费者喜爱。“沙蟹汁焖豆角”、“沙蟹汁蘸白切鸡”、“沙蟹汁蘸白灼虾”等北海特色名菜都是以沙蟹汁为调味料制作而成的。沙蟹汁的生产还是传统的手工工艺，存在质量不稳定、腥味重、色泽差等问题，另外沙蟹汁的核心发酵机制尚不明确。要对其质量进行改善，必须先明确其发酵机制。目前对沙蟹汁报道较少，刘天天等[1]利用分子感官科学技术对沙蟹汁风味行了分析；梁中永[2]对沙蟹汁中的不良风味物质进行检测及去除研究，尚少见对沙蟹汁发酵过程中微生物的分析进行报道。
目前，对发酵鱼露、发酵鱼、发酵豆制品等发酵食品中微生物的研究已有所报道，并通过对微生物的分析，对传统发酵工艺进行改进提供了一定的理论基础；如黄紫燕等[3]对传统鱼露发酵过程中的微生物进行了分析，并通过外加微生物对鱼露的发酵工艺进行了改进[4]。齐宁利等[5]利用分子生物学高通量测序对江洪鱼露发酵过程中微生物菌相组成进行分析，发现乳酸菌和酵母菌为鱼露发酵过程中的优势菌。朱雯娟等[6]对梅香鱼发酵过程中的微生物进行筛选，并确定发酵菌株为木糖葡萄球菌（Staphylococ-cusxylosus）、嗜盐四联球菌（Tetragenococcushalophilus）及腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus），利用发酵菌株对梅香鱼进行发酵，更好的改善了鱼制品的品质。许家威等[7]研究了腐乳前酵期微生物与理化指标之间的联系，为工业化生产腐乳提供了一定的理论依据。
本实验利用传统发酵工艺制备沙蟹汁，研究发酵过程中不同阶段微生物的变化，检测总氮、氨基酸态氮、挥发性盐基氮、游离氨基酸等理化指标，将理化指标与微生物的变化结合分析，试图找出微生物与理化指标之间的关系，明确微生物的作用，探讨沙蟹汁发酵机理，为沙蟹汁的工艺改良提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沙蟹、姜、海盐：市售；营养琼脂（nutrientagar，NA）培养基：北京陆桥技术股份有限公司；氯化钠、氢氧化钠、硼酸、盐酸、碳酸钾、阿拉伯胶、甘油、甲基红指示剂、次甲基蓝指示剂、甲醇、盐酸、甲醛（36%）、硫酸（均为分析纯）：西陇化工股份有限公司；细菌通用引物27F、1492R：生工生物工程（上海）有限公司；M ightyAmp脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶、2×M ightyAmp Buffer：大连Takara公司。
1.2 仪器与设备
SPX-150B-Z型生化培养箱、SW-CJ-2F型洁净工作台：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；JB-1B型磁力搅拌器、PHS-3C型pH计：上海雷磁仪器有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）基因扩增仪：珠海黑马医学仪器有限公司；Vapodest450全自动凯氏定氮仪：德国格哈特（Gerhardt）分析仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 沙蟹汁的制作
新鲜沙蟹清洗、去肠，沥干至无水流下为止，沙蟹5 kg、姜300 g，一起捣碎，加入2 kg海盐，搅匀，继续捣碎，加入3 L凉开水，搅匀，装缸，封存，25℃发酵15 d，即为沙蟹汁。
1.3.2 微生物检测
按照传统工艺制备沙蟹汁，每隔3 d在无菌环境中取发酵液进行分析。取样前，将沙蟹汁混匀，于4 000 r/min离心10m in后取上清液，梯度稀释后选取3个合适的稀释度涂布于营养琼脂培养基，25℃培养48 h，选取菌落数在30～300之间平板计数，1个稀释度选择3个平板。根据菌落形态挑取不同的菌，划线分离纯化至镜检观察为纯培养物，斜面保存。
1.3.3 微生物的16S rDNA鉴定
分离微生物的鉴定利用27F和1492R细菌通用引物作为正反向引物，利用M ightyAmp DNA Polymerase进行细菌菌落聚合酶链式反应（PCR）扩增[8]。PCR扩增体系：27 F 1.5μL，1492R 1.5μL，M ightyAmp DNA Polymerase 1.5μL，2×M ightyAmp Buffer 30μL，双蒸水（ddH2O）25.5μL，扩增条件：98℃（预变性）2min，98℃（变性）10 s，55℃（复性）15 s，68℃（延伸）90 s，72℃延伸10min，从变性到第一次延伸这个过程循环40次[6]，将PCR产物送至上海生工公司测序，将测序结果利用BLAST搜索程序从GenBank进行同源性检索，并下载相似性高的模式菌株的16S rDNA基因序列进行分析。
1.3.4 理化指标测定
总氮含量的测定：采用凯氏定氮法[9]；氨基酸态氮含量的测定：参照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》甲醛滴定法[10]；挥发性盐基氮含量的测定：参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》康维皿法（微量扩散法）[11]；氨基酸含量的测定：参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》[12]。
1.3.5 数据分析
采用Excel2016及Origin 8.0对数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 菌种的分离纯化及鉴定
本实验采用传统培养法从不同发酵时间的沙蟹汁分离出5种微生物，将5种微生物的16S rDNA序列，经BLAST在线比对得出相似菌株，5种微生物菌落形态及相似菌株如表1所示。
表1 5种微生物菌落形态及16S rDNA序列比对结果
Table 1 Comparison results of colony morphology and 16S rDNA of 5 m icroorganisms
菌株编号 菌落形态 相似菌株 相似度/% NCBI登录号1 2 3 4 5乳白色，菌落呈圆形，边缘整齐黄色，菌落呈圆形，边缘整齐白色，菌落较大，边缘不整齐，形态不规则粉色至红色，菌落呈圆形，边缘整齐灰白色，不透明，菌落较大，表面粗糙马胃葡萄球菌（Staphylococcusequorum subsp.）阿尔莱特葡萄球菌（Staphylococcusarlettae）腐生葡萄球菌（Staphylococcussaprophyticus）解淀粉盐水球菌（Salinicoccusamylolyticus）蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）99.93 99.79 99.51 99.44 99.86 ATCC43958（T）ATCC43957（T）ATCC15305（T）JC304（T）ATCC14579（T）
由表1可知，沙蟹汁发酵过程中主要有5种微生物，分别是马胃葡萄球菌（Staphylococcusequorum subsp.）、阿尔莱特葡萄球菌（Staphylococcusarlettae）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、解淀粉盐水球菌（Salinicoccus amy-lolyticus）及蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）。马胃葡萄球菌在发酵产品中已有报道，吴丽红[13]在川香味香肠腌制、自然发酵、烘烤和经真空包装后保藏过程中分离出马胃葡萄球菌，马胃葡萄球菌为整个过程中的优势菌；陈学云等[14]从盐干带鱼中分离出3株马胃葡萄球菌，3株腐生葡萄球菌；李欣等[15]从锦州虾酱中分离产蛋白酶嗜盐菌，分离得到4株马胃葡萄球菌，证明马胃葡萄球菌具有产蛋白酶能力；谢科[16]利用传统培养技术、聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradientgel electrophoresis，PCR-DGGE）指纹图谱分析得到，阿尔莱特葡萄球菌为广式腊肠发酵过程中的优势菌群之一。李丙超等[17]对传统发酵香肠中菌种进行了分子生物学鉴定，指出腐生葡萄球菌含量比较丰富。发酵产品中对解淀粉盐水球菌的报道较少，SRINIVASA等[18]从盐地里分离得到一株解淀粉盐水球菌，并对其特性进行研究表明，该菌株最适生长盐度为25%，沙蟹汁盐度为24%，适合解淀粉盐水球菌的生长。
2.2 沙蟹汁发酵过程中微生物的变化
沙蟹汁发酵过程中菌落总数变化结果如图1所示。由图1可知，沙蟹在绞碎后，未进行发酵时存在一定的微生物，其可能来源于空气或者沙蟹内部存在的微生物，在发酵的过程中适合发酵环境的微生物继续生存，不适合发酵环境的微生物被淘汰掉。在发酵前3 d时，沙蟹汁中微生物数量急剧增加，达到2.6×107 CFU/m L；发酵3 d后，微生物数量减少，其可能的原因是高盐度使得大多数不适合生存的微生物死亡，沙蟹汁发酵速度缓慢。
图1 沙蟹汁发酵过程中菌落总数变化
Fig.1 Changes of totalnumber of bacterial colony in crab sauce fermentation process
沙蟹汁发酵过程中各种微生物的变化结果如图2所示。由图2可知，沙蟹汁发酵过程中（0～15 d）优势微生物为马胃葡萄球菌；发酵0～3 d有阿尔莱特葡萄球菌出现；发酵第6天有腐生葡萄球菌出现；发酵6～15 d时蜡样芽孢杆菌数量大幅增加；发酵第9天时出现解淀粉盐水球菌。表明从发酵第6天开始出现腐败现象。
图2 沙蟹汁发酵过程中微生物组成变化
Fig.2 Changes ofm icrobiologicalcompositions in crab sauce fermentation process
2.3 沙蟹汁发酵过程中理化指标变化
2.3.1 沙蟹汁发酵过程中氨基酸态氮含量的变化
沙蟹汁发酵过程中氨基酸态氮含量变化结果如图3所示。由图3可知，沙蟹汁发酵过程中氨基酸态氮在前6 d迅速增加，6 d以后增加缓慢，在第15天时，沙蟹汁中氨基酸态氮含量达到0.43 g/100m L，达到三级鱼露氨基酸态氮含量标准[19]。氨基酸态氮的变化是蟹肉在微生物及酶的共同作用结果，沙蟹汁中5种微生物有一定的产蛋白酶能力，但产蛋白酶能力较弱，说明其发酵过程中前期氨基酸态氮的变化主要是沙蟹自身内源酶作用的结果。在发酵前期，内源酶活性较高，底物浓度较大，氨基酸态氮含量迅速增加；随着发酵时间的延长，内源酶酶活性降低，主要依靠微生物蛋白酶酶解，此外到发酵后期，蟹肉被酶解完全，所以氨基酸态氮含量变化缓慢。
图3 沙蟹汁发酵过程中氨基酸态氮含量变化
Fig.3 Changes of am ino acid nitrogen contents in crab sauce fermentation process
2.3.2 沙蟹汁发酵过程中挥发性盐基氮含量变化
挥发性盐基氮是产品发酵过程中腐败微生物作用的产物，标志着水产品新鲜与否的质量指标。沙蟹汁发酵过程中挥发性盐基氮含量的变化结果见图4。由图4可知，沙蟹汁在发酵过程中挥发性盐基氮含量增加，发酵前期增加缓慢，发酵12～15 d增加迅速。发酵15 d时，沙蟹汁中挥发性盐基氮含量为105mg/100m L，这与发酵过程中蜡样芽孢杆菌数量增加有关。ANIHOUVIVB等[20]研究报道，经自然发酵的木薯鱼挥发性盐基氮含量达到（264.7～389.9）mg/100g；GASSEM M A等[21]对沙特阿拉伯腌渍发酵鱼微生物及理化性质进行研究表明，其挥发性盐基氮含量范围为（32.2～131.82）mg/100 g。较高的挥发性盐基氮的含量表明氨基酸被破坏的越多，为产品安全性带来隐患，需要对其控制进行研究。
图4 沙蟹汁发酵过程中挥发性盐基氮含量变化
Fig.4 Changes of volatile basic nitrogen contents in crab sauce fermentation process
2.3.3 沙蟹汁发酵过程中总氮含量变化
沙蟹汁发酵过程中总氮含量的变化结果如图5所示。由图5可知，沙蟹汁发酵过程前9d总氮含量上升至0.76g/100m L，其原因可能是因为在前9 d，内源酶活性较高，分解蟹肉蛋白的能力较强，这与发酵前期沙蟹汁氨基态氮含量增加较快的结论一致，但在9～12 d时，沙蟹汁总氮含量降低，其原因可能是微生物的代谢消耗较多，由2.2可以看出，发酵至第9 d时，解淀粉盐水球菌出现，代谢较快，消耗总氮，导致其总氮含量下降。发酵第12天时，蜡样芽孢杆菌数量增加，这也导致2.3.2中挥发性盐基氮的大幅度增加，由于蜡样芽孢杆菌产蛋白酶，使得沙蟹汁中总氮和氨基酸态氮增加，并且此时沙蟹汁中活菌数降低，微生物消耗量也减少，最终导致产品中总氮含量上升。
图5 沙蟹汁发酵过程中总氮含量变化
Fig.5 Changes of totalnitrogen contents in crab sauce ferm entation process
2.4 沙蟹汁发酵过程中游离氨基酸含量的变化
沙蟹汁发酵过程中游离氨基酸含量变化结果如表2所示，由表2可知，在发酵前6 d，沙蟹汁中游离氨基酸的含量增加，达到3.06g/100m L，6 d后游离氨基酸的量变化缓慢，后期略有降低，这说明沙蟹蟹肉的酶解主要是在前6d，这与2.3.1氨基酸态氮含量的变化相符。后期降低可能是因为腐败微生物的作用，发酵环境发生变化，游离氨基酸转变为挥发性盐基氮等物质，这与齐利宁等[5]对江洪鱼露发酵过程中氨基酸分析结果相似。在所有游离氨基酸中，谷氨酸的含量最高，在沙蟹汁发酵过程中谷氨酸含量略有增加，谷氨酸为鲜味氨基酸，是水产品调味料鲜味的主要来源。其次沙蟹汁发酵过程中含量较高的氨基酸还有天冬氨酸、丙氨酸及精氨酸，刘天天[1]研究表明，沙蟹汁中甘氨酸、天冬氨酸、丙氨酸及精氨酸滋味活性值（tasteactive value，TAV）均＞1，是沙蟹汁鲜味成分的主要贡献者。沙蟹汁中鲜味氨基酸的增加主要在前6 d，到后期了增加缓慢然后略有降低。
表2 沙蟹汁发酵过程中游离氨基酸的组成与含量
Table 2 Composition and content of free am ino acid in crab sauce fermentation process g/100 m L
注：“*”表示人体必需氨基酸。
氨基酸天门冬氨酸（Asp）苏氨酸（Thr）*丝氨酸（Ser）谷氨酸（Glu）脯氨酸（Pro）甘氨酸（Gly）丙氨酸（Ala）缬氨酸（Val）*蛋氨酸（Met）*异亮氨酸（Ile）*亮氨酸（Leu）*酪氨酸（Tyr）苯丙氨酸（Phe）*赖氨酸（Lys）*组氨酸（His）精氨酸（Arg）氨基酸总量0.30 0.13 0.11 0.40 0.16 0.21 0.26 0.15 0.098 0.13 0.20 0.17 0.084 0.18 0.079 0.23 2.89 0.31 0.14 0.12 0.45 0.18 0.22 0.30 0.17 0.087 0.13 0.21 0.13 0.078 0.22 0.076 0.25 3.07 0.33 0.15 0.12 0.46 0.16 0.22 0.29 0.18 0.096 0.16 0.25 0.12 0.081 0.23 0.087 0.25 3.18 0.34 0.15 0.12 0.46 0.16 0.21 0.28 0.16 0.078 0.15 0.24 0.097 0.080 0.22 0.083 0.23 3.06 0.30 0.13 0.11 0.42 0.16 0.21 0.30 0.16 0.056 0.15 0.22 0.11 0.088 0.21 0.077 0.23 2.93 0.29 0.13 0.12 0.42 0.17 0.21 0.27 0.17 0.060 0.16 0.23 0.19 0.086 0.21 0.076 0.20 2.99发酵时间/d 0 3 6 9 12 15
3 结论
沙蟹汁发酵过程中微生物主要有马胃葡萄球菌、阿尔莱特葡萄球菌、腐生葡萄球菌、解淀粉盐水球菌及蜡样芽孢杆菌，其中马胃葡萄球菌为优势菌。发酵过程中菌落总数在第3天达到2.6×107 CFU/m L，高盐度导致后期降低，最终达到7.6×105 CFU/m L。氨基酸态氮含量在整个发酵过程中增加，前期增加较快，后期变的缓慢，其含量最终达到0.43 g/100m L，挥发性盐基氮含量前期增加较慢，后期增加较快，最终含量达到105mg/100m L，总氮和游离氨基酸含量均呈现先增加后降低，最终分别达到0.72 g/100m L、2.99 g/100m L。
沙蟹汁发酵过程中，微生物产蛋白酶能力较弱，发酵前期蟹肉的酶解主要是沙蟹体内内源酶的作用，后期主要是微生物蛋白酶酶解，其理化指标的变化与微生物有一定的联系。本研究明确了沙蟹汁发酵过程中微生物与理化指标变化之间的联系，为沙蟹汁的研究及传统工艺的改进奠定了一定的基础。
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