酸奶是美味、营养、健康的乳制品[1]，而且丰富的营养价值和良好的保健功能也使其成为全球普及最广的发酵乳制品[2]。市售酸奶按形态主要分为凝固型、搅拌型和饮用型3种类型[3]。饮用型酸奶是一种低黏性的可饮用酸奶[4]，是近10年来销量增长最快的酸奶类型[5]，一般以发酵乳经二次调配或二次均质处理而制成。
益生菌是一类可以通过改善肠道菌群平衡而对动物产生有利影响的微生物制剂[6]。其主要功能在于改善微生物和酶的平衡[7]，从而保持肠道正常菌群平衡，抑制有害菌和有害物质，提高免疫力，缓解乳糖不耐症，降低胆固醇等[8-10]。目前，益生菌产品成为全球最大的功能性食品市场。益生菌在人体内发挥益生作用的前提条件是进入胃肠道后能够存活并且增殖[11]。有研究显示，每日摄入108～109个益生菌即可发挥其对人体的益生作用[12-13]。
发酵乳制品是益生菌产品的主要载体，但益生菌凝乳效果差，因此在实际生产中，通常将益生菌与普通酸奶发酵剂混合应用，来提高发酵乳的凝乳效果[14]。
本研究旨在从有功效文献支撑的益生菌发酵剂入手，通过添加蛋白补充剂取代食品添加剂，以期获得一种高蛋白饮用型纯益生菌发酵乳配方。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
全脂牛乳（蛋白质≥3.1%）、白砂糖：市售；全脂加糖炼乳（以下简称炼乳）、稀奶油（脂肪≥35%）：德国DMK公司；蛋黄粉：太阳食品（天津）有限公司；浓缩牛奶蛋白600A：法国IDI公司；菌种F-DVS ABC（嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、乳双岐杆菌（Bifidobacterium lactis）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei））、菌种TH-4（嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus））：丹麦科汉森公司。
氢氧化钠、酚酞、体积分数95%的乙醇（均为分析纯）：天津市光复精细化工研究所；七水硫酸钴（分析纯）、硫酸（分析纯）：广州化学试剂厂；定氮片：瑞士FOSS公司；异戊醇、乙腈（均为分析纯）：天津大茂化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
RW20数显电动搅拌机：德国艾卡公司；APV1000均质机：APV（中国）有限公司；HPP1恒温培养箱、WPE45恒温水浴锅：德国Memmert公司；JJ2000B电子天平：常熟市双杰测试仪器厂；S220多参数测试仪：梅特勒-托利多（上海）有限公司；8200凯氏定氮仪：瑞士FOSS公司；EssentiaLC-15高效液相色谱仪：日本岛津公司；MS3超声波振荡器：德国艾卡公司；CXE-RZ50乳脂离心机：德国海道夫公司。
1.3 试验方法
1.3.1 工艺流程及操作要点
全脂牛乳、白砂糖、炼乳、稀奶油、蛋黄粉、浓缩牛奶蛋白600A→混合→均质→杀菌→冷却→接种→恒温发酵→无菌均质→冷却→灌装→后熟冷藏→成品
原料混合：配料时先将白砂糖、蛋黄粉、浓缩牛奶蛋白600A分别称取后混合，将符合国标GB 19301—2010《食品安全国家标准生乳》要求的全脂牛乳预热至45～50℃，在高速搅拌（500 r/min）过程中加入已混合的配料及稀奶油、全脂加糖炼乳，并在45～50℃温度条件下搅拌30 min，使得所有物料充分溶解水合。
均质：在63～65℃、18～20 MPa条件下进行均质，使得乳脂肪球破碎，避免在发酵过程以及后期储藏过程中出现脂肪上浮的现象。
杀菌：90～95℃杀菌5 min。
冷却：冷却温度为37～43℃。
接种：9.5 g脱脂乳粉溶于90.5 mL 50℃的纯净水中，加热煮沸放凉后制成接种液，按0.2U/kg的添加量加入试验菌种，制成发酵剂，根据试验设计要求接种。
恒温发酵：于一定发酵温度条件下恒温发酵5 h。
无菌均质：产品到达发酵终点后进行无菌均质。
冷却灌装：均质后的酸奶冷却至20℃灌装至塑瓶中，每瓶200 mL。
后熟冷藏：在2～6℃条件下后熟冷藏24 h，即得成品。
1.3.2 高蛋白饮用型纯益生菌发酵乳发酵条件优化单因素
试验
在生牛乳添加量≥80%（总质量），白砂糖添加量为7%，稀奶油添加量为2.5%，炼乳添加量为2%，蛋黄粉添加量为0.1%的条件下，分别调整浓缩牛奶蛋白600A添加量（4.4%、5.2%、6.0%、6.8%、7.6%）、发酵剂接种量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%），分别在发酵温度（37℃、39℃、41℃、43℃、45℃）发酵5.5 h，分别在不同二次均质压力（0 MPa、2 MPa、4 MPa、6 MPa、8 MPa）均质并冷却灌装。测定成品的酸度和感官评分。
1.3.3 高蛋白饮用型纯益生菌发酵乳发酵条件优化正交
试验
在单因素试验的基础上，以感官评分和酸度为考察指标，进行4因素3水平正交试验，正交试验因素与水平见表1。
表1 高蛋白纯益生菌发酵饮用型发酵乳发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of fermented milk with high protein and pure probiotic
水平 A浓缩牛奶蛋白600A添加量/%B接种量/%C发酵温度/℃D均质压力/MPa 1 2 3 5.2 6.0 6.8 1.5 2.0 2.5 41 43 45 2 4 6
1.3.4 测定方法
（1）感官评定标准
以30人为一个评价小组，每次评定时由每个评定员单独进行，互不交流，样品评定间用清水漱口，满分100分。感官评定标准如表2所示[15]。
表2 酸奶感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of yoghurt
色泽（10分） 乳清析出（20分） 黏稠度（20分） 奶油感（20分） 酸甜度（10分） 酸奶特征滋味（20分）表面光滑，乳白色，浊度高 无析出或微量析出 黏度适中 幼滑爽口，奶油感强，无颗粒感、粉质感 酸甜适中 酸奶特征滋味明显8～10分15～20分15～20分15～20分8～10分15～20分光泽度稍差，颜色发黄 少量析出 黏度略稀或略稠 细腻度和奶油感稍差 稍甜或酸 特征滋味稍淡4～7分11～14分11～14分11～14分4～7分11～14分颜色异常，浊度低 严重析出 黏度过稀或过稠 幼滑度和奶油感较差，能感到粉质感或颗粒感 过甜或过酸 特征滋味淡或有异味＜4分 ＜11分 ＜11分 ＜11分 ＜4分 ＜11分
（2）理化指标
酸度：按照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》[16]中的方法测定；蛋白质：按照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[17]中的方法测定；脂肪：按照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[18]中的方法测定。
（3）微生物指标的测定
乳酸菌数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、酵母、霉菌：按照国标GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》[19]中的方法测定。
2 结果与分析
2.1 高蛋白饮用型纯益生菌发酵乳条件优化单因素试验
2.1.1 浓缩牛奶蛋白600A添加量的确定
由图1可知，随着浓缩牛奶蛋白600A添加量的增大，产品的酸度呈上升趋势，由104.3°T上升至149.3°T，感官评分呈先上升后下降的趋势；在浓缩牛奶蛋白600A添加量为6.0%时，感官评分最高，为90.6分。继续增大浓缩牛奶蛋白600A添加量，产品组织状态变稠，细腻度变差，感官评分下降。因此选择最佳浓缩牛奶蛋白600A添加量为6.0%。
图1 浓缩牛奶蛋白600A添加量对高蛋白饮用型纯益生菌发酵乳质量的影响
Fig.1 Effect of milk protein concentrate 600A addition on the quality of fermented milk with high protein and pure probiotic
2.1.2 发酵剂接种量的确定
酸奶的发酵剂是直接影响酸奶最终品质的主要因素之一[20]，酸奶发酵剂中菌株的种类和含量都会影响酸奶的风味和口感。由图2可知，产品的感官评分随着发酵剂接种量的增加呈先上升后下降的趋势，而酸度则呈上升趋势；当发酵剂接种量为2.0%时，产品的感官评分最高，为88.6分，此时产品酸甜适中，风味柔和，组织状态细腻；当接种量继续上升，产品的酸度升高，整体口感变差。因此选择最佳发酵剂接种量为2.0%。
图2 发酵剂接种量对高蛋白饮用型纯益生菌发酵乳质量的影响
Fig.2 Effect of starter inoculum on the quality of fermented milk with high protein and pure probiotic
2.1.3 发酵温度的确定
发酵温度的控制对酸奶品质至关重要，嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、副干酪乳杆菌的最适生长温度为37℃；嗜热链球菌的最适生长温度为40～45℃，因此本试验中酸奶的发酵温度设定在37～45℃的范围内进行对比。由图3可知，随着发酵温度的升高，产品酸度从98.0°T上升至144.5°T；感官评分随着发酵温度的升高呈先上升后下降的趋势；在发酵温度为43℃时感官评分达到最高，为90分，此时产品酸度为128.4°T。因此选择最佳发酵温度为43℃。
图3 发酵温度对高蛋白饮用型纯益生菌发酵乳质量的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on the quality of fermented milk with high protein and pure probiotic
2.1.4 二次均质压力的确定
均质压力的大小直接影响产品的黏度和口感。由图4可知，均质压力的大小对产品酸度几乎没有影响，而感官评分则随着均质压力的升高呈先上升后下降的趋势；均质压力为4 MPa时评分最高，为89分。说明均质压力过高或过低会导致产品黏度偏低或偏高，最终造成产品口感评分偏低。因此最佳均质压力为4 MPa。
图4 均质压力对高蛋白饮用型纯益生菌发酵乳质量的影响
Fig.4 Effect of homogenized pressure on the quality of fermented milk with high protein and pure probiotic
2.2 高蛋白纯益生菌饮用型发酵乳发酵条件优化正交试验
在单因素试验的基础上，以感官评分及酸度为评价指标，以浓缩牛奶蛋白600A添加量（A）、接种量（B）、发酵温度（C）、均质压力（D）为4个因素，进行4因素3水平正交试验。正交试验结果与分析见表3。
由表3可知，以感官评分为评价指标时，影响高蛋白饮用型纯益生菌发酵乳的品质的主次顺序为A＞D＞C＞B；以酸度为评价指标时，影响高蛋白饮用型纯益生菌发酵乳的品质的主次顺序为A＞C＞D＞B。
表3 高蛋白纯益生菌饮用型发酵乳发酵条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of fermented milk with high protein and pure probiotic
试验号 A B C D 感官评分/分 酸度/°T 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 1 2 3 3 1 2 2 3 1 79.3 86.3 82.0 86.7 83.7 88.7 80.7 77.7 76.0 119.7 121.4 126.2 128.6 130.7 123.9 136.2 133.1 137.7感官评分k1 k2 k3 R酸度k1 k2 k3 R 82.55 86.34 78.11 8.22 122.43 127.73 135.67 13.23 82.22 82.56 82.22 0.33 128.17 128.40 129.27 1.10 81.89 83.00 82.11 1.11 125.57 129.23 131.03 5.47 79.67 85.22 82.11 5.56 129.37 127.17 129.30 2.20
根据极差分析，以感官评分为考察指标时，4个因素的最优组合为A2B2C2D2，即浓缩牛奶蛋白600A添加量为6.0%、发酵液接种量为2.0%、发酵温度为43℃、均质压力为4MPa；以酸度为考察指标时，4个因素的最优组合为A3B3C3D1，即浓缩牛奶蛋白600A添加量为6.8%、发酵液接种量为2.5%、发酵温度为45℃、均质压力为2 MPa。
按A2B2C2D2和A3B3C3D1的配方组合制备高蛋白饮用型纯益生菌发酵乳，并进行感官评分和酸度测定。A2B2C2D2组合的感官评分89分，酸度为129.1°T；A3B3C3D1组合的感官评分为79分，酸度为137.9°T。由于感官评价是描述和判断食品的特征品质和质量要求最直观的指标，且以酸度优化出来的组合不如感官评分优化出来的结果，因此选择最佳配方组合为A2B2C2D2，即浓缩牛奶蛋白600A添加量为6.0%、发酵液接种量为2.0%、发酵温度为43℃、均质压力为4 MPa。
2.3 产品指标
2.3.1 感官指标
保质期内产品组织状态细腻，无明显分层或乳清析出，口感酸甜适中，具有酸奶特有的浓郁香气，口感清爽。感官评分为89分。
2.3.2 理化指标
高蛋白饮用型纯益生菌发酵乳蛋白质含量6.11%，脂肪含量4.08%，酸度129.1°T，pH 4.31。
2.3.3 微生物指标
高蛋白纯益生菌饮用型发酵乳的总乳酸菌数为4.8×109CFU/g。霉菌、酵母菌、大肠菌群、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均未检出。
3 结论
通过单因素和正交试验，确定了一种高蛋白饮用型纯益生菌发酵乳的最佳配方工艺为浓缩牛奶蛋白600A添加量6.0%、发酵剂接种量2.0%、发酵温度43℃、二次无菌均质压力4 MPa，配方对应感官评分89分，酸度129.1°T。此配方能制作出一款口感好，保质期内活菌数高的高蛋白饮用型纯益生菌发酵乳。高蛋白饮用型纯益生菌发酵乳的研制，填充的纯益生菌发酵市场的空白，迎合高端乳制品市场的需求。
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