臭豆腐是中国传统的特色小吃，是一类以大豆为主要原料的发酵豆制品，从魏到明清时代均有大量史料记载，具有悠久的历史[1]。臭豆腐可以分为两大种类，一类是发酵型臭豆腐，另一类是非发酵型臭豆腐[2-4]。臭豆腐“闻着臭”是因为大豆蛋白质在蛋白酶的作用下分解，所含的硫氨基酸充分水解，产生硫化氢化合物，这种化合物具有刺鼻的臭味。但蛋白质分解后产生氨基酸，又使得口感鲜美“吃着香”[5]。
发酵型臭豆腐中含有的维生素（vitamin B12，VB12）可以预防老年痴呆[6]；含有的植物性乳酸菌[7]能够对肠胃起到调节作用；含有的大豆异黄酮具有美容养颜、预防心血管疾病、预防肥胖症等功效。所以发酵型臭豆腐因其味道特别，口感好，营养价值高，而广受欢迎[8-10]。
在传统臭豆腐加工的基础上，采用鲁氏毛霉（Mucor rouxianus）接种的前发酵方式[11]，选取协调性好且功能和香气明显的辅料，加入具有降脂功效的干制荷叶、可以改善口感的干制薄荷和增香明显的干制茉莉花，以赋予臭豆腐更多的营养价值和不同的感官体验，为发酵型臭豆腐的新产品研制提供了新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大豆、食盐、油脂：武夷山双好超市；干制薄荷、干制茉莉花、干制荷叶：武夷山市永晖药店；毛霉菌粉（鲁氏毛霉，有效活菌数≥110×108个/g）：锦润生物科技有限公司；盐卤：天津市塘沽金轮盐化有限公司。
平板计数琼脂、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤、煌绿乳糖胆盐肉汤、7.5%氯化钠肉汤、Baird-Parker琼脂平板、脑心浸出液肉汤（brain heart infusion broth，BHI）培养基：广东环凯微生物科技有限公司；血平板：江门市凯林贸易有限公司；铅、铬、镉标准样品：国家有色金属及电子材料分析测试中心。
1.2 仪器与设备
ZHJH-1109B超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司；MDS-6G微波消解仪：上海新仪微波化学技术有限公司；UV-3200PC紫外可见光分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；ZA-3000原子吸收分光光度计：日立高新技术公司；KDN-CZ定氮仪：上海新嘉电子有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 发酵型薄荷、茉莉花、荷叶臭豆腐加工工艺流程及操作要点
操作要点：
①混合浸提液的制备：分别按照薄荷、茉莉花、荷叶1g、1 g、1 g；1 g、5 g、5 g；1 g、5 g、10 g；5 g、5 g、10 g；5 g、10 g、10 g的比例称取干制薄荷、干制茉莉花和干制荷叶，放置于4 000 g清水中，沸水煮制5～8 min，晾凉、过滤后备用。
②豆腐坯加工：取饱满、富有光泽、无虫蛀、无霉变的大豆500g，洗净、浸泡，采用用薄荷、茉莉花、荷叶混合浸提液反复磨浆。豆浆经过滤后置于锅中煮沸，冷却到82～85℃时开始点浆，再经过蹲脑、成型制成豆腐[12]。将豆腐切成4.5 cm×4.5 cm×1.5 cm的豆腐坯，备用。
③毛霉菌悬液的配制：称取1～5g的毛霉菌粉置于无菌烧杯中，添加60 g无菌水，搅拌均匀，转入无菌喷雾器备用。
④前发酵：将切好的豆腐坯均匀放置于消毒好的双层锅中，豆腐之间须保持间隔。将配制好的毛霉菌溶液均匀的喷于每块豆腐的各个面上，置于15～35℃，相对湿度96%条件下进行前期发酵1～5 d，当豆腐表面长有浓密的“白毛”时前发酵结束。
⑤搓霉盐腌：将豆腐坯表面的“白毛”搓平，贴在豆腐块的表面，形成“皮”，有利于腐乳成型，按层装入已消毒并烘干的泡菜坛中，每放置一层，豆腐表面撒盐一次，直至豆腐全部置于坛中，用盐量为0～200 g，隔水密封3 d。
⑥后发酵：取出盐腌完毕的豆腐胚晾干后放在整片荷叶上，用荷叶包紧。再置于洗净消毒烘干后的泡菜坛中，倒入调配好的含盐量6%的黄浆水，以黄浆水淹没豆腐5 cm为宜[13-14]。最后，使用由石灰和猪血调配而成的猪血灰封坛。
⑦成品：发酵约15d后，氨基酸态氮含量达到0.4g/（100g）时，发酵结束，得到薄荷、茉莉花、荷叶臭豆腐成品。1.3.2前发酵工艺优化单因素试验
以500 g豆腐坯为基准，从浸提液中薄荷、茉莉花、荷叶添加量、毛霉菌粉添加量、前发酵温度、前发酵时间、腌制用盐量五个方面进行发酵型薄荷、茉莉花、荷叶臭豆腐发酵单因素试验。设置薄荷、茉莉花、荷叶浸提液添加量分别为：1 g、1 g、1 g；1 g、5 g、5 g；1 g、5 g、10 g；5 g、5 g、10 g；5g、10g、10 g。毛霉菌粉添加量分别为1 g、2 g、3 g、4 g、5 g。前发酵温度分别为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃；前发酵时间分别为1 d、2 d、3 d、4 d、5 d；腌制用盐量分别为100 g、150 g、200g、250 g、300 g。以感官评分为评价指标，采用单一因素变量法试验，每组单因素试验重复3次，取平均值。1.3.3前发酵工艺优化正交试验
在上述单因素试验的基础上设计正交试验[15-16]，以毛霉菌粉添加量（A）、前发酵温度（B）、前发酵时间（C）、腌制用盐量（D）为影响因素，以感官评分为评价指标，采用L9（34）进行正交试验优化，因素与水平如表1所示。
表1 发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization
水平 A毛霉菌粉添加量/g B前发酵温度/℃C前发酵时间/d D腌制用盐量/g 1 2 3 2 3 4 20 25 30 2 3 4 100 150 200
1.3.4 发酵型薄荷、茉莉花、荷叶臭豆腐感官评价
制作完成的发酵臭豆腐油炸后进行感官评定。参照国标GB 2712—2014《食品安全国家标准豆制品》[17]及商业标准SB/T 10527—2009《臭豆腐（臭干）》[18]中感官指标要求，结合薄荷、茉莉花、荷叶臭豆腐自身特点，发酵型薄荷、茉莉花、荷叶臭豆腐感官评价标准见表2，满分100分，所得分数平均值作为感官评分[19]。
表2 发酵型薄荷、茉莉花、荷叶臭豆腐感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of fermented stinky tofu with peppermint,jasmine and lotus leaf
指标 感官评价要求 分值/分色泽（20分）滋味（30分）组织状态（20分）表面色泽呈黄褐色，切面为白色，色泽度好表面色泽呈墨黑色或黄色，横切面为浅绿色，稍有光泽表面色泽过黑，横切面为深灰色或黄绿色，无光泽表皮口感爽脆，略咸，切面口感细腻鲜嫩，无不良滋味表皮口感爽脆，稍咸，切面口感干涩、滋味一般，无不良滋味表皮口感爽脆，过咸，切面口感干涩，带有些许不良滋味豆腐块型整齐，内部结构紧密，弹度好，无杂质豆腐块型整齐，内部结构较紧密，弹度一般，无杂质豆腐块型松弛，内部结构不紧密，弹度差，带有些许杂质13～20 7～13 1～7 20～30 10～20 1～10 13～20 7～13 1～7
续表
指标 感官评价要求 分值/分具有臭豆腐显著的臭味，入口后略带薄荷的清新口感20～30气味 臭豆腐的臭味一般，薄荷的清新感不明显且能明显感觉10～20（30分） 到荷叶气味臭豆腐的臭味一般，入口无薄荷感，有其他异味1～10
1.3.5 检测方法
水分的测定采用直接干燥法；蛋白质含量采用凯氏定氮法[20]；大肠菌群采用大肠菌群计数法第一法[21]；铅含量采用国标GB 5009.12—2017《食品中铅的测定》[22]；镉含量采用国标GB 5009.15—2014《食品中镉的测定》[23]；铬含量采用国标GB 5009.123—2014《食品中铬的测定》[24]。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果与分析
2.1.1 薄荷、茉莉花、荷叶浸提液添加量对发酵型臭豆腐感官质量的影响
图1 薄荷、茉莉花、荷叶浸提液添加量对发酵型臭豆腐感官质量的影响
Fig.1 Effect of extract addition of peppermint,jasmine and lotus leaf on sensory quality of fermented stinky tofu
由图1可知，薄荷、茉莉花、荷叶浸提液添加量对成品的感官品质有影响。当薄荷、茉莉花、荷叶浸提液添加量均为1 g时，成品臭豆腐仅有薄荷的清凉口感，没有茉莉花和荷叶的香气。当薄荷、茉莉花、荷叶浸提液添加量分别为1 g、5 g、10 g时，成品臭豆腐既有茉莉花和荷叶的香气，又有薄荷的清凉口感，口感最为协调。当薄荷、茉莉花、荷叶浸提液添加量为5 g、5 g、10 g时，成品臭豆腐薄荷味太明显，掩盖了荷叶和茉莉花的清香。当薄荷、茉莉花、荷叶浸提液添加量分别为5 g、10 g、10 g时，薄荷味掩盖了荷叶和茉莉花的清香，豆腐坯颜色为黄绿色，颜色过深。因此，选择薄荷、茉莉花、荷叶浸提液添加量分别为1 g、5 g、10 g。
2.1.2 毛霉菌粉添加量对发酵型臭豆腐感官质量的影响
由图2可知，毛霉菌粉添加量对成品的感官品质有很大的影响，当毛霉菌粉添加量为1～3 g时，菌丝生长过程中无法覆盖豆腐坯的表面；当毛霉菌粉添加量为3 g时，发酵型臭豆腐“白毛”生长适度，豆腐坯的表面刚好被“白毛”所覆盖，毛霉菌产生的蛋白酶分解豆腐坯中蛋白质，使成品臭豆腐具有发酵型臭豆腐的独特香味，感官评分最高，为86分；当毛霉菌粉添加量＞3 g之后，会产生大量菌丝，使臭豆腐坯的“白毛皮”太厚，导致成品的感官品质下降。因此，选择毛霉菌粉添加量为3 g。
图2 毛霉菌粉添加量对发酵型臭豆腐感官质量的影响
Fig.2 Effect of mould powder addition on sensory quality of fermented stinky tofu
2.1.3 前发酵温度对发酵型臭豆腐感官质量的影响
图3 前发酵温度对发酵型臭豆腐感官质量的影响
Fig.3 Effect of pre-fermentation temperature on sensory quality of fermented stinky tofu
由图3可知，当前发酵温度在15～25℃时，随着发酵温度的升高，温度越来越适宜于毛霉菌的生长；当前发酵温度为25℃时，毛霉菌菌丝生长情况最好，“白毛”可覆盖整个豆腐坯表面，毛霉菌产生的蛋白酶多，对豆腐坯蛋白质分解程度高，成品感官评价分数最高，为87分；当前发酵温度＞25℃之后，随着前发酵温度的升高，越来越不适宜于毛霉菌的生长，而越来越适宜于嗜温型细菌的生长，豆腐坯表面发黏，不能被“白毛”覆盖，蛋白质分解差，成品感官评价降低。因此，选择前发酵温度为25℃。
2.1.4 前发酵时间对发酵型臭豆腐感官质量的影响
臭豆腐前发酵时间对成品的感官品质影响很大，前发酵时间的长短是臭豆腐前发酵是否进行充分的重要控制手段。由图4可知，在发酵温度25℃时，随着前发酵时间在1～3 d范围内延长，臭豆腐发酵程度越好，感官品质越来越好；发酵3 d时发酵充分，且成品感官评分最高，为86分；前发酵时间＞3 d之后，发酵时间太长，毛霉菌菌丝体老化，甚至出现自溶现象，导致成品的感官品质下降。因此，选择前发酵时间为3 d。
图4 前发酵时间对发酵型臭豆腐感官质量的影响
Fig.4 Effects of pre-fermentation time on sensory quality of fermented stinky tofu
2.1.5 腌制用盐量对发酵型臭豆腐感官质量的影响
食盐是一种调味物质，被称为百味之源，食品中添加食盐后可提高原料风味，衬托发酵产品的香味，并可协调其他风味物质，使产品的风味更加鲜美、柔和[25]。由图5可知，当食盐添加量为100～150 g时，臭豆腐滋味寡淡，特殊的香味不突出；当食盐添加量为150 g时，咸淡适宜，臭豆腐特殊香味突出，成品感官品质最佳，感官评分为88分；当食盐添加量＞150 g之后，成品臭豆腐味道太咸，掩盖了臭豆腐本身的香味，而且食用过多的食盐易引起高血压等疾病。综上所述，食盐添加量为150 g。
图5 腌制用盐量对发酵型臭豆腐感官质量的影响
Fig.5 Effects of salt addition on sensory quality of fermented stinky tofu
2.2正交试验结果与分析
在单因素试验结果的基础上，对发酵型薄荷、茉莉花、荷叶臭豆腐发酵工艺进行L9（34）正交试验优化，其试验结果见表3，方差分析见表4。
表3 发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization
试验号 A B C D 感官评分/分1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2 k3 R 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 1 2 3 3 1 2 2 3 1 85.2 93.5 73.7 85.2 75.6 90.4 75.3 79.8 74.6 84.133 83.733 76.567 7.566 81.900 82.967 79.567 3.400 85.133 84.433 74.867 10.266 78.467 86.400 79.567 7.933
极差R值的大小可以反应出各因素的影响程度，由表3可知，影响发酵型薄荷、茉莉花、荷叶臭豆腐发酵效果的各因素的大小顺序为C＞D＞A＞B，即前发酵时间＞腌制用盐量＞毛霉菌粉添加量＞前发酵温度。根据极差分析的结果确定发酵型薄荷、茉莉花、荷叶臭豆腐的较优发酵工艺参数为A1B2C1D2，即毛霉菌粉添加量2 g、前发酵温度25℃、前发酵时间2 d、腌制用盐量150 g。对方差分析的较优组合A1B2C1D2及正交试验时得分最高试验组A1B2C2D2进行3次重复验证试验，感官评分分别为（90.8±0.21）分和（93.3±0.15）分。因此发酵型薄荷、茉莉花、荷叶臭豆腐的最佳发酵工艺组合为：A1B2C2D2，即毛霉菌粉添加量2g、前发酵温度25℃、前发酵时间3 d、腌制用盐量150 g。
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results
注：F0.05=19.00；F0.01=99.00。
变异来源 自由度 平方和 均方差 F临界值A B C D误差2 2 2 2 1 8 163.163 27.213 296.123 166.263 0.443 368.04 61.38 667.95 375.03合计26 326.33 54.43 592.25 332.53 7.980 1 313.51
由表4可知，A（毛霉菌粉添加量）、C（前发酵时间）、D（腌制用盐量）均对结果有极显著的影响（P＜0.01），B（前发酵温度）对结果有显著的影响（P＜0.05），且影响的主次顺序为C＞D＞A＞B，进一步验证了极差分析的结果。
2.3 发酵型臭豆腐品质分析
发酵所得的薄荷、茉莉花、荷叶臭豆腐表面呈黄褐色，油炸后呈金黄色；具有臭豆腐显著“臭味”；口感酥脆，有荷叶和茉莉花香气及薄荷的清新口感，无不良滋味。经测定发酵型臭豆腐在最佳工艺条件下的水分为83 g/100 g，蛋白质为6.0g/100 g，氨基酸态氮为0.45 g/100 g，致病菌未检出，大肠菌群29 MPN/100 g，铅0.403 3 mg/kg，镉0.039 1 mg/kg，铬0.041 8 mg/kg。各指标均符合SB/T 10527—2009《臭豆腐（臭干）》中理化指标要求及GB 2712—2014《食品安全国家标准豆制品》中卫生指标要求。
3 结论
试验在单因素的基础上，通过正交试验对发酵型薄荷、茉莉花、荷叶臭豆腐的发酵工艺条件进行了优化。结果表明：500 g黄豆磨浆时，所用的薄荷、茉莉花、荷叶混合浸提液为4 000 g水中加入薄荷1 g、茉莉花5 g、荷叶10 g所得；发酵工艺参数为豆腐胚500 g、毛霉菌添加量2 g、前发酵时间3 d、食盐150 g、前发酵温度25℃。在此优化发酵工艺条件下，发酵所得的薄荷、茉莉花、荷叶臭豆腐感官评分为93分，呈黄褐色，口感酥脆，有荷叶和茉莉花香气及薄荷的清新口感。成品质量指标均符合国家相关标准。
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