水晶葡萄色泽绿黄、皮薄汁多、酸甜适口，有浓郁的狐香味，且可溶性固形物含量＞15%，是品质优良的葡萄品种。与其他葡萄品种相比，水晶葡萄还具有抗病性强、耐贫瘠、易管理及丰产性好等优点，特别适合山区种植。目前，水晶葡萄已成为贵州地区的主要栽培品种，种植面积约占贵州总葡萄种植面积的60%，广泛分布于贵州各个地区，规模化种植越来越多。然而水晶葡萄产业存在单一品种种植面积过大、经济附加值低、产品不宜贮存、缺乏大型的葡萄存贮及加工企业等问题[1]，给葡萄种植带来一定的滞销风险，在一定程度上影响了农户的种植积极性和产业规模化生产。因此，大力推广水晶葡萄的深加工势在必行。
将新鲜的水晶葡萄用于葡萄酒酿制，可降低水晶葡萄产业过剩、产品滞销、易腐败等风险，提高产品附加值，推动相关产业的发展，带动当地群众就业，符合贵州绿色经济发展的战略定位。决定水晶葡萄酒品质的关键是发酵用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），选择适宜的酿酒酵母至关重要[2-4]。目前，市场上酿酒用的酵母多为进口酿酒酵母，其用于国内葡萄酒发酵不能体现本地葡萄的品质和特色，同质化现象严重[5-7]。为解决这一困境，近年，国内外许多学者开展了当地葡萄酿酒酵母的分离及酿酒性能研究，以期筛选出适合当地葡萄发酵的酵母菌。如汤晓宏等[8-9]以蓬莱葡萄酒产区君顶酒庄霞多丽的果皮和葡萄园土壤为原料，分离出对SO2、酒精、高盐及高糖耐受极强的酿酒酵母PJ16，对SO2耐受性高达500 mg/L，对酒精、高盐及高糖耐受性分别达12%vol、2.8 mol/L和60%；庞红勋[10]以天津地区所产的贵人香、玫瑰香和赤霞珠等葡萄为分离材料，筛选出一株酿酒酵母M502，具有生长繁殖快、发酵迅速、糖度耐受性强及酒精发酵度高等特点；高晓航[11]以宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区的成熟期葡萄果实、表皮和土壤为原料，分离一株酿酒性能优良的酿酒酵母，并通过诱变育种和原生质体融合，选育出一株性能更为优良的酿酒酵母菌株R17，其可耐受酒精12%vol、SO2250mg/L、糖30%、NaCl 100 g/L，糖的乙醇转化率为88.92%；BELL P J L等[12]以筛选出的野生酿酒酵母YS2为出发菌株，经过驯化后，菌株的糖转化率提高20%以上。以上研究表明，以本地葡萄为原料，经分离筛选可以得到酿酒性能优良的酵母菌株。
因此，本研究以贵州三都县所产水晶葡萄为原料，利用其葡萄汁自然发酵，经分离筛选、耐受性及酿酒性能研究，筛选优良的酿酒酵母，并通过分子生物学技术对其进行鉴定，以期筛选出能够适应当地气候环境和葡萄原料的优良酿酒酵母。1材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
水晶葡萄：采摘于贵州三都县葡萄园区。
1.1.2 试剂
LA-PE果酒酵母：烟台帝伯仕自酿机有限公司；2×聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）mix、Gold-ViewTM：全式金生物技术有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
WL固体培养基[13]：酵母浸粉4.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，葡萄糖50 g/L，磷酸二氢钾0.55 g/L，氯化钾0.425 g/L，氯化钙0.125 g/L，琼脂20 g/L，硫酸镁0.125 g/L，氯化铁0.002 5 g/L，硫酸锰0.002 5 g/L，溴甲酚绿22 mg/L，pH 6.5。121℃高压灭菌20 min。
模拟葡萄汁培养基[13]：葡萄糖200 g/L，硫酸铜0.05 g/L，蛋白胨10 g/L，柠檬酸3 g/L，酵母浸粉5 g/L，121℃高压灭菌20 min。按需要加入SO2、调整pH。
1.2 仪器与设备
DH6000B电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；SW-CJ-1G超净工作台：上海苏净实业有限公司；RE-2000旋转蒸发器：上海洪旋实验仪器有限公司；WD-9402B/D非医用基因扩增仪：北京六一生物科技有限公司；HVE-50高压蒸汽灭菌锅：日本HIRAYAMA公司。
1.3 方法
1.3.1 酿酒酵母的分离
取新采摘的水晶葡萄约100 g，去梗粉碎后装入250 mL锥形瓶中，并加入60 mg/L的SO2混匀，置于室温条件下静置发酵。至锥形瓶底部沉降大量白色沉淀且有大量气泡生成时，取底部沉淀液1 mL进行梯度稀释，分别稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，取200 μL10-5、10-6、10-7梯度稀释液均匀涂布于WL固体培养基，于28℃恒温培养箱中倒置培养2 d。挑取WL平板上圆隆、边缘整齐、稠厚、不透明、乳白色或略带绿色的疑似菌落，转接于WL斜面培养基中培养，编号，镜检，并保藏。
1.3.2 优良酿酒酵母的初筛
挑取少量上述斜面培养种子，转接于4 mL模拟葡萄汁培养基中，于28℃恒温培养箱中静置培养24 h。取1%液体种子，转接入10 mL含杜氏小管的模拟葡萄汁培养基中，28℃静置培养2 d，每株菌设定3个平行。期间记录各菌株的产气起始时间[13]、凝聚性能[13-14]、杜氏管充满气体时间[13-15]及发酵高峰持续时间[8]。将能在2 d内絮凝并产气充满杜氏管的菌株保藏，进行耐受性试验[13-16]。
1.3.3 优良酿酒酵母耐受性的测定
将初筛得到的菌株制备成模拟葡萄汁液体种子（约8.7×108CFU/mL），按1%（V/V）的接种量依次接种于不同糖浓度（10%、20%、30%、40%、50%及60%）、不同乙醇含量（10%vol、12%vol、14%vol、16%vol及18%vol）、不同SO2质量浓度（100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L及300 mg/L）的模拟葡萄汁中，pH值控制在2.0，装液量为20 mL/50 mL试管，28℃静置培养2 d，期间记录酵母菌的生长及产气状况，有大量白色沉淀形成的表明生长旺盛，沉淀形成不明显的则采用菌落计数法观察，观察培养前后菌体数量变化。反应结束后各取200μL发酵液均匀涂布于WL固体培养基中，28℃静置培养2 d，观察各菌株在WL固体培养基中的生长情况[6]。综合评价分离菌株的耐受性，逐步筛选出糖、低pH值、酒精及SO2耐受性较高的优良酿酒酵母菌株[13]。
1.3.4 优良酿酒酵母的分子生物学鉴定
挑取斜面上的优良酵母菌种划线于WL平板，28℃静置培养36 h。以平板培养的单菌落为模板，酵母5.8S rDNA通用引物NL1和NL4为上下游引物进行菌落PCR扩增。PCR扩增体系：10 μ mol/L NL1 1 μL，10 μmol/L NL4 1 μL，2×PCR mix 25 μL，双蒸水（dd H2O）23 μL，无菌吸头沾取少许单菌落，混匀。PCR扩增条件：98℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃再延伸10 min。PCR扩增结束后，取5 μL反应液进行琼脂糖凝胶电泳验证，并将PCR反应液提交至上海生工生物工程有限公司进行测序。将5.8S rDNA测序结果提交至美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库中进行BLAST比对，并采用 MEGA 7.0软件的邻近法（neighbor joining，NJ）构建系统发育树，分析并确定酵母种类。
1.3.5 优良酿酒酵母的酿酒性能分析
将复筛得到的优良菌株和法国进口的LA-PE白葡萄酒酿酒酵母分别接种于100mL/250mL模拟葡萄汁培养基中，28℃静置培养48h制备液体种子。收集各发酵液，8000r/min离心2 min，弃上清液，沉淀用生理盐水洗涤3次，最后悬浮于10mL生理盐水中。将各菌种按1.0×108CFU/mL的浓度分别接种于7 L的水晶葡萄汁中（糖度用白砂糖调至25°Bx，pH用酒石酸调至3.3，SO2质量浓度为60 mg/L），装入10 L玻璃坛中水封发酵20d至产气结束。期间记录各坛产气时间、菌体絮凝时间、主发酵持续时间等。然后对酒液过滤，于5L玻璃坛中满坛陈酿30 d。参照周一琴等[17]的方法检测葡萄酒的澄清度、色泽。参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》检测各菌株发酵酒液的色度（OD520nm值）、酒精度、残糖、总酸及挥发酸的含量[13]。
2 结果与分析
2.1 酿酒酵母的分离结果
葡萄发酵液经梯度稀释和WL固体平板分离，共挑选出18株疑似酿酒酵母，编号为SJJM-1～SJJM-18。所有酵母菌菌落均呈乳白色（少数带浅绿色），生长前期，菌落圆隆光滑、后期高凸，稠厚不透明，酒香味明显，具有典型的酿酒酵母形态特征。其中菌株SJJM-7的菌落和细胞形态特征见图1。
图1 菌株SJJM-7的菌落（a）和细胞（b）形态
Fig.1 Colony(a)and cell(b)morphology of strain SJJM-7
2.2 优良酿酒酵母的初筛
经杜氏管产气试验，检测各菌株的产气起始时间、杜氏管满气时间及菌体凝集性，并记录产气高峰持续时间，结果如表1所示。由表1可知，菌株SJJM-2、SJJM-5、SJJM-6、SJJM-7、SJJM-9、SJJM-10、SJJM-11、SJJM-17、SJJM-18凝聚性能最好，均在培养9 h内开始凝聚，并迅速在管底形成大量白色沉淀；菌株SJJM-7、SJJM-18的产气时间最早，培养4 h即开始产气；菌株SJJM-2、SJJM-5、SJJM-8、SJJM-10、SJJM-13和SJJM-18的发酵高峰持续时间最久，达3 d左右；菌株SJJM-7和SJJM-18发酵最为迅速，在发酵时间为16h时，气体充满杜氏小管。结合各菌株的凝聚性能、产气起始时间、小管满气时间及发酵高峰持续时间，选取菌株SJJM-2、SJJM-5、SJJM-6、SJJM-7、SJJM-8、SJJM-9、SJJM-10、SJJM-11、SJJM-13、SJJM-17和SJJM-18进行耐受性复筛试验。
表1 分离菌株的初筛结果
Table 1 Preliminary screening result of isolated strains
注：“+”表示凝聚性较差；“++”表示凝聚性一般；“+++”表示凝聚性较好。
菌株编号 凝聚性 产气起始时间/h小管满气时间/h发酵高峰持续时间/d SJJM-1 SJJM-2 SJJM-3 SJJM-4 SJJM-5 SJJM-6 SJJM-7 SJJM-8 SJJM-9 SJJM-10 SJJM-11 SJJM-12 SJJM-13 SJJM-14 SJJM-15 SJJM-16 SJJM-17 SJJM-18++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++7 6 1 2 14 6 12 4 12 8 8 1 6 12 12 16 12 20 18 4 32 24 36 32 20 32 16 32 20 20 36 32 28 40 36 40 24 16 2 3 2 2 3 2 2 3 2 3 2 2 3 2 2 2 2 3
2.3 优良酿酒酵母复筛结果
2.3.1 糖耐受性试验结果
表2 分离菌株的糖耐受性试验结果
Table 2 Sugar tolerance test results of isolated strains
注：“+++”指产气旺盛或菌体生长多；“++”指产气较强或菌体生长一般；“+”指产气弱或菌体生长少；“-”指不产气或菌体减少；“--”指菌体明显减少。
菌株编号糖含量/%10产气生长 生长 生长 生长 生长+++++++++++++++++++++++++++++++++20产气30产气40产气50产气60产气生长SJJM-2 SJJM-5 SJJM-6 SJJM-7 SJJM-8 SJJM-9 SJJM-10 SJJM-11 SJJM-13 SJJM-17 SJJM-18+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ +- + - + + - - - +- + - + - + + - - - +- - - + - + + - - - +- - - - - - - ----- +
初筛菌株的糖耐受性试验结果如表2所示。由表2可知，所有菌株在含20%糖培养基中均能正常发酵，菌体数量增长明显；当糖含量增加至40%时，各菌株发酵产气速度迅速下降，菌体数量增长缓慢；当糖含量为60%时，只有菌株SJJM-7、SJJM-9、SJJM-10和SJJM-18能够发酵产气，但产气速率非常低，菌体数量变化不明显，其他菌株菌体浓度下降。与刘畅[18]报道的酿酒酵母只能耐受50%以下的糖含量相比，菌株SJJM-7、SJJM-9、SJJM-10和SJJM-18具有较高的糖耐受性。
2.3.2 pH耐受性试验结果
初筛菌株在pH为2.0的模拟葡萄汁培养基中的存活率如表3所示。由表3可知，初始菌株在pH 2.0的培养基中培养2 d后，菌株SJJM-2、SJJM-5、SJJM-7、SJJM-9及SJJM-18的存活率均＞20%。与汤晓宏等[9]报道的葡萄酒野生酿酒酵母可耐受pH 2.5相比，这些菌株对较强酸性环境的抵抗力强，结合糖耐受性试验结果，选取菌株SJJM-2、SJJM-5、SJJM-7、SJJM-9及SJJM-18进行乙醇耐受性试验。
表3 分离菌株的pH耐性性试验结果
Table 3 pH tolerance test results of isolated strains
菌株编号 菌种起始浓度/（×106CFU·mL-1）菌种终浓度/（×106CFU·mL-1）存活率/%SJJM-2 SJJM-5 SJJM-6 SJJM-7 SJJM-8 SJJM-9 SJJM-10 SJJM-11 SJJM-13 SJJM-17 SJJM-18 37.33±1.33 39.67±3.67 36.00±2.00 41.33±1.33 36.33±1.52 36.00±0.00 42.00±1.00 38.33±1.33 37.67±2.25 39.33±1.26 41.67±0.91 8.00±0.67 8.33±0.33 5.67±1.67 9.67±0.33 3.00±0.67 9.33±0.22 2.67±0.22 4.00±0.00 4.00±0.00 7.33±0.82 9.00±0.00 21.43±1.79 21.00±0.83 15.75±4.64 23.40±0.79 8.92±1.84 25.92±0.61 6.36±0.52 10.44±0 10.62±0 18.64±2.08 21.60±0
2.3.3 乙醇耐受性试验结果
将菌株SJJM-2、SJJM-5、SJJM-7、SJJM-9及SJJM-18的液体种子分别接种于不同乙醇浓度（10%vol、12%vol、14%vol、16%vol和18%vol）的模拟葡萄汁培养基中培养2 d，观察菌种的生长和产气情况，结果如表4所示。由表4可知，所有菌株均能在乙醇含量为10%vol的培养基中生长、发酵产气；当乙醇浓度为12%vol时，所有菌株发酵产气均明显减弱，其中菌株SJJM-5停止发酵产气，菌体数量减少；乙醇浓度为14%vol时，除菌株SJJM-18少量产气外，其余菌株均停止发酵产气，菌体浓度降低明显；当乙醇浓度增加到16%vol时，所有菌株均停止产气，菌体浓度急剧减少甚至完全检测不到。与汤晓宏等[9，19]报道的野生酿酒酵母的乙醇耐受性相比，这些菌株的乙醇耐受性较低，满足酿造要求还有一定的差距，后期可对其进行进一步驯化和培育，使其满足酿造较高酒精度葡萄酒的条件。
表4 分离菌株的乙醇耐受性试验结果
Table 4 Ethanol tolerance test results of isolated strains
注：“++”指产气或生长旺盛；“+”指产气或生长较少；“（+）”指微量产气或生长；“（-）”指菌体浓度少量减少；“-”指停止产气或菌体浓度显著减少；“--”指菌体浓度减少较多；“×”指无活菌体。
菌株编号乙醇含量/%vol 10产气 生长 生长 生长 生长+++++++++12产气14产气16产气18产气 生长SJJM-2 SJJM-5 SJJM-7 SJJM-9 SJJM-18++++++++++（+）- ++-（+）+（+）（-）+- - - -（+）- - - - -- - - - ---×--×--- - - - -×××××
2.3.4 SO2耐受性试验结果
由乙醇耐受性试验结果可知，菌株SJJM-2、SJJM-7和SJJM-18有较强的乙醇耐受性，因此，对这3株菌株的SO2耐受性进行测定，结果如表5所示。由表5可知，3株菌对SO2均有较高的耐受性，在SO2含量为200mg/L的培养基中仍能保持微弱的发酵和生长。其中，菌株SJJM-7对SO2的耐受性最强，能在SO2含量为300 mg/L的发酵培养基中生长，且能产生少量气泡。
表5 分离菌株的SO2耐受性试验结果
Table 5 SO2tolerance test results of isolated strains
注：“++”指产气或生长旺盛；“+”指产气或生长较少；“（+）”指微量产气或生长；“（-）”指菌体浓度少量减少；“-”指停止产气或菌体浓度显著减少。
菌株编号SO2含量/（mg·L-1）100产气 生长 生长 生长++++++150产气200产气300产气 生长SJJM-2 SJJM-7 SJJM-18++++++++++-+++（+）+（+）（+）+（+）（+）-（-）+（-）
结合初筛和耐受性试验结果可知，菌株SJJM-7和SJJM-18具良好的凝聚性、较早的发酵产气时间、较强的产气能力和较强的耐受性，为优良酿酒酵母，在葡萄酒发酵应用中具有一定潜力。
2.4 优良酿酒酵母的分子生物学鉴定结果
以菌株SJJM-7和SJJM-18的单菌落为模板，以引物NL1和NL4为上下游引物，进行菌落PCR扩增，PCR扩增产物送去测序。测序结果经BLAST比对后发现，菌株SJJM-7和SJJM-18的5.8S rDNA序列与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YLL20等菌株的相似性＞99%。选取同源性较高的模式菌株的5.8S rDNA序列，采用NJ法构建系统发育树，结果如图2所示。由图2可知，菌株SJJM-7和SJJM-18与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）聚于一支，亲缘关系最近。结合菌株在WL培养基中的菌落特征，鉴定菌株SJJM-7和SJJM-18均为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
图2 基于5.8S rDNA序列菌株SJJM-7和SJJM-18的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of strain SJJM-7 and SJJM-18 based on 5.8S rDNA sequences
2.5 优良酿酒酵母酿酒性能试验结果
将菌株SJJM-7、SJJM-18及LA-PE分别接种于水晶葡萄汁中，经20 d主发酵、30 d陈酿后，检测葡萄酒的澄清度、色度、色泽、酒精度、残糖、总酸及挥发酸的含量，结果如表6所示。由表6可知，菌株SJJM-7、SJJM-18发酵的葡萄酒在澄清度、挥发酸、残糖含量及酒精度等方面优于菌株LA-PE，更适合本地的水晶葡萄酒的酿制。菌株SJJM-7、SJJM-18发酵的葡萄酒的挥发酸、残糖量、酒精度均符合GB 15037—2006《葡萄酒》（挥发酸≤1.2g/L；残糖量≤4.0 g/L；酒精度≥7.0%vol）要求。SJJM-7和SJJM-18组的残糖量均≤4.0 g/L，适合酿制干白葡萄酒（残糖量≤4.0 g/L）。
表6 优良酿酒酵母酿酒性能的测定结果
Table 6 Determination results of enological characteristics for excellentSaccharomyces cerevisiae
菌株编号澄清度色度色泽总酸/（g·L-1）挥发酸/（g·L-1）残糖量/（g·L-1）酒精度/%vol SJJM-7 SJJM-18 LA-PE 0.853±0.019 0.892±0.010 0.780±0.005 0.212±0.006 0.206±0.002 0.280±0.012浅棕色浅棕色浅棕色9.75±0.22 5.62±0.26 6.72±0.18 0.42±0.08 0.51±0.06 0.42±0.09 4.00±0.09 3.80±0.10 4.20±0.03 8.60±0.32 9.54±0.28 8.12±0.33
3 结论
本研究以贵州省所产的水晶葡萄为原料，分离筛选出两株性能优良的酵母，分别命名为SJJM-7和SJJM-18。两株酵母均具有良好的凝聚性，发酵启动早，产气速度快且发酵高峰持续时间久。耐受性试验结果表明，菌株SJJM-7和SJJM-18均能耐受50%的高糖模拟葡萄汁培养基；能耐受pH为2.0的模拟葡萄汁培养基，发酵2 d后菌体存活率均＞20%；乙醇耐受性强，能耐受12%vol的乙醇；能耐受高浓度的SO2，其中菌株SJJM-7能在含300 mg/L SO2的培养基中生长、产气。经分子生物学鉴定后，这两株菌均被鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。利用这两株菌株发酵水晶葡萄汁后，菌株SJJM-7和SJJM-18的酿酒性能优于进口商品酵母菌株LA-PE。结果表明，菌株SJJM-7和SJJM-18在生产水晶葡萄酒方面具有一定的研究意义和应用价值。
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