通过酵母发酵法制备核酸是目前核酸工业生产的主要方法，以核酸为原料通过分解法生产核苷酸已被广泛应用[1]。核酸是一种大分子物质，几乎参与生物体内所有的生化过程[2]。而核苷酸是核酸的基本结构单位，具有重要的生物学功能。大量临床研究和试验数据表明，酵母核苷酸具有增强免疫[3]、抗氧化[4]，维持肠道正常菌群的消化和吸收[5]，促进细胞和组织再生与修复的功能[3]。
热带假丝酵母（Candida tropicalis）是重要的工业酵母，是生产长链二羧酸[6]、木糖醇[7]和羟基还原酶[8]等工业原料的主要生产菌，也是利用低成本工业废弃物生产单细胞蛋白的重要微生物[9]。热带假丝酵母还是酵母核酸发酵工业重要的菌株来源，从热带假丝酵母提取的核酸广泛应用于食品和医药工业[10-12]。热带假丝酵母耐糖、耐高温、耐酸、生长速度快的生理性质使之成为发酵生产核酸的优良菌株。目前，从自然界分离、筛选仍然是获得热带假丝酵母工业用菌株的主要方法，基因工程或基因编辑改造手段和法规尚不完善，多数研究仍集中于工艺条件优化[10-12]。
电子束辐射是一种安全性高和可控性强的电离辐射技术，其没有辐射源，不会残留有害物质对环境造成污染。电子加速器产生的电子束可以破坏生物细胞的DNA，或者辐射水和小分子产生-H、-OH等活性自由基，这些自由基导致细胞被氧化，对生物体（微生物等）造成不可弥补的损伤。研究者将电子束辐射运用于诱变育种，在很多植物表现了良好的诱变效应[13-14]。研究发现电子束辐射诱变具有辐射生理损伤小、突变频率高、突变谱宽等特点，是一种极具发展潜力的诱变技术。但应用于微生物的相关研究较少[15-17]。Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验结合响应面等方法是广泛使用的工艺优化方法，可以快速、准确、有效地预测发酵过程中的显著影响因子、最佳水平范围及最优条件[18-20]。
本研究以目前核酸工业发酵最高水平菌株，核酸含量为15%～17%的热带假丝酵母（Candida tropicalis）HY4-17为出发菌株，采用电子束辐射技术进行诱变育种，以期筛选得到高产核酸的菌株。拟在获得正向突变株的基础上，通过Plackett-Burman试验确定发酵参数中显著影响核酸含量的因素，再设计最陡爬坡试验，获得核酸最大产量区域，应用中心组合设计（centralcomposite design，CCD）响应面分析法对发酵培养基进行优化，确定最佳培养基；并优化接种量缩短发酵时间，以期获得该突变株在实验水平的最佳核酸发酵条件，为工业化发酵酵母核酸提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
热带假丝酵母（Candida tropicalis）HY4-17：湖北海宜生物科技有限公司保藏。
1.1.2 化学试剂
葡萄糖、蔗糖、甘油、硫酸铵、硫酸锌、硫酸亚铁、硫酸镁、氯化钠、磷酸、盐酸、硼酸、氢氧化钠、高氯酸、酵母抽提物、蛋白胨（均为分析纯或生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基
酵母膏胨葡萄糖（yeastextractpeptonedextrose，YEPD）固体培养基：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，琼脂2 g/L。
种子培养基[21]：蔗糖20 g/L，酵母提取物20 g/L，硫酸铵2 g/L，硫酸锌0.06 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸亚铁0.05 g/L，磷酸1 mL/L，用磷酸和氢氧化钠调pH值至4。
发酵培养基：糖蜜45g/L，硫酸铵2g/L，硫酸锌0.05 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸亚铁0.05 g/L，磷酸1 mL/L，用磷酸和氢氧化钠调pH值至4。
以上培养基灭菌条件均为121℃、15 min。
1.2 仪器与设备
DNP-9162型电热恒温振荡培养箱：太仓市强乐实验设备有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；GJ-2-Ⅱ电子加速器：上海先锋电机厂；ZHJH-1112型超净工作台：苏净集团安泰公司；Molecular Devices M2多功能酶标仪：美谷分子仪器（上海）有限公司；PB-10标准型pH计：德国赛多利斯股份公司。
1.3 方法
1.3.1 菌种培养
菌种活化：从-80℃冰箱冻存管中挑取少量菌体加入装有5 mL种子培养基的玻璃试管中，30℃、120 r/min过夜振荡培养。
种子培养：从活化好的试管中接种1 mL种子液到装液量为100 mL/500 mL种子培养基中，30℃、180 r/min振荡培养8 h左右，菌种达到对数期，用于摇瓶发酵。
摇瓶发酵培养方法：接种3%的种子培养液于装液量为30 mL/250 mL发酵培养基中，30℃、220 r/min振荡培养。
1.3.2 核酸分析检测
使用酶标仪测定OD562nm值；核酸产量测定参照文献[22]的高氯酸法略作修改：取对数中期的酵母菌液2mL于A、B两个试管中，4000r/min离心10min，A管置于60℃烘箱中烘干称质量，B管倒掉上清，加1mL生理盐水重悬，以4000r/min离心10 min，将上清尽量取干净，加入10%的高氯酸2 mL，置于70℃的水浴锅中加热20 min，期间每隔4～5 min上下颠倒试管混匀，然后置于冰上冷却，以10 000 r/min离心10 min。取100 mL上清液加入4.9 mL的无菌水中，振荡混匀，用酶标仪在波长260nm处测定吸光度值，空白为100 μL 10%的高氯酸加入4.9 mL的无菌水中。核酸含量及核酸产量计算公式如下：
Y=m/2×X
式中：X为核酸含量，%；Y为核酸产量，mg/mL；A为波长260nm处样品的吸光度值；50为稀释倍数；2为高氯酸体积，mL；m为2 mL菌液所得菌体质量，mg；26为1 mL/mg核酸标准品的吸光度值；m/2为生物量，mg/mL。
1.3.3 电子束辐射诱变
电子束辐照诱变热带假丝酵母的最大束功率为2.0MeV，50kW，每次实验辐射能量保持在1.8MeV。取10mL对数中后期的菌悬液装于已灭菌的透明培养袋中，密封用于辐照。热带假丝酵母辐照剂量分别为0.5 kGy、1.0 kGy、1.5 kGy、2.0kGy、3.0kGy、4.0kGy，以未照射的假丝酵母作为对照组。样品处理完毕后，分别用生理盐水稀释，涂布到固体培养基上，在30℃恒温培养48 h，计算菌株致死率，其计算公式如下：
1.3.4 突变菌株的筛选
初筛挑取诱变后较大的单菌落于加入装有5 mL种子培养基的玻璃试管中28℃、120 r/min，过夜振荡培养活化。采用1.3.1的菌种培养方法扩大并发酵8 h，选择OD562nm值＞0.6的突变株，根据1.3.2核酸测定方法测定核酸含量，选取核酸含量提高10%以上的突变株复筛。复筛菌株培养方法及核酸含量测定方式同初筛。
1.3.5 突变菌株的生长曲线
接种3%的种子培养液于装液量为30 mL/250 mL发酵培养基中，30℃、220 r/min培养，每隔2 h使用酶标仪检测OD562nm值，以时间为横坐标，OD562nm值为纵坐标绘制生长曲线，根据生长曲线选择生长速率最快的突变株，及确定突变株的生长周期。
1.3.6 突变菌株的遗传稳定性
将经过诱变复筛得到的高产核酸的突变株在YEPD培养基平板上连续转接8代，进行摇瓶发酵试验，测定对数中期核酸含量，检测菌株的遗传稳定性。
1.3.7 发酵培养基的优化
（1）Plackett-Burman（PB）试验设计
选用N=12的Plackett-Burman两水平法对影响核酸产量的7种因素进行考察[21]，筛选出对核酸产量有显著作用的因素。使用Minitab 18.0软件进行Plackett-Burman试验设计，试验因素与水平见表1，其中“-1”表示低水平，“1”表示高水平。
表1 Plackett-Burman试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests design
代码 因子 水平-1 1 ABCDEFJ糖蜜/（g·L-1）（NH4）2SO4/（g·L-1）MgSO4/（g·L-1）ZnSO4/（g·L-1）FeSO4/（g·L-1）H3PO4/mL pH值22.5 1 0.25 0.025 0.025 0.5 4 67.5 3 0.75 0.075 0.075 1.5 6
（2）最陡爬坡试验
依据Plackett-Burman试验结果，将显著影响核酸产量的因素：糖蜜、硫酸铵、pH，进行最陡爬坡优化。依据效应分析，以表1初始水平“0”为起点，正显著因素逐步提高含量，负显著影响因素逐步降低含量，其他非显著影响因素取初始水平，获得核酸含量最大时相应的糖蜜、硫酸铵、pH值。
（3）响应面试验设计
通过最陡爬坡试验获得核酸最大产量区域后，根据中心点确定显著因子的高、中、低水平，分别以-2、-1、0、1、2编码，响应面试验因素与水平见表2。
表2 响应面试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface tests
代码 因子-2 -1水平0 1 2 ABC糖蜜/（g·L-1）硫酸铵/（g·L-1）pH值125 2.0 3.0 145 2.5 3.5 165 3.0 4.0 185 3.5 4.5 205 4.0 5.0
1.3.8 接种量和发酵时间对核酸产量的影响
使用响应面优化得到的培养基，分别接种3%、5%、8%、10%、12%的种子培养液于装液量为30 mL/250 mL发酵培养基中，30℃、220r/min培养，分别于6 h、8 h、12 h、16 h、18 h检测核酸产量及生物量。
1.3.9 数据分析
响应面试验数据采用Design Expert10.0软件进行统计学分析，每组试验进行3个重复，取3个重复的平均值。
2 结果与分析
2.1 电子束辐射诱变
参考前期文献对铜绿微囊藻的[17]诱变剂量，及电子加速器剂量限制条件（辐射剂量最低为0.5 kGy可保障其准确性），辐照剂量分别为 0.5 kGy、1.0 kGy、1.5 kGy、2.0 kGy、3.0kGy、4.0kGy，以未照射的假丝酵母HY4-17作为对照组。诱变处理完毕后，分别用生理盐水稀释，涂布到YEPD固体培养基上，在30℃恒温培养48 h，结果见图1。
图1 诱变菌株的菌落形态
Fig.1 Colony morphology of mutant strains
由图1可知，经0.5 kGy剂量电子束辐射处理后稀释10-5平均存活48个单菌落，菌落形态较为均一，为乳白色球状，大小与出发菌株相近。分析致死率，0.5 kGy剂量为98%，辐照剂量≥1.0 kGy致死率接近100%。据文献报道[23]，当致死率为85%～95%时，可获得较高的正突变率。选择致死率最低接近95%的0.5 kGy剂量筛选突变株。
2.2 突变菌株的筛选结果
本研究对0.5 kGy诱变剂量YEPD固体培养基挑选出的100个较大单菌落菌种培养，选择培养8 h，生长较快即OD562nm值＞0.6的33株突变株测定核酸含量，结果见图2。
图2 电子束诱变初筛及复筛结果
Fig.2 Preliminary and secondary screening results after electron beam mutagenesis
“*”表示突变株与原始菌株HY4-17比较差异显著（P＜0.05）；“**”表示差异极显著（P＜0.01）。
由图2A可知，筛选到15株核酸含量高于原始菌株HY4-17的突变株，其中7株菌株的核酸含量提高10%以上，显著高于HY4-17。选择这7株突变株进行复筛，图2B可知，复筛得到4株核酸含量显著提高的突变株，其中突变株EBI-21和EBI-22核酸含量最高，均达到20.8%，比出发菌株提高了25%。因此，选择菌株EBI-21和EBI-22作为为进一步研究的菌株。
2.3突变菌株的生长曲线
由于酵母核酸含量在对数生长期最高，随发酵时间延长会不断降低，最终达到稳定。选择生长速率快且核酸含量高的菌株尤为重要。以原始菌株HY4-17为对照，实验进一步研究了突变株EBI-21和EBI-22的生长曲线，结果见图3。由图3可知，3株菌在0～4 h为迟缓期，4～14 h为对数生长期，14～18h为稳定期，OD562nm值=0.6为对数中期。培养8 h，出发菌株HY4-17、突变菌株EBI-21和EBI-22的OD562nm值分别达到0.6、0.8和0.7，突变菌株EBI-21和EBI-22生长速率明显优于出发菌株HY4-17，更早的进入对数中期。而突变菌株EBI-21则是生长速率最快的菌株，培养7h，其OD562nm值达到0.6，比出发菌株HY4-17提前1h进入对数中期。突变菌株EBI-22约培养7.8h，OD562nm值达到0.6。因此，菌株EBI-21作为进一步研究的出发菌株。
图3 菌株EBI-21和EBI-22的生长曲线
Fig.3 Growth curves of strain EBI-21 and EBI-22
2.4 突变株EBI-21的遗传稳定性
突变株的遗传稳定性对于菌株的应用至关重要。对筛选出的突变菌株EBI-21进行遗传稳定性实验。连续传代8代，测定其每代摇瓶发酵核酸含量，结果见表3。
表3 菌株EBI-21多次传代后对核酸含量的影响
Table 3 Effect of multiple passage of strain EBI-21 on nucleic acid
content
传代次数 核酸含量/% 传代次数 核酸含量/%1 2 3 4 20.8±1.0 19.6±0.2 20.0±0.6 20.7±0.4 5 6 7 8 19.0±0.2 18.9±1.0 19.6±1.6 18.7±1.5
由表3可知，突变菌株EBI-21经过8代遗传稳定性试验，核酸含量维持在（18.7±1.5）%～（20.8±1.0）%。经统计学分析，传代2～8次与第一代相比，差异不显著（P＞0.05），表明突变菌株EBI-21遗传稳定性良好。因此，以EBI-21为出发菌优化发酵条件，进一步提高核酸产量。
2.5 响应面法优化发酵培养基
2.5.1 Plackett-Burman试验
尽管酵母核酸含量随发酵时间延长会不断降低[24]，而随生物量的增加，核酸产量随时间延长在不断增加。在优化培养基之前，预实验以EBI-21为出发菌，摇瓶发酵培养22 h核酸产量达到最高。
Plackett-Burman试验设计结果见表4，用Minitab18.0软件对表4试验数据进行处理，并进行各因素效应分析，结果见表5。由表5可知，糖蜜、硫酸铵、pH对核酸的产量具有显著性影响（P＜0.05），由P值可知，影响效应依次为糖蜜＞pH值＞硫酸铵。糖蜜和硫酸铵对核酸产量的影响呈正效应，pH值对核酸产量的影响呈负效应。
表4 Plackett-Burman设计与结果
Table 4 Design and results of Plackett-Burman tests
试验号 A B C D E F J Y核酸含量/（g·L-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1-1-1-1-1-1-1-1-1 1 1 -1 1 1 --1 1-1-1-1-1-1 1-1 1 1 1 --1-1-1-1-1-1 1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 1 -1 1 -1 1 -1-1-1 1 1 1 -1 1 1 1 1 -1 11 12 1 1 1 1-1 1 1 1 1 1 -1 1 1 1 1 1-1-1-1 0.70 0.70 1.09 0.74 1.05 1.07 0.69 0.71 0.65 1.04 1.18 1.11
表5 Plackett-Burman试验因素水平及效应分析
Table 5 Factor,levels and effect analysis of Plackett-Burman tests
注：“+”表示差异显著（P＜0.05）；“NS”表示无显著性差异。
编码 因子 T值 P值 显著性ABCDEFJ糖蜜（NH4）2SO4 MgSO4 ZnSO4 FeSO4 H3PO4 pH值40.07 4.28 1.25-1.38 0.99 1.64-5.72 0.000 0.013 0.279 0.239 0.380 0.175 0.005++N S NS NS NS+
2.5.2 最陡爬坡试验
根据PB试验结果的效应分析，通过最陡爬坡试验分别优化糖蜜，硫酸铵及pH值，试验设计及结果见表6。由表6可知，当糖蜜质量浓度为165 g/L，硫酸铵质量浓度为3 g/L，pH值为4时，核酸产量最高，因此选为中心点，进行响应面试验设计。
表6 最陡爬坡试验设计及结果
Table 6 Design and results of the steepest ascent tests
试验号ABJY核酸产量/（g·L-1）1 2 3 4 5 45 105 165 225 285 2 5 2.5 3 3.5 4 4.5 4 3.5 3 0.96 1.22 1.46 1.38 1.26
2.5.3 响应面试验预测最优培养基
根据最陡爬坡试验结果分析，结合试验需要，响应面试验设计与结果表7，非显著因子选用PB试验“0”对应的水平。将中心点设为糖蜜为165g/L，硫酸铵为3g/L，pH值为4。响应面二次回归模型方差分析结果见表8。
表7 响应面试验设计及结果
Table 7 Design and results of response surface tests
试验号ABJY核酸产量/（g·L-1）12345 6 7891 0 20101 1 -0 0 -1-2 1 1 10-0 0 1 0 -2 1 -1 0 -1 11 12 13 14 15 16 17 1 0 1 0 -1 1 0 --2-1-2 0 0 0 -10 1002010 000010 1.61 1.46 1.63 1.38 1.47 1.62 1.38 1.45 1.38 1.26 1.30 1.27 1.46 1.50 1.47 1.37 1.46
通过Design Expert分析软件对表8数据进行回归分析，得到核酸产量（Y）对糖蜜（A）、硫酸铵（B）及pH值（C）的二次回归方程如下：
Y=1.46+0.086A+0.026B+0.057C-0.004 34AB+0.047AC-
0.020 BC-0.003 75A2-0.005 44B2-0.021C2
表8 回归模型方差分析
Table 8 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型ABCA B********AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总回归0.2 0.095 8.67E-03 0.018 1.02E-04 0.012 2.25E-03 3.31E-04 6.93E-04 4.01E-03 1.24E-03 1.00E-03 2.40E-04 0.2 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 1 6 0.022 0.095 8.67E-03 0.018 1.02E-04 0.012 2.25E-03 3.31E-04 6.93E-04 4.01E-03 1.78E-04 3.35E-04 5.99E-05 124.73 532.94 48.76 98.55 0.57 66.41 12.63 1.86 3.9 22.57＜0.000 1＜0.000 1 0.000 2＜0.000 1 0.473 4＜0.000 1 0.009 3 0.214 9 0.088 8 0.002 1******5.590.064 9 R2=99.38%，R2adj=98.58%
由表8可知，模型的P值＜0.000 1，表明模型极显著；失拟项的P值为0.064 9＞0.05，表明差异不显著，残差由随机误差引起，可以判定该模型与样本具有较高的相关性。一次项A、B、C，交互项AC、BC，二次项C2对核酸产量均有极显著性影响（P＜0.01）。决定系数R2=0.993 8，说明模型拟合性较好，调整决定系数R2adj=0.985 8，说明该模型能解释98.58%的响应值变化，表明该模型可行度高。
通过Minitab软件对回归方程计算，预测核酸含量最高时各因素水平如下：糖蜜185g/L，硫酸铵3g/L，pH值为4.5，核酸产量理论预测值为1.63 g/L。在此优化条件下进行3次平行验证试验，获得的核酸产量平均值为1.64 g/L，与理论预测值接近，说明该模型可行。
2.6 接种量对发酵时间和核酸产量的影响
除优化培养基外，还探索了最适接种量对培养时间及核酸产量的影响，结果见图4。由图4可知，核酸产量随时间延长而升高，达到稳定期不再增长，接种量为8%，核酸产量在12 h时达到最高，为1.73 g/L。接种量为3%和5%时，核酸产量分别在16 h、18 h时达到最高，相比接种量为8%时发酵时间增加4～6 h。所以相对较高的接种量能缩短发酵时间，但不影响核酸产量，并节约生产成本，利于工业生产。
图4 不同接种量对发酵时间和核酸产量的影响
Fig.4 Effect of inoculum on fermentation time and nucleic acid production
3 结论
本研究采用电子束辐射诱变技术对高产核酸的热带假丝酵母HY4-17菌株进行处理，在0.5 kGy剂量诱变单菌落中成功地筛选得到核酸含量高达20.8%的突变株，比出发菌株提高了25.9%，是目前报道的菌株中核酸含量最高的。突变株EBI-21的生长速率明显提高，可提前1 h进入对数中期。通过PB试验，最陡爬坡试验及CCD试验等手段优化发酵培养基，培养基优化后组成为糖蜜185 g/L，硫酸铵3g/L，硫酸锌0.05g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.05g/L，磷酸1 mL/L，pH值为4.5。除了优化培养基，还探索了最适接种量。最优接种量为8%，发酵时间为12 h。在此优化条件下，核酸产量达到1.73g/L，与初始培养条件相比提高了80.21%，培养时间缩短了10 h。
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