近年来，随着人们生活水平的不断提高，人们开始追求绿色健康的高品质生活，而富含功能因子的各种果酒，深受消费者的喜爱。蓝莓（Vacciniumspp.）属于杜鹃花科的一类灌木[1]，通常在酸性土壤中生长，在我国蓝莓主要分布在大兴安岭地区附近。蓝莓因其含有多种营养因子，如锰元素、维生素B6（vitamin B6，VB6）、VC、VK、花色苷、黄酮和膳食纤维等，被人们誉为“水果皇后”[2-3]，其中最受人关注的便是蓝莓中的花青素。花青素作为一种黄酮类化合物，具有清除自由基、抗氧化、改善视力、抗增生、减肥和降血脂等功效[4-8]。由于蓝莓果易于氧化，不易保存，因此以野生蓝莓为原料发酵的蓝莓果酒，不仅可以延长蓝莓的保质期，而且能够有效的保留蓝莓的风味及其营养物质。但由于蓝莓果汁初始pH较低，普通酵母菌因其耐酸性较差在发酵过程中，导致蓝莓酒起发速度较慢或发酵提前终止。陈小玲[9]以筛选得到的野生酵母菌株为发酵剂，通过采用响应面法优化蓝莓果酒发酵工艺，在发酵初始糖度为25°Bx，酵母接种量为5%，酶添加量0.4%的条件下24℃发酵8 d后，得到花青素含量为322.58 mg/L、酒精度为12.5%vol的蓝莓果酒。谢洋洋[10]以安琪酿酒酵母为发酵菌株，经单因素、正交试验确定了发酵初始pH值为3.3，初始糖度10°Bx，酵母菌接种量0.1%，于25℃发酵的最佳蓝莓果酒发酵工艺。李婧等[11]利用活性干酵母发酵蓝莓汁，经过皂土澄清，得到了果香浓郁的蓝莓果酒，为蓝莓果酒的发酵提供了参考。本试验利用实验室筛选的可耐pH值为1.8的耐酸酵母菌株YM1-1和产酯酵母菌株T1作为复合发酵菌株，通过设计单因素及正交试验确定蓝莓酒最优的发酵工艺[12]，蓝莓酒发酵工艺的探究为工业化生产提供了参考并奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
野生蓝莓：内蒙古根河野生资源开发公司；耐酸酵母菌株YM1-1、产酯酵母菌株T1：本实验室筛选保藏；白砂糖：市售；盐酸：天津市致远化学试剂有限公司；偏重亚硫酸：天津化学试剂三厂；无水乙醇：天津市风船化学试剂科技有限公司；柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖：天津市北联精细化学品开发有限公司；大豆蛋白胨、酵母浸膏、琼脂（均为生化试剂）：南通凯恒生物科技发展有限公司；果胶酶（酶活为20000U）：烟台伯爵士酵母有限公司。所用试剂均为分析纯。
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基：葡萄糖20 g/L、大豆蛋白胨10 g/L、酵母浸膏10 g/L，pH6.0，121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
FA2104N电子分析天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；A-103多功能榨汁搅拌机：浙江顺敬工贸有限公司；BKQB100II高压蒸汽灭菌锅：山东博科生物产业有限公司；PHS-3CpH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；PAL-1糖度仪：青岛聚创美家环保技术有限公司；LRH-500F生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-2FD双人单面垂直净化工作台：济南来保医疗器械有限公司；HWS-12型电热恒温水浴锅：常州市金坛华伟仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 蓝莓酒工艺流程及操作要点
打浆：将蓝莓用榨汁机榨得蓝莓汁
果胶酶酶解：蓝莓汁中添加30 mg/L果胶酶，并于25℃酶解20 min；
浸渍：将酶解得到蓝莓汁于35℃水浴浸渍40 min；
离心分离：将上述处理的蓝莓汁在5 000 r/min的条件下离心10 min，得到澄清蓝莓汁；
成分调整：野生蓝莓打浆离心后加水（体积比为1∶1）得到蓝莓汁，添加白砂糖调节初始糖度为12.5°Bx，SO2添加量为60 mg/L；
菌株活化：将斜面保藏的YM1-1菌株和T1菌株，分别在无菌环境中用接种环挑取一环接种于YEPD培养基中，于28℃恒温培养48 h后，将其以2%的接种量接种到YPD液体培养基中，并在28℃恒温培养48 h，根据以上操作再次进行传代培养，将培养的第3代菌液用于以下试验；
菌悬液的制备：将10 mL三代菌液在4 000 r/min的条件下离心3 min后倒掉上清液，并用无菌生理盐水将离心的菌泥进行洗涤，用漩涡仪混合均匀后，依据平板菌落计数的方法，将活菌浓度调整为1×108CFU/mL[13]；
后发酵：主发酵得到的蓝莓酒于12℃后酵20 d；
稳定性处理：通过不断倒桶和膜过滤实现。
1.3.2 蓝莓酒工艺优化单因素试验
（1）SO2添加量对蓝莓酒的影响：在接种量为5%，产酯酵母：耐酸酵母为1∶1（V/V），初始pH值为3.0，果胶酶添加量为20 mg/L的条件下，调整SO2添加量分别为30 mg/L、60 mg/L、90 mg/L、120 mg/L、150 mg/L，24℃恒温发酵至残糖为5.0°Bx，以花青素含量和感官评分为考察指标，分析SO2添加量对蓝莓酒的影响。
（2）果胶酶添加量对蓝莓酒的影响：调整果胶酶添加量分别为20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L，24℃恒温发酵至残糖为5.0°Bx，以花青素含量和感官评分为考察指标，分析果胶酶添加量对蓝莓酒的影响。
（3）初始pH值对蓝莓酒的影响：用柠檬酸和柠檬酸钠将发酵醪液初始pH值分别调为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，24 ℃恒温发酵至残糖为5.0°Bx，以花青素含量和感官评分为考察指标，分析发酵初始pH值对蓝莓酒的影响。
（4）接种量对蓝莓酒的影响：按照蓝莓发酵醪液体积的5%、6%、7%、8%、9%的接种量分别进行接种，于24℃发酵至残糖为5.0°Bx，以花青素含量和感官评分为考察指标，分析酵母菌接种量对蓝莓酒的影响。
（5）接种比例对蓝莓酒的影响：产酯酵母∶耐酸酵母接种比例分别为1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1（V/V），于24 ℃发酵至残糖为5.0°Bx，以花青素含量和感官评分为考察指标，分析接种比例对蓝莓酒的影响。
（6）发酵温度对蓝莓酒的影响：分别于发酵温度为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃的条件下发酵至残糖为5.0°Bx，以花青素含量和感官评分为考察指标，分析发酵温度对蓝莓酒的影响。
1.3.3 蓝莓酒工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，挑选对蓝莓酒影响较大的因素设计正交试验方案，进行综合研究分析，并确定最佳工艺条件组合。正交试验因素与水平见表1。
表1 蓝莓酒发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of blueberry wine
水平 ASO2添加量/（mg·L-1）B接种量/%C果胶酶添加量/（mg·L-1）D初始pH值1 2 3 50 60 70 5.5 6.0 6.5 25 30 35 3.2 3.5 3.8
1.3.4 测定方法
（1）感官评定方法
邀请13位经过培训的专业人员，从酒液外观、香气、果渣沉淀状况、口感四个方面对蓝莓酒进行感官评定。感官评分标准见表2。满为100分，感官评价最终得分为13人评分的平均值[14]。（2）花青素含量：按照参考文献[15]的方法进行测定。（3）酒精度：用蒸馏法测定；残糖：使用便携式手持糖度计测定；糖醇转化率计算公式[18]
式中：S为糖醇转化率，%；C为酒精度，%vol；G为糖度，°Bx。
表2 蓝莓酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standard of blueberry wine
项目 酒液外观（30分）香气（20分）果渣沉淀状况（20分）口感（30分）一级18～20分酒液清透二级18～20分有明显的果香味和酒香味，香味协调悦人，无不良气味15～17分有略淡的清香，无不良气味15～17分酒液无黏稠感三级10～14分无明显香味10～14分酒液黏稠或有颗粒感27～30分口感细腻柔和，有蓝莓的典型风味24～26分口感较细腻柔和，有淡淡的蓝莓风味18～23分略有涩感，蓝莓风味清淡四级27～30分酒液澄清，透明，色泽红亮，色泽均匀24～26分酒液呈亮红，较为透明，色泽均匀18～23分酒液色泽较暗，色泽不均，酒液浑浊＜18分酒液色泽暗淡，出现浑浊或沉淀物＜10分有异味＜10分酒液浑浊或出现沉淀物＜18分有明显涩感无蓝莓风味
2 结果与分析
2.1 蓝莓酒发酵条件优化单因素试验
2.1.1 SO2添加量对蓝莓酒品质的影响
图1 SO2添加量对蓝莓酒品质的影响
Fig.1 Effect of SO2addition on blueberry wine quality
小写字母不同表明数据间差异显著（P＜0.05）。下同。
由图1可知，随着SO2添加量的增加，蓝莓果酒中花青素含量及其感官评分均呈先上升后下降的趋势。当SO2添加量为60 mg/L时，感官评分和花青素含量均达到最大值，分别为82分和205.9 mg/L；因为SO2本身具有还原性，适量的SO2对花青素有保护作用，同时可以有效的抑制杂菌生长[17]，但过量的SO2一方面会产生不良的气味影响蓝莓酒的品质；另一方面SO2会与酒中花青素发生加成反应，使花青素含量降低，同时酒体颜色变浅，影响外观。因此，选择最佳SO2添加量为60 mg/L。
2.1.2 果胶酶添加量对蓝莓酒品质的影响
图2 果胶酶添加量对蓝莓酒品质的影响
Fig.2 Effect of pectinase addition on blueberry wine quality
由图2可知，当果胶酶添加量为20～60 mg/L时，随着果胶酶添加量的增加，蓝莓酒中花青素含量及感官评分呈先升高后降低趋势。果胶酶添加量为30 mg/L时，蓝莓酒中花青素的含量及感官评分均为最高，分别为230.7 mg/L和85.5分；当果胶酶添加量＜30 mg/L之前，随着添加量的增加，花青素含量及感官评分显著性上升（P＜0.05），原因是果胶酶浓度较低没有使蓝莓中果胶物质等充分水解，进而有效成分没有充分溶出所以花青素含量较低，同时蓝莓酒的色泽较浅影响感官；当果胶酶添加量＞30 mg/L之后，由于果胶酶浓度太高，果胶酶酶解破壁反应已经相对彻底，所以过多的果胶酶可能会水解产生其他物质，从而造成花青素含量及感官评分下降[18]。因此，选择最佳果胶酶添加量为30 mg/L。
2.1.3 初始pH值对蓝莓酒品质的影响
图3 初始pH值对蓝莓酒品质的影响
Fig.3 Effect of initial pH on blueberry wine quality
由图3可知，随着发酵初始pH的升高，蓝莓酒中花青素含量及感官评分均呈现显著性先上升后下降（P＜0.05）。当pH值为3.5时，蓝莓酒中花青素含量以及感官评分均达到最大值，分别为243.8 mg/L和85.6分。这可能是由于发酵初始pH值对酵母菌的生长繁殖影响较大，不同的发酵初始pH值不仅会影响酵母代谢而且影响蓝莓酒的口感。同时花青素在酸性条件下稳定性较好，在中性或者碱性条件下稳定性会变差[19]。因此，选择最佳发酵初始pH值为3.5。
图4 接种量对蓝莓酒品质的影响
Fig.4 Effect of inoculum on blueberry wine quality
2.1.4 接种量对蓝莓酒品质的影响由图4可知，在酵母接种量为5%～9%时，花青素含量及感官评分随着酵母接种量的增加呈现先上升后下降的趋势。当接种量为6%时花青素含量和感官评分均较高，分别为253.7 mg/L和86.2分。原因可能是随着酵母菌接种量的增加酒体中酵母菌的代谢产物也在增加。合适的接种量一方面会产生适量的芳香类代谢产物提高保健酒的品质，另一方面使蓝莓酒发酵速度加快有利于活性物质保留。但过量的酵母菌接种量又会产生不良的酵母味，影响蓝莓酒风味，同时花青素会与代谢产物结合[20]，使花青素大量损失。因此，选择最佳酵母接种量为6%。
2.1.5 酵母接种比例对蓝莓酒品质的影响
图5 酵母接种比例对蓝莓酒品质的影响
Fig.5 Effect of inoculum ratio on quality of blueberry wine
由图5可知，随着蓝莓酒中两种酵母菌的接种比例的变化，蓝莓果酒的花青素含量及感官评分均呈现先上升后下降的趋势，呈现不断下降的趋势。在产酯酵母∶耐酸酵母为1∶2（V/V）时，酒中花青素的含量和感官评分均达到最大，分别为279.4 mg/L和87.6分，不同的接种比例对蓝莓酒中花青素的含量以及感官评分均有影响，可能是因为接种比例不同发酵液中最终两株菌数量不同，产生的代谢产物等不同进而使得最终蓝莓酒的风味口感以及花青素含量发生改变。因此，选择最佳菌株接种比例为产酯酵母∶耐酸酵母=1∶2（V/V）。
2.1.6 发酵温度对蓝莓酒品质的影响
图6 发酵温度对蓝莓酒品质的影响
Fig.6 Effect of fermentation temperature on blueberry wine quality
由图6可知，随着发酵温度的升高，花青素含量呈现先上升后下降的趋势，感官评分呈现先下降后上升再下降的趋势。当发酵温度为26℃时，感官评分和花青素含量均达到最大，分别为86.9分和281.7 mg/L。当发酵温度低于26℃之前，花青素含量和感官评分均较低，可能原因是当温度过低时，影响酵母生长代谢速率进而影响蓝莓酒酒精度和口感，同时低温会使花青素溶解度降低，蓝莓酒中花青素含量降低；当发酵温度高于26℃之后，花青素含量及感官评分均有所下降，由于发酵温度过高时，酵母生长代谢过于旺盛[21]，造成糖类未能完全被彻底转化为酒精，影响口感。同时酵母生长代谢旺盛产生代谢产物过多，花青素会与代谢产物结合使最终发酵蓝莓酒中花青素含量降低，例如酵母菌在发酵阶段产生的丙酮酸、乙醛以及一些酶类会使花青素降解。因此，选择最佳发酵温度为26℃。
2.2 蓝莓酒发酵工艺优化正交试验
由表3可知，当以花青素含量为评价指标分析时，各因素对蓝莓酒花青素含量的影响次序为初始pH值＞果胶酶添加量＞接种量＞SO2添加量，表明初始pH值对蓝莓酒品质的影响最大。最优发酵工艺参数组合为A2B1C1D1，即SO2添加量为60 mg/L，产酯酵母∶耐酸酵母为1∶2（V/V），接种量为5.5%，果胶酶添加量为25 mg/L，发酵初始pH值为3.2。在此条件下发酵蓝莓酒的花青素含量为350.4 mg/L，感官评分为87分。
当以感官评定为评价指标进行分析时，各因素对蓝莓酒感官评分的影响次序为SO2添加量＞接种量=果胶酶添加量=初始pH值，表明SO2添加量对蓝莓酒品质的影响最大。结果显示以感官评分为评定指标的最优发酵工艺参数组合为A2B2C2D3，即在SO2添加量为60 mg/L，产酯酵母∶耐酸酵母为1∶2（V/V），接种量为6.0%，果胶酶添加量为30 mg/L，发酵初始pH值为3.8。在此条件下发酵蓝莓酒的花青素含量为368.5mg/L，感官评分为87分。
表3 蓝莓酒发酵条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of blueberry wine
试验号 A B C D 花青素/（mg·L-1）感官评分/分1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 1 2 3 3 1 2 2 3 1 361.7 297.2 310.9 284.8 341.3 328.3 327.0 299.4 317.3 81 87 83 89 85 83 79 80 77花青素含量k1 k2 k3 R感官评分k1 k2 k3 R 315.9 318.1 314.5 3.6 83.7 85.7 78.7 7.0 324.5 312.6 318.8 11.9 83.0 84.0 81.0 3.0 329.8 299.8 326.4 30.0 81.3 84.3 82.3 3.0 340.1 317.5 298.4 41.7 81.0 83.0 84.0 3.0
基于验证试验结果对比，在组合A2B2C2D3条件下发酵的蓝莓酒感官评分为87分，花青素含量为368.5 mg/L，所以最终选择组合A2B2C2D3为最优发酵工艺参数组合。
2.3 蓝莓酒质量评价
在此条件下发酵得到果香浓郁、口感醇厚的低酒精度蓝莓酒，酒精度为4.2%vol，残糖为5.0°Bx，糖醇转化率为33.6%，花青素含量为368.5 mg/L。
3 结论
本研究以耐酸酵母YM1-1和产酯酵母T1为试验菌株，蓝莓汁与水体积比1∶1，调节初始糖度为12.5°Bx为发酵醪液，经单因素及正交试验确定蓝莓酒的最优发酵工艺为SO2添加量60 mg/L，以产酯酵母∶耐酸酵母接种比例1∶2（V/V），接种量6.0%，果胶酶添加量30 mg/L，发酵初始pH值3.8的条件下，于26℃发酵至残糖为5.0°Bx，在此优化发酵条件下酿造得到的蓝莓保健酒酒精度为4.2%vol，残糖为5.0°Bx，感官评分为87分，糖醇转化率为33.6%，花青素含量为368.5 mg/L。
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