青钱柳（Cyclocarya paliurus）是我国特有的珍稀植物，药食同源，因具有降血糖、降血压等功效而有“神茶”之誉[1]，并于2013年被收录在新资源食品目录[2]，安全无毒使其作为普通的食品食用[3]，据现代药理研究证明其含有的黄酮具有明显的降血糖、抗氧化功效[4-5]，若是能将其加工制得日常低糖饮品，符合现代人对健康绿色食品的需求[6]。但是青钱柳特有的苦涩味使得直接加工的产品的适口性较差，不适合大众消费。有研究表明通过发酵工艺可去除青钱柳的苦涩味以改善风味[7]，但是在发酵过程中需要添加大量的糖类作为益生菌发酵的碳源，不符合现在大众的低糖消费观。葛根为豆科植物野葛的干燥根，其活性成分异黄酮的干基含量为0.5%～5.0%[8-9]，其具有降血压、抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力、防治骨质疏松等功效[10-15]，同时葛根中含有大量的优质淀粉，淀粉含量约为葛根的20%～40%，其中直链淀粉占21%[16]。但是目前对葛根的利用还只是提取总黄酮或淀粉，对葛根的综合利用率不高[17]，若能将其淀粉水解为糖类，作为益生菌发酵的碳源，既提高了葛根的利用率，又可降低产品中的含糖量。
本试验利用α-淀粉酶和糖化酶水解葛根，使得淀粉水解为葡萄糖等糖类，制得葛根汁，然后与青钱柳液以一定的比例混合，采用分步发酵法，优化青钱柳-葛根复合发酵型饮料发酵工艺，研制出含糖量低、酸甜适口的具有一定保健功能的发酵型饮料，为低糖型饮料的开发和青钱柳及葛根的开发利用提供一定的技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料和菌株
青钱柳：江西修水；葛根、白砂糖：市售；酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillusplantarum subsp.plantarum）：江西省食品发酵研究所。
1.1.2化学试剂
α-淀粉酶（1万U/g）：邢台万达生物工程有限公司；糖化酶（5万U/g）：博立生物制品有限公司；纤维素酶（10万U/g）：和氏璧生物科技有限公司；半纤维素酶（10万U/g）：浙江一诺生物科技有限公司；芦丁（纯度＞98%）：酷尔化学科技（北京）有限公司。其余试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：蛋白胨10 g/L，酵母膏粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 6.0±0.2，121 ℃灭菌20 min。
MRS培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L；酵母膏5g/L；柠檬酸氢二铵2 g/L；葡萄糖20 g/L；吐温-80 1 mL；乙酸钠5 g/L；磷酸氢二钾2 g/L；硫酸镁0.58 g/L；pH 6.4±0.2，121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
JYL-G12E破壁机：九阳股份有限公司；HHS21-6恒温水浴锅：江苏金坛市瑞华仪器有限公司；WAY-Z自动阿贝折光仪：上海仪电物理光学仪器有限公司；ML204电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SPX-100B-Z生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SP-756PC分光光度计：上海光谱仪器有限公司；1 000 μL移液枪：上海荣泰生物工程有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 青钱柳-葛根复合发酵型饮料加工工艺流程
青钱柳叶和葛根的预处理→青钱柳液和葛根汁混合→调糖→一次灭菌→接种酵母→一次发酵→二次灭菌→接种植物乳杆菌植物亚种→二次发酵→三次灭菌→成品1.3.2操作要点
（1）青钱柳液的制备
将青钱柳叶清洗干净，与水以料液比1∶1（g∶mL）混合打浆，加热至60℃，加入纤维素酶和半纤维素酶保温酶解3 h，每隔15 min搅拌一次，冷却，先纱布后定性滤纸过滤，滤液冷藏备用。
（2）葛根汁的制备
将葛根清洗干净切块，与水以料液比1∶2（g∶mL）混合打浆，加热至85℃后保温糊化30 min；加入α-淀粉酶在85℃条件下液化约2 h使淀粉完全液化（碘试反应呈棕红色），每隔15 min搅拌一次；将液化完全的葛根升温至100℃保持5 min灭酶，随后降温至60℃并保持，加入糖化酶搅拌并保温2 h，使其充分糖化；纱布过滤，滤液冷藏备用。
（3）调糖
青钱柳液与葛根汁以一定的比例混合后，添加白砂糖使其糖度达到18°Bx，121℃灭菌15 min，即得发酵原液。
（4）一次灭菌
90℃灭菌15min，以保证酵母纯种发酵。
（5）种子液的培养
酵母的活化：将2环酵母接种至10 mLYPD培养基中，25℃培养24h，然后将其接种至100mLYPD培养基中，25℃扩大培养24 h，即得酵母种子液[18]。
植物乳杆菌植物亚种的活化：取两环植物乳杆菌植物亚种，接种至100 mLMRS培养基中，37℃培养2 d，即得植物乳杆菌植物亚种种子液。
（6）一次发酵
接种一定量的酵母至发酵原液，于30℃发酵条件下发酵一定时间后，得一次发酵液。
（7）二次灭菌
一次发酵液在90℃条件下灭菌15 min，保证后续植物乳杆菌植物亚种纯种发酵。
（8）二次发酵
接种植物乳杆菌植物亚种至一次发酵液，于37℃发酵条件下发酵一定时间后，得到二次发酵液。
（9）三次灭菌
二次发酵液在90℃条件下灭菌15 min，得成品。
1.3.3 青钱柳-葛根复合发酵型饮料工艺优化单因素试验
试验以青钱柳液与葛根汁体积比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1）、一次发酵酵母接种量（0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%）、一次发酵时间（16 h、20 h、24h、28h、32h）、二次发酵植物乳杆菌植物亚种接种量（1%、2%、3%、4%、5%）和 二次发酵时间（16 h、20 h、24 h、28 h、32 h）为考察因素，以总黄酮含量和感官评分为评价指标，确定最佳的发酵工艺参数。
1.3.4 青钱柳-葛根复合发酵型饮料工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，以感官评分为评价指标，以青钱柳液与葛根汁比例（A）、酵母接种量（B）、一次发酵时间（C）和植物乳杆菌植物亚种接种量（D）为考察因素，进行4因素3水平L9（34）正交试验，以确定最佳的发酵工艺，正交试验因素与水平见表1。
表1 青钱柳-葛根复合发酵型饮料发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation technology optimization ofCyclocarya paliurus-Radix Pueariae compound fermented beverage
水平 A青钱柳液与葛根汁比例（V/V）B酵母接种量/%C一次发酵时间/d D植物乳杆菌植物亚种接种量/%1 2 3 1∶1 2∶1 3∶1 0.25 0.50 0.75 22 24 26 2.5 3.0 3.5
1.3.5 分析检验
（1）总黄酮含量的测定
芦丁标准曲线的制备：参考文献[19]以芦丁标准溶液质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制芦丁标准曲线。
样品中总黄酮的提取及含量测定：称取灭菌后的发酵液2.0g，加入体积分数为80%的乙醇摇匀，微波加热70 s，冷却至室温后抽滤，将滤液用体积分数为80%的乙醇定容至100mL，避光保存为待测液。取待测液3mL于10mL容量瓶中，参照芦丁处理方法处理待测液，在波长510 nm处测定吸光度值，按照芦丁标准曲线回归方程计算样品中总黄酮含量。
（2）感官评定标准
邀请20名具有感官评定能力的人员，对发酵所得的饮料进行感官评分，满分100分，感官评定标准见表2。
表2 青钱柳-葛根复合发酵型饮料感官评定标准
Table 2 Sensory evaluation standards ofCyclocarya paliurus-Radix Pueariae compound fermented beverage
评价指标 评价标准 分值/分香味（30分）口感（40分）酒精味淡，青钱柳和葛根味浓，无杂味酒精味稍重，青钱柳和葛根味较淡酒精味强烈，几乎无青钱柳和葛根味，欠协调酸甜适中，口感细腻，醇厚偏酸或偏甜，口感较好色泽（30分）过酸，口感差金黄色，清澈透明黄色，比较清澈偏褐色，比较清澈20～30分10～20分0～10分25～40分15～25分0～15分20～30分10～20分5～10分
（3）理化指标测定
酒精度：按照国标GB/T 13662—2018《黄酒》中的蒸馏比重法；总酸（以乳酸计）：按照国标GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的pH电位法；pH值：pH计测定；糖度：自动阿贝折光仪测定。
（4）微生物指标
细菌总数、大肠菌群及致病菌（沙门氏菌、金黄色葡萄球菌）按照国标GB/T 7101—2015《食品安全国家标准饮料》中的规定执行。
2 结果与分析
2.1 芦丁标准曲线的绘制
图1 芦丁标准曲线
Fig.1 Standard curve of rutin
以芦丁标准溶液质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制芦丁标准曲线，结果见图1。由图1可知，芦丁标准曲线回归方程为：y=9.857 9x+0.009 4，相关系数为R2=0.999，表明二者线性关系良好。
2.2 发酵工艺优化单因素试验
图2 青钱柳液与葛根汁比例对复合发酵饮料品质的影响
Fig.2 Effect ofCyclocarya paliurusliquid and Radix Pueariae juice ratio on the quality of compound fermented beverage
2.2.1 青钱柳液与葛根汁比例的确定由图2可知，随着青钱柳液比例的增加，复合发酵饮料中的总黄酮含量也随之升高，当青钱柳液与葛根汁体积比为2∶1时，复合发酵饮料中的总黄酮含量达到最高为6.417 mg/g，这是因为青钱柳总黄酮含量高于葛根[20-21]；感官评分随着青钱柳液比例的增加呈现先上升后下降的趋势，当青钱柳液与葛根汁体积比为2∶1时，在这个比例条件下发酵的饮料感官评分最高，为87分。因此，最佳的青钱柳液与葛根汁体积比为2∶1。
2.2.2 一次发酵酵母接种量的确定
图3 酵母接种量对复合发酵饮料品质的影响
Fig.3 Effect of yeast inoculum on the quality of compound fermented beverage
由图3可知，当酵母的接种量为0.10%～0.50%时，随着酵母接种量的增加，总黄酮含量与感官评分都随之增加，这是因为随着酵母接种量的增加，产生的酒精也在增加，为此总黄酮的提取率随之增加[22]，同时酵母在发酵过程中可以除去青钱柳的涩味，为此感官评分也在增加；当酵母的接种量为0.50%时，总黄酮含量与感官评分均达到最高，分别为为6.557 mg/g和88分；当酵母的接种量为0.50%～0.60%时，随着酵母接种量的增加，总黄酮含量几乎不变，而感官评分随之降低，这是因为随着酵母接种量越大，大部分糖转化为酒精使得酒精味过重和酸甜不调和。因此，确定最佳的酵母接种量为0.50%。
2.2.3 一次发酵时间的确定
图4 一次发酵时间对复合发酵饮料品质的影响
Fig.4 Effect of first fermentation time on the quality of compound fermented beverage
由图4可知，一次发酵时间为16～24 h时，随着发酵时间的增加，总黄酮含量与感官评分均随之增加；一次发酵时间为24～32 h时，随着发酵时间的延长，总黄酮含量几乎不变，但感官评分随之下降，原因可能是因为大量的糖被分解使得植物乳杆菌植物亚种后续发酵几乎无碳源，不利于乳酸发酵导致产生的乳酸少，进而使得饮料酸甜不协调；一次发酵时间为24 h时，总黄酮含量与感官评分分别为6.449mg/g和90分。因此，确定最佳一次发酵时间为24h。
2.2.4 二次发酵植物乳杆菌植物亚种接种量的确定
图5 植物乳杆菌植物亚种接种量对复合发酵饮料品质的影响
Fig.5 Effect ofLactobacillus plantarumsubsp.plantaruminoculum on the quality of compound fermented beverage
由图5可知，植物乳杆菌植物亚种的接种量为1%～5%时，复合发酵饮料中的总黄酮含量几乎没有变化，说明总
黄酮含量的变化主要与酵母的发酵有关；当植物乳杆菌植物亚种的接种量为1%～3%时，感官评分随着接种量的增加而升高，当植物乳杆菌植物亚种的接种量为3%时，感官评分达到最高，为90分；随后随着植物乳杆菌植物亚种接种量的增加，感官评分呈稳定趋势。因此，确定最佳的植物乳杆菌植物亚种接种量为3%。
2.2.5 二次发酵时间的确定
图6 二次发酵时间对复合发酵饮料品质的影响
Fig.6 Effect of second fermentation time on the quality of compound fermented beverage
由图6可知，植物乳杆菌植物亚种发酵时间为12～16 h时，随着发酵时间的增加复合发酵饮料中的总黄酮含量和感官评分均均随之增加，这可能是因为植物乳杆菌植物亚种发酵前期产生的酶促进黄酮的合成[23]，植物乳杆菌植物亚种发酵产生大量有机酸赋予产品柔和的口感；植物乳杆菌植物亚种发酵时间为12～16 h时，随着发酵时间的增加复合发酵饮料中的总黄酮含量和感官评分均无明显的变化，为此选定二次发酵时间为16 h。
2.3 发酵工艺优化正交试验结果与分析
在单因素试验的基础上，考察青钱柳液与葛根汁比例、酵母接种量、一次发酵时间和植物乳杆菌植物亚种接种量这4个因素对青钱柳-葛根复合发酵型饮料的影响，进行L9（34）正交试验，考虑饮料的适口性，以感官评分为评价指标，确定青钱柳-葛根复合发酵型饮料二次发酵的最佳工艺，正交试验结果与分析见表3。
由表3可知，通过极差分析可知4个因素对青钱柳-葛根复合发酵型饮料的影响大小依次为C＞A＞D＞B，即一次发酵时间对青钱柳-葛根复合发酵型饮料的感官品质影响最大，青钱柳液与葛根汁体积比次之，酵母的接种量影响最小。青钱柳-葛根复合发酵型饮料最佳发酵工艺组合为A1B2C2D3，即青钱柳液与葛根汁体积比为1∶1，酵母接种量为0.5%，一次发酵时间为24 h，植物乳杆菌植物亚种的接种量为3.5%。在此最佳工艺条件下，生产的青钱柳-葛根复合发酵型饮料感官评分为91分。在此最佳工艺条件下进行3次平行验证试验，感官评分为91.7分。
表3 青钱柳-葛根复合发酵型饮料发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization ofCyclocarya paliurus-Radix Pueariae compound fermented beverage
试验号 A B C D 感官评分/分1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2 k3 R 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 1 2 3 3 1 2 2 3 1 85.0 91.0 83.5 90.0 81.0 87.0 79.5 83.0 86.5 86.500 86.000 83.000 3.500 84.833 85.000 65.667 0.834 85.000 89.167 81.333 7.834 84.167 85.333 85.500 1.433
2.4 青钱柳-葛根复合发酵型饮料的品质分析
感官指标：具有青钱柳和葛根的清香味，口感柔和，酸甜适口。理化指标：酒精度为0.2%vol，总酸为2.49g/L，糖度为8.3 °Bx，pH值为3.58。微生物指标：细菌总数＜50CFU/mL，大肠菌群＜2 MPN/100 mL，致病菌未检出。青钱柳-葛根复合发酵型饮料的品质指标满足相关国标要求。
3 结论
本试验以青钱柳液和经α-淀粉酶和糖化酶水解的葛根汁为原料，利用酵母和植物乳杆菌植物亚种先后发酵制备青钱柳-葛根复合发酵型饮料。青钱柳-葛根复合发酵型饮料的最佳发酵工艺条件为：青钱柳液与葛根汁体积比1∶1，酵母接种量0.50%，一次发酵时间24 h，植物乳杆菌植物亚种的接种量3.5%，二次发酵时间16 h。在此优化条件下，青钱柳-葛根复合发酵型饮料具有青钱柳和葛根的清香味，口感柔和，酸甜适口，感官评分达91.7分，酒精度为0.2%vol，总酸为2.49 g/L，糖度为8.3 °Bx，pH值为3.58，总黄酮含量达5.15 mg/g。
[1]盛雪萍，赵梦鸽，蒋翠花，等.青钱柳和桑叶配伍组方的降血糖作用[J].中国药科大学学报，2018，49（4）：463-469.
[2]SHIN S O,SEO H J,PARK H,et al.Effects of Mulberry leaf extract on blood glucose and serum lipid profiles in patients with type 2 diabetes mellitus:a systematic review[J].Eur J Integ Med,2016,8(5):602-608.
[3]李婷婷，石叶，吴彩娥，等.青钱柳的化学成分、农残及挥发性成分分析[J].食品与机械，2015，31（4）：10-13.
[4]WANG Q Q,JIANG C H,FANG S Z,et al.Antihyperglycemic,antihyperlipidemic and antioxidant effects of ethanol and aqueous extracts of Cyclocarya paliurusleaves in type 2 diabetic rats[J].J Ethnopharmacol,2013,150(3):1119-1127.
[5]李婷婷，吴彩娥，方升佐，等.青钱柳冲剂对糖尿病小鼠的降血糖功效[J].食品科学，2012，33（15）：287-290.
[6]张广曾.茶饮料市场营销常见问题及解决对策[J].福建茶叶，2018，40（12）：61.
[7]SMIT G,SMIT B A,ENGELS W J M.Flavour formation by lactic acid bacteria and biochemical flavour profiling of heese products[J].Fems Microbiol Rev,2005,29(3):591-610.
[8]CHEN S B,YANG D J,CHEN S L,et al.Seasonal variations in the isoflavonoids of Radix Puerariae[J].Phytochem Analysis,2007,18(3):245-250.
[9]KIRAKOSYAN A,KAUFMAN P B,WARBER S,et al.Quantification of major isoflavonoids and L-canavanine in several organs of kudzu vine(Pueraria montana)and in starch samples derived from kudzu roots[J].Plant Sci,2003,164(5):883-888.
[10]赖建有，李兴波.葛根的化学成分和药理作用和用途[J].农业与技术，2018，38（20）：36.
[11]XIONG F L,SUN X H,GAN L.Puerarin protects rat pancreatic islets from damage by hydrogen peroxide[J].Eur J Pharmacol,2006,529(1):1-7.
[12]MEEZAN E,MEEZAN E M,JONES K,et al.Contrasting effects of puerarin and daidzin on glucose homeostasis in mice[J].J Agr Food Chem,2005,53(22):8760-8767.
[13]CHUNG M J,SUNG N J,PARK C S.Antioxidative and hypocholesterolemic activities of water-soluble puerarin glycosides in Hep G2 cells and in C57 BL/6J mice[J].Eur J Pharmacol,2008,578(2-3):159-170.
[14]WANG J F,GUO Y X,NIU J Z,et al.Effects of Radix Pueariae flavones on liver lipid metabolism in ovariectomized rats[J].World J Gastroenterol,2004,10(13):1967-1970.
[15]YUAN S Y,TONG S,LIU L Q,et al.Puerarin prevents bone loss in ovariectomized mice and inhibits osteoclast formationin vitro[J].Chinese J Nat Med,2016,14(4):265-269.
[16]吴琼，刘奕，吴庆园，等.不同干燥方式对葛根全粉抗氧化性能和香气成分的影响[J].食品科学，2017，38（6）：202-208.
[17]骆开明.葛根饮料的研制[J].科技信息（学术研究），2008，32（13）：55-61.
[18]曹敬华，丁建设，杨裕才，等.胡柚果酒酿造工艺优化[J].中国酿造，2018，37（10）：111-115.
[19]黄静，郝文芳.万年蒿总黄酮超声波提取工艺的优化[J].食品与发酵工业，2012，45（1）：218-233.
[20]章发胜，张学英.野生树和人工种植青钱柳叶黄酮类物质含量的比较分析[J].中国标准化，2018，24（20）：161-164.
[21]吴迪，刘平平，李萌，等.葛根水提液及葛根发酵液的体外抗氧化及抗衰老功效评价[J].食品工业科技，2019，40（12）：285-290，294.
[22]邓佑林，彭继升，李芳，等.青钱柳中黄酮成分提取工艺的优化及微量元素分析[J].化工技术与开发，2016，45（4）：1-4.
[23]魏朝治，辛雪，陈蕾蕾，等.乳酸菌在黄酮类化合物生物转化中的应用[J].中国酿造，2016，35（10）：13-17.