L-异亮氨酸是人体8种必需氨基酸之一，同时又是3种支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在生命代谢中具有重要作用[1]，已被广泛应用于食品、动物饲料和医药等行业[2]。L-异亮氨酸的生产方法主要有水解法、化学合成法和生物发酵法。生物发酵法因其原料成本低、易于控制、节能环保成为工业化生产的首选方法。但是，目前国内L-异亮氨酸的生产效率不高，与国外有较大差距，其中高产菌株的缺乏已成为发酵法制备L-异亮氨酸的技术瓶颈之一[3-6]。
常温常压等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变育种技术是一种微生物基因组快速突变技术[7-9]。该技术具有成本低、操作简便、安全性、等离子体产生条件温和、富含大量活性粒子、突变谱广、突变率高等优点，被广泛用于细菌、真菌、微藻等微生物的生物育种[10-14]。高产L-异亮氨酸菌株的筛选方法是当前ARTP诱变育种的研究重点。在L-异亮氨酸的合成途径中，天冬氨酸对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶存在着反馈抑制作用，若解除该反馈抑制能使代谢流更加通畅，从而增加L-异亮氨酸的产量[15-20]。磺胺胍是天冬氨酸的结构类似物，如果将磺胺胍加入培养基中用于菌株的筛选，期望得到磺胺胍抗性突变株，有效解除天冬氨酸对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反馈抑制，使天冬氨酸大量合成，从而提高L-异亮氨酸产量。在得到突变库的基础上，利用茚三酮与氨基酸的显色反应可以结合多功能酶标仪实现多孔板的高通量筛选。
因此，本实验采用ARTP诱变仪对谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）23798进行诱变，然后采用适宜浓度的磺胺胍抗性标记进行初筛，再利用氨基酸与茚三酮显色反应机理进行高通量筛选，最后通过发酵培养进行复筛，以期得到高产L-异亮氨酸的诱变谷氨酸棒杆菌，并对其遗传稳定性进行研究，为后续的发酵放大培养优化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）23798：中国工业微生物菌种保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）。
1.1.2 试剂
氯化钠、硫酸铵、磷酸氢二钠苯（均为分析纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；L-异亮氨酸、茚三酮、乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉、牛肉浸粉（均为生化试剂）：安琪酵母股份有限公司。
1.1.3 培养基
活化培养基：蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，牛肉浸粉3g/L，琼脂粉20 g/L，pH 7.0。
种子培养基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化钠5 g/L，牛肉浸粉3 g/L，磷酸氢二钠1 g/L，pH 7.0。
发酵培养基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨7 g/L，氯化钠5 g/L，牛肉浸粉3 g/L，磷酸氢二钠1 g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸铵6 g/L，pH 7.0。
以上培养基葡萄糖单独灭菌，灭菌条件均为1×105Pa灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
ARTP-M常温常压等离子体诱变育种仪：无锡源清天木生物科技有限公司；LRH-250A生化培养箱：韶关市泰宏医疗器械有限公司；ZQRY-180S恒温摇床：上海知楚仪器有限公司；SP-Max 2300A光吸收型全波长酶标仪：上海闪谱生物科技有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；Leopard70-2A微孔板恒温振荡器：莱普特科学仪器（北京）有限公司；MX-307落地高速冷冻离心机：日本TOMY公司；UV-1800分光光度计：岛津企业管理（中国）有限公司；XW-80A旋涡混合仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；L-8900氨基酸分析仪：日本天美科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株的活化及培养
将保存的谷氨酸棒杆菌23798划线接种于活化培养基上，37℃倒置培养3 d；将平板上的菌种刮取一环接种到100 mL种子培养基中，在37℃、200 r/min条件下培养16 h，将种子液制成OD600nm值为0.7的菌悬液，加入5%甘油，备用。
1.3.2 菌株的ARTP诱变时间的考察[21]
将ARTP的温度保持在20℃，调节功率为120 W，氦气（He）流量为10 L/min。吸取10 μL菌悬液于无菌金属载片上，将载片放入诱变室内，发射源距离菌液2 mm，采用不同的时间（0 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s、210 s、240 s）对菌液进行诱变处理。将诱变的菌体接入1 mL生理盐水中振摇1min，取100μL涂布到活化培养基平板上，37℃培养2d，计算致死率，确定最佳诱变时间，其计算公式如下：
1.3.3 诱变筛选抗性标记磺胺胍浓度的考察
将无菌磺胺胍加入50mL活化培养基中，使磺胺胍最终质量浓度分别为0、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL、0.35mg/mL、0.40mg/mL。将100μL种子菌悬液涂布于含磺胺胍的抗性平板上，37℃培养2 d，观察菌体生长情况，确定诱变菌株抗性标记所采用的最佳磺胺胍质量浓度。
1.3.4 高产L-异亮氨酸诱变菌株的筛选
以谷氨酸棒杆菌23798为出发菌株，在最佳诱变时间条件下进行ARTP诱变，涂布到含有最佳磺胺胍质量浓度的抗性标记平板上，37℃培养2 d。挑选生长快速、单菌落较大的菌株，用竹签将平板上诱变的菌株接种到含1 mL发酵培养基的24孔板中培养48 h后，离心，取上清液20 μL至96圆孔深孔板中，每个孔板加入240 μL 0.5%的茚三酮溶液，70℃水浴8 min，然后冷却至室温，用酶标仪测定波长570 nm处的吸光度值（OD570nm值），挑选出OD570nm值较大的菌株，采用薄层层析-分光光度法[22]和氨基酸分析仪[23-24]进行定性定量。通过摇瓶复筛，取上清液，利用氨基酸分析仪检测其L-异亮氨酸含量[24]，获得高产L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌诱变菌株。
1.3.5 高产L-异亮氨酸诱变菌株发酵培养
将原始菌株和筛选得到的高产L-异亮氨酸的诱变菌株分别接种于种子培养基中，37℃、200 r/min条件下培养16 h；按10%（V/V）的接种量接种至发酵培养基中，37℃、200 r/min条件下培养48 h，利用氨基酸分析仪测定其L-异亮氨酸含量。
1.3.6 高产L-异亮氨酸诱变菌株的遗传稳定性
将诱变菌株在活化培养基上连续传代10次，再进行发酵培养，采用氨基酸分析仪检测菌株的L-异亮氨酸产量，研究其遗传稳定性。
2 结果与分析
2.1 最佳诱变时间的确定
等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络发生显著变化，最终导致微生物产生突变。诱变时间和作用强度对微生物致死率的影响较大，致死率过低或过高都不利于筛选。因此，在不同诱变时间下，考察诱变时间对谷氨酸棒杆菌致死率的影响，结果如图1所示。
图1 谷氨酸棒杆菌ARTP诱变致死率曲线
Fig.1 Curve of lethallty rate forCorynebacterium glutamicumby
ARTP mutagenesis
从图1可以看出，ARTP对Corynebacterium glutamicum的杀伤力较大，当诱变时间为60～120 s时，该菌株致死率呈直线增长，且当诱变时间为120s时，菌株致死率达到88%左右；当诱变时间为180 s时，菌株致死率达到98.44%；当诱变时间为240 s时，菌株致死率接近100%。为了保证一定的突变率，选择相应的诱变时间至关重要。因此，选择致死率达到98.44%的180 s为最佳诱变时间。
2.2 高产L-异亮氨酸诱变菌株的抗性筛选
磺胺胍为天冬氨酸的结构类似物，通过选育磺胺胍抗性突变株能遗传性地解决天冬氨酸对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反馈抑制[19]。研究发现，不同质量浓度的磺胺胍对细胞的抑制程度不同，因此，需要优化磺胺胍质量浓度，使筛选效果达到最佳。不同磺胺胍质量浓度对Coryne bacterium glutamicum的抑制率如图2所示。
图2 不同质量浓度磺胺胍对谷氨酸棒杆菌生长的影响
Fig.2 Effect of different sulfaguanidine contents on the growth of Corynebacterium glutamicum
从图2可以看出，磺胺胍对Corynebacteriumglutamicum的抑制效果明显。当磺胺胍质量浓度＜0.1mg/mL之前，抑制作用较小；当磺胺胍质量浓度达到0.3mg/mL时，抑制效果增强，抑制率达到97%左右；当磺胺胍质量浓度达到0.4mg/mL时，菌体不能生长，故选取质量浓度为0.4 mg/mL的磺胺胍进行抗性标记筛选。
采用ARTP诱变仪对谷氨酸棒杆菌菌悬液诱变180 s，将诱变的菌体涂布于含有0.4 mg/mL磺胺胍的活化培养基平板上，37℃培养2 d，从中筛选获得菌落生长快、菌落大的42个单菌落，编号为A1～A6、B1～B6、C1～C6、D1～D6、E1～E6、F1～F6、G1～G6。
2.3 高产L-异亮氨酸诱变菌株的高通量筛选
挑选菌落较大的42个单菌落于24孔板培养基中发酵培养48 h，以原始菌株吸光强度为1.0，测定样品的相对吸光度值，结果如图3所示。
图3 不同诱变菌株的相对吸光强度
Fig.3 Relative absorbance intensity of different mutants
W为出发菌株，A1～G6为突变菌株。下同。
由图3可知，大多数诱变菌株的相对吸光度值高于原始菌株，且其中3株诱变菌株B1、D6、E5的相对吸光度值高于原始菌株的20%以上，通过薄层层析-分光光度法和氨基酸分析仪对这3株诱变菌株的发酵上清液中的L-异亮氨酸进行定性、定量，进一步确认3株诱变菌株L-异亮酸产量高于原始菌株。因此，对诱变菌株B1、D6、E5进行摇瓶复筛验证实验。
2.4 高产L-异亮氨酸诱变菌株的发酵培养复筛
将诱变菌株B1、D6、E5和原始菌株进行摇瓶发酵培养，利用氨基酸分析仪检测发酵48 h时的L-异亮氨酸产量，结果如表1所示。
表1 诱变菌株的L-异亮氨酸
Table 1 L-isoleucine production of mutants
菌株L-异亮氨酸产量/（g·L-1）增长率/%W B1 D6 E5 11.42 18.50 14.95 13.04 62.03 30.89 14.19
由表1可以看出，与原始菌株相比，诱变菌株B1、D6、E5具有较好的L-异亮氨酸生产性能，其产量分别增加62.03%、30.89%、14.19%，其中诱变菌株B1的L-异亮氨酸生产能力最高。由此可见，本实验的筛选方法是行之有效的。
2.5 高产L-异亮氨酸诱变菌株的遗传稳定性
为了检验诱变菌株B1能否保持稳定的遗传特性，将诱变菌株B1连续传代培养10次，并同时进行发酵培养，采用氨基酸分析仪对发酵上清液中L-异亮氨酸的产量进行测定，结果如图4所示。由图4可知，从第1代到第10代，诱变菌株B1的L-异亮氨酸产量基本保持稳定，可见该诱变菌株具有良好的遗传稳定性。
图4 诱变菌株B1的遗传稳定性
Fig.4 Genetic stability of mutant strain B1
3 结论
从原始菌株Corynebacterium glutamicum23798出发，经过ARTP诱变处理180 s后，涂布于含0.4 mg/mL磺胺胍培养基中，37℃培养2 d，挑选出菌落较大的菌株，接种至24孔板液体培养基培养，利用氨基酸与茚三酮的特异性反应与相对应的菌株发酵上清液进行96孔酶标仪高通量筛选，选育出一株高产L-异亮氨酸诱变Corynebacterium glutamicumB1。该菌株摇瓶发酵48 h后，L-异亮氨酸产量达18.5 g/L，较原始菌株提高62.03%，且遗传性状稳定。该研究通过将ARTP随机诱变与磺胺胍定向抑制微生物产酸代谢途径中的关键酶相结合，增大诱变菌株向L-异亮氨酸积累方向突变的几率，提高优良菌株的筛选效率，为产L-异亮氨酸菌株的选育提供了高效的筛选方法，为其他高产氨基酸菌株的筛选提供重要参考。
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