发酵食品是利用微生物对特定的原料进行加工生产,最终获得具有益生理功能的产品。在经过这些功能性微生物的修饰后,产品中难以被人所吸收的大分子物质被降解,同时还产生了人体必需氨基酸或营养因子等物质[1-2],因而获得消费者的青睐。然而,由于发酵体系中的微生物过于复杂,因此,采用常规的研究手段难以探究影响发酵食品的口感、香气、结构和色泽的因素和机制。在这种情况下,代谢组学因其高通量、高灵敏度、检测范围广等特点逐渐被应用于发酵食品中。
代谢组学(metabonomics)是基于基因组学和蛋白质组学的研究思想,对生物体内所有代谢物进行定性定量分析,并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式[3]。代谢组学诞生于20世纪末,由英国伦敦大学JeremyNicholson教授创立,之后在多个领域得到发展,如营养食品科学、毒理学、环境学等领域[4-5]。近年来,随着气相色谱(gaschromatography,GC)、高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)、超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)、毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)、质谱(mass spectrograph,MS)、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)及其联用技术等一系列技术的快速发展,使得关于代谢产物和相关代谢途径的分离、检测及定量成为可能[6]。目前,代谢组学已经广泛的运用于不同的研究领域,本文就代谢组学的分析技术及其在发酵食品中的研究进展进行综述,为发酵食品的生产应用提供理论支撑。
代谢物是一类多种低分子质量结构的总和,包括脂质、氨基酸、多肽、有机酸,碳水化合物等,因此如何全面分析代谢物的组成及其影响机制成为一个难题。为了更好的反映细胞内稳态的动态过程,代谢物分析技术逐渐被完善,如气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LC-MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)、质谱(MS)、核磁共振(NMR)等技术[7-8]的发展。
质谱(MS)作为代谢组学的一项关键技术,其敏感性高,涉及的代谢物范围广,在研究中,经常与液相气相等技术相互结合使用。其可以从时间、营养情况和环境条件来分析数百种代谢物,同时以全局或部分的方式产生大量而复杂的数据集,从而达到检测和量化数以万计的代谢产物的目的[9]。基于质谱仪的代谢组分析将会有助于代谢网络的构建和生物标志物的发现,以衡量数以百计的代谢物的水平。
高效液相色谱(HPLC)具有高速、高效和高灵敏度的特点[10]。HPLC是测定稳定差或挥发性小的有机化合物的首选技术,因此HPLC适用于医药、食品、重工业和生物化学的分离[11]。VAHEDI M等[12]利用HPLC和HPLC-DAD法对伊朗藏红花的主要生物活性成分进行精细分离和测定。结果表明,影响代谢物水平的因素是多个方面的,发现藏红花素和苦番红花素是影响藏红花分类的主要影响因素。SPINOLA V等[13]利用反相高效液相色谱-二极管阵列检测法和电喷雾电离质谱联用技术对葡萄牙的5种水果进行酚类成分的研究,发现黄酮类化合物和酚酸类化合物是样品的主要成分,并且首次在木瓜、柠檬、草莓中鉴定出黄酮类、酚酸类、萜类和有机酸类化合物等39种化合物。
液相色谱-质谱仪(LC-MS)可将液相色谱仪的高效分离特性与质谱仪组分鉴定能力相结合起来,达到分离和分析复杂有机混合物的目的。LC-MS因其高通量、高灵敏度和高特异性、适用范围广、检测周期短,具有可同时检测多指标且准确性高的优势[14-15],逐渐替代了许多传统检测方法。头发内源性类固醇激素浓度的检测可获取有关激素使用的相关信息,GAO W等[16]以头发为样品,采用免疫测定、高效液相色谱荧光检测法、GC-MS、LC-MS对其进行比较分析,发现LC-MS法不仅具有极好的敏感性和特异性,而且具有样品处理简单和运行时间短,因此,LC-MS是毛发类固醇测定的最佳选择。近年来,一类具有抗糖尿病和抗炎作用的内源性哺乳动物脂类被发现,这类脂类被称为羟基脂肪酸支链脂肪酸酯(branched fatty acid esters of hydroxyl fatty acid,FAHTAs),ZHANG T J等[17]利用LC-MS对其进行详细的分析鉴定,鉴定了16个FAHTAs家族,其均由多个异构体组成,且支链酯位于不同的位置。
气相色谱-质谱仪(GC-MS)是一种测量离子荷质比的分析仪器。GC-MS因其具有GC高效的分离能力和MS强烈的鉴定能力被广泛的用于各物质的检测[18]。严慧等[19]为揭示溴鼠灵对大鼠毒性作用的分子机制,运用尿液代谢组学方法,采用GC-MS建立大鼠尿液的代谢指纹谱,发现大鼠中毒后,会诱导DNA损伤和突变,对神经和肾会造成损伤,表明代谢组学可为毒理学分析提供技术支持。KADHIM M J等[20]采用GC-MS分析了白色念珠菌的次生代谢产物,并评价其抗菌活性,在菌体的甲醇提取物中鉴定出39种生物活性化合物。挥发性有机化合物(volatile organic compounds,VOCs)的表达水平可以反映生物体的代谢状态[21]。LUBESG等[22]强调了GC-MS技术在监测挥发性有机化合物(VOCs)和鉴定可能用于癌症治疗的生物标记分子方面的作用。
核磁共振(NMR)技术是常用的光谱分析技术之一。NMR技术在测定时,由于只需对样品进行简单的预处理,无偏向性和对样品的非破坏性[23],因此被广泛应用于代谢物指纹图谱,定性分析和代谢通量分析,尤其是生物流体代谢组学领域的首选技术。刘红杰等[24]采用以1H-NMR为基础的尿液代谢组学技术,对艾叶挥发油的急性肝毒性机制进行探究,通过1H-NMR对代谢物的分析后发现毒性机制可能是艾叶挥发油参与到三羧酸循环和能量代谢中,从而引发了急性肝毒,还发现了可能的生物标志物:柠檬酸盐和齐墩果酸,为艾叶临床规范用药提供了实验数据。氧化应激被认为是引起鱼类汞中毒的重要途径,但汞诱导鱼类氧化应激的机制尚不明确。因此,CAPPELLO T等[25]利用环境代谢组学结合一些生物标志物,以来自于葡萄牙阿维罗泻湖中汞污染区和未污染区的鱼鳃为样本,基于NMR的代谢组学揭示了与抗氧化保护有关的代谢物的变化,在汞的长期积累下,导致了抗氧化剂谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的消耗,从而影响了鱼鳃的抗氧化作用。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱。MALDI-TOF MS技术具有准确、快速、范围广、分辨率高和高度自动化的鉴定等特点,在生物大分子和合成高聚物的测定方面具有优越性。在MALDI-TOF MS中,电离方式、质量分析器及基质成分是有别于其余的MS技术的重要部分,而基质更是其中的重中之重[26]。MALDI-TOF MS技术在蛋白质组学中是个不可缺少的重要关键技术之一,通过测量代谢物中的蛋白质含量表征出宿主的生命状况,但是该技术因存在离子抑制作用,故对代谢物的定量检测效果较差[27]。而有研究表明,MALDI-TOF MS已成功应用于大鼠脑组织和大鼠的药物和代谢物分布的研究[28]。
在发酵过程中,微生物的参与是必不可少的,分解原料,形成醇类、酸类、酯类等物质,同时产生的代谢物还可调节生物体功能,抑制体内有害物质的产生。因此,可采用代谢组学的方法来分析其作用机制及对发酵食品的影响[29-31]。
酱油是人们日常生活中常需的调味品之一,更是我国传统的酿造制品。酱油在酿造过程中会将原料中的部分有益物质保留下来,产生的某些代谢物还具有一定的杀菌作用,如酱油对于防癌特别是乳腺癌有一定的作用[32];MEGUMI K等[33]研究发现,酱油可杀死如大肠杆菌、沙门氏菌等食源性微生物。酱油的发酵过程较为复杂,也是酱油最重要的环节,因此采用代谢组学对其发酵过程中微生物以及代谢产物组分变化的检测是有必要的。
近年来,有许多研究学者开始将代谢组学技术运用到酱油生产过程中,探究酱油发酵过程中的变化。3-氯-1,2-丙二醇(3-chloro-1,2-propanediol,3-MCPD)是配制酱油生产过程中常会产生的一种氯丙醇物质,其本身具有致癌性、肾毒性等,摄入到人体内将会造成巨大伤害。张立娟[34]通过1H-NMR代谢组学对注射了3-MCPD的大鼠尿液进行分析,以大鼠的行为、体质量、饮食量、血清及尿液为生化指标,结果表明相比正常大鼠,3-MCPD大鼠的行为、体质量、饮食量均出现明显的减弱,还产生了肾毒性和睾丸毒性。豆酱的发酵是在多种微生物的作用下完成的,其代谢物与微生物有着密切关系,在这种情况下,LEES等[35]采用LC-MS和气相色谱-飞行时间质谱法(GC-TOF-MS)对两种不同的豆酱生产工艺,进行微生物多样性和代谢组学分析,发现曲霉种群与糖代谢、芽孢杆菌和脂肪酸的代谢有关,而四角球菌和结合酵母菌与氨基酸代谢有关。在酱油中,发现了上百种风味物质,如多肽、氨基酸、有机酸等,由于蛋白质降解作用/糖化作用和美拉德反应,使酱油产生独特的风味、色泽[36],还涉及脂肪的水解作用,产生了各种醛类、酮类、酯类等具有香气的物质。YAMAMOTO S等[37]阐述了双肽与酱油风味差异的关系,建立了LC/MS/MS分析技术,检测到237个双肽,再结合GC-MS和变量重要性投影(variable importance in the projection,VIP)相关性评价,发现Lle-Gln、Pro-Lys、Lle-Glu等多肽与风味差异的相关性较高。SHIGA K等[38]对25种酱油进行LC-MS和GC-MS分析,测定出427种化合物,利用PLS回归分析和VIP相关性检测,发现N-(1-脱氧果糖-1-酰基)谷氨酸的鲜味比谷氨酸更好。HARADA R等[39]采用GC/MS非靶向代谢谱研究酱油中低分子质量亲水性和挥发性化合物的变化,评价酵母菌和乳酸菌对其组成谱的影响,结果表明乳酸菌对酱油发酵过程中环烯、糠醛、糖醇等多种成分的产生有一定的影响。
食醋是我国传统的酸性调味品,醋的酿造在我国具有悠久的历史,自周朝开始就有酿醋的相关记载。醋在生产中,因所用原料大多是粮食,可能会存在重金属或农药残留等问题;除此之外,在微生物的作用下,还能产生功能活性物质。代谢组学技术可以检测发酵过程中有利或有害物质的变化及影响。
张嘉莹等[40]建立了泡腾辅助悬浮固化分散液液微萃取技术联合液相色谱法检测食醋中农药残留的方法,该方法对多效唑和异丙甲草胺的回收率达76%,可用于食醋中农药残留的测定。李爱平等[41]采用NMR的代谢组学技术,对进行了山西老陈醋灌胃处理了的大鼠尿液和血液进行了代谢组分析,结果发现这些代谢物都与能量代谢、糖代谢、脂肪代谢等途径有关,从而从侧面佐证了山西老陈醋的促能量代谢、降血糖血脂的作用。酿醋过程中有多种微生物参与其中,并伴随许多代谢物产生,但至今还没有研究表征香醋的综合代谢物组成。FARHANA P等[42]结合3种GC-MS技术对醋样品进行分析,准确鉴定了123种代谢物,包括25种氨基酸,26种羧酸,13种糖和糖醇及47种以上的芳香化合物,还首次鉴定出5种挥发性代谢物:丙酮、2-甲基吡嗪、2-乙酰-1-焦氨酸、对茴香胺和1,3-二乙酰丙烷。WANG Z M等[43]采用焦磷酸测序和代谢组学的方法,发现了细菌群落演替的批次均匀性是影响镇江香醋风味形成及品质的重要因素。NING Z等[44]采用GC-MS联用多元统计分析技术对米醋和白醋中的化学成分进行分析,并进行凝血实验,最终发现米醋及其生物碱代谢物在体外有抗血小板效应,在体内有抗凝活性,米醋生物碱具有促进血液循环的生物活性,而白醋没有这种功效;BRAIN J D等[45]将以醋为基础的多微量营养素(vinegar-based multi-micronutrient,VMm)作为饮用水,给大鼠(妊娠、哺乳和成年早期)饮用,再对大鼠的血液和尿液进行代谢组学的分析,结果表明含有VMm的饮料可以改变机体的生长、肠道代谢和微生物群落,为醋的开发及应用提供了新的方向。
酸奶是乳制品在保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的作用下经乳酸发酵而成的一种凝固型乳制品。酸奶由于乳酸菌的发酵作用,会使得原料中的营养物质发生变化,还会产生各种代谢产物,如乳糖变为乳酸,酪蛋白转变为肽和游离脂肪酸等,从而对酸奶的质地,风味等产生影响。因此,建立起一种较好的分析方法,探究酸奶发酵过程中的代谢机理和对其中的各种变化进行把控,显得尤为重要。
SETTACHAIMONGKON S等[46]研究发现以嗜热链球菌和保级利亚乳杆菌的共同培养物为发酵剂所生产的凝固型酸奶中的挥发性和非挥发性的芳香代谢物含量很高。通常认为发酵乳制品中,只能使用乳酸菌,加入酵母菌则会产生“胀包”现象,任梦棋[47]将3种酵母菌与酸奶发酵常用菌进行混合发酵,通过GC-MS对挥发性代谢产物进行检测,发现酵母菌的加入可使样品中的挥发性代谢产物以及有益脂肪酸含量有所增加,同时还能丰富产品的风味。PALOMOM等[48]对富硒保健酸奶中乳酸菌含硒代谢物组进行了分析,发现硒的富集可能与乳酸菌热休克蛋白分子伴侣的表达有关。YI L等[49]利用NMR技术对酸奶发酵过程中所产生的各种成分进行监测,为酸奶的分类提供了新的方法。在胃肠道疾病中,肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)被认为是会对人体新陈代谢造成一定影响的病,NOORBAKHSH H等[50]采用1H-NMR代谢组学的技术研究在益生菌酸奶进行干预前后的健康组和IBS-D组的代谢物差异,发现IBS会引起单碳代谢的变化,而经过益生菌酸奶干预后,IBS-D患者代谢物中的乳酸菌数量增加,同时健康状况得到明显的改善。类似的结论,在USUI Y等[51]的研究中也有报道,在长期摄入益生菌发酵而成的酸奶后,可通过控制肠道菌群及其代谢产物,来维持肠道屏障功能等系统的稳态。2.4其他
奶酪是乳酸菌发酵的一种食品,具有丰富的营养价值,是纯天然的食品。在奶酪形成的各个阶段中,由于乳酸菌和其他微生物的协同作用,使得其本身及其代谢物对奶酪的结构、风味产生影响。OCHI H等[52]采用GC/TOF MS对13种奶酪的亲水性小分子代谢物组进行了检测,发现氨基酸和乳糖对奶酪的“醇厚”形成有关,而“酸味”的形成与琥珀酸、乳酸等和乳糖的作用有关。PIRAS C等[53]利用1H-NMR技术对乳酸菌在意大利传统奶酪的制作中的作用进行研究,结果表明乳酸菌的菌群构成与奶酪口味的形成有着显著相关。
啤酒是有着“液体面包”之称,以大麦芽和小米为原料所酿造出的一种含二氧化碳的低酒精度饮料。DING MZ等[54]就通过GC-TOF MS对啤酒发酵中所用的酵母菌的胞内代谢物进行定量、定性分析,发现16种代谢物与氨基酸代谢有关;琥珀酸是TCA代谢的重要中间产物;月桂酸、十六烷烯酸、十八烷烯酸是脂肪酸代谢的产物。HEUBERGERA L等[55]利用UHPLC-MS对优良啤酒的大麦样品进行了代谢谱的分析,发现216种代谢物可作为挑选优良制麦的生物标记物。
泡菜是以蔬菜为原料,经乳酸菌发酵而成的一种风味独特的乳酸发酵蔬菜制品。程新[56]通过HPLC和GC-MS对菊芋泡菜中风味物质进行测定,发现低温条件下乳酸菌的代谢特征发生显著的变化,并最终影响泡菜的口感;同时,还发现锰离子对植物乳杆菌胞内代谢物,如糖、氨基酸、脂肪酸及其衍生物有显著影响,尤其是对氨基酸的影响。PARK S E等[57]利用GC-MS和基因组学研究不同MCSs(microbial communitystarters)对泡菜发酵的影响,根据MCSs的不同,泡菜中代谢物和微生物群落的分布也会产生显著差异,结果表明以MCSs作为泡菜的发酵剂,可提高泡菜的品质。3结语与展望
随着生活水平的不断提高,人们越来越重视食品营养和品质问题。发酵食品因在加工过程中伴随微生物参与,会形成一些特殊的营养因子,利于机体解毒消化吸收。代谢组学技术在发酵食品中的运用,不仅能从代谢水平方面解释食品营养因子与功能间的关系,还能从代谢水平上去研究发酵食品口味、风味、色泽及功能性形成过程中的关键性影响因子,找出关键的代谢物质以及发酵食品发酵过程中的关键代谢点,可以从更深的角度去阐明发酵过程中代谢物的变化如何影响食品的形成,同时还可阐述发酵食品是如何对机体健康、生长状况、肠道菌群等产生作用的。然而,由于多种微生物的参与以及肠道菌群的复杂性,使其代谢物复杂多变,给代谢物的定性定量分析带来了难度。因此,想要通过代谢组学技术将发酵过程中的各个机理阐述清楚,还需要进行大量研究。未来代谢组学技术可通过建立特异性的生物标志物,来深入研究发酵食品中代谢机理;对代谢组学的数据库进行扩容,提高代谢组学技术的精度和高覆盖性;采用多种技术相互结合,深层次的对代谢物的组分进行解析等方法,来使该技术可以在发酵食品中得到更加广泛的运用。
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Application of metabolomics in the study of fermented foods