慈梨（Pyrus pyrifolia）因其原产地在山东省莱阳市又名莱阳梨，其肉质清脆香甜，富含还原糖和微量元素，是人们喜食的一种水果[1]。现代医学研究证明[2]，梨有缓解铅中毒的功效。
炭烧酸奶又称褐色酸奶，是近几年新兴的酸奶品种，与传统酸奶相比，炭烧酸奶的色泽和风味主要源自美拉德反应。原料乳在高温条件下处理一定时间，乳中的蛋白质和还原糖（乳糖或其他外源性单糖）之间发生羰氨反应，生成种类繁多的小分子挥发性化合物和大分子褐色产物，使其具有特殊的焦糖气味和褐色色泽[3-4]。褐色酸奶作为一种新型的酸奶饮品，深受消费者的喜爱，但目前国内外缺少对其系统地研究。韩千慧等[5]对褐色酸奶的品质进行了评价，发现与普通酸奶相比，褐色酸奶具有酸味弱，硬度、稠度、凝聚性、表观黏度和黏度均显著偏小的特点。张俊山[6]以葡萄糖、果糖、果葡糖浆作为筛选的还原糖，分别与牛奶在不同的温度和添加量的条件下进行褐变反应，发现葡萄糖的褐变反应较好。张晟等[7]通过在原料奶中添加葡萄糖，以及经高温（97.3℃）加热一定时间（4.1 h）后，可加工出消费者可接受颜色和风味的褐色酸奶，与普通酸奶相比，加热后，有害物质5-羟甲基糠醛增大，但仍在安全限量范围，有效赖氨酸和蛋白质消化率均下降，但显著提升了风味。其他指标则无显著变化。目前具有果汁添加的褐色酸奶鲜有研究。本研究以慈梨浓缩汁和脱脂奶粉为原料研制炭烧慈梨饮用型酸奶，利用慈梨浓缩汁中的还原糖和脱脂乳中的蛋白质发生美拉德反应，并添加低聚果糖增强其保健功能和口感，通过单因素试验和响应面法确定产品的最佳工艺，研制一种既有慈梨香气又有炭烧风味的新型酸奶，不仅可以丰富酸奶的营养成分，为慈梨的深加工提供新的途径，还能为中国乳制品市场的发展提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料和菌株
脱脂奶粉（水分3.8%，蛋白质32.9%）：新西兰恒天然集团；慈梨浓缩汁（还原糖含量59.57 g/100 g）：山东一品堂实业有限公司；低聚果糖：云浮市新金山生物科技有限公司；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophiles）：河北一然生物科技有限公司。
1.1.2 化学试剂
盐酸、硫酸铜、亚甲蓝、酒石酸钾钠、氢氧化钠、乙酸锌、冰乙酸、亚铁氰化钾（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
WT型电子天平：杭州万特衡器有限公司；FA1004型电子天平、NDJ-5S数显黏度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；PHS-3E型酸度计：上海雷磁仪器厂；DNP-9082型电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；EM-30型磁力搅拌水浴锅：常州市人和仪器厂；NH300高品质便携式电脑色差仪：深圳市三恩时科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 炭烧慈梨酸奶加工工艺流程
1.3.2 炭烧慈梨酸奶工艺操作要点
复原脱脂乳制备：将脱脂奶粉加入65℃纯净水中充分溶解，复原脱脂乳固形物含量为12%，添加慈梨浓缩汁。
均质：在温度为60～65℃，压力为20 MPa条件下对复原脱脂乳进行均质。褐变处理：将复原乳放入98℃[8]的水浴中褐变处理。冷却、添加低聚果糖：定量称取低聚果糖，添加到冷却至40℃的复原脱脂乳中，充分搅拌溶解。
接种发酵：将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌（1∶1）混合菌种，接种于上述复原脱脂乳中，充分搅拌后，在42℃条件下发酵。
终止发酵：当pH下降至4.5～4.6时终止发酵。
冷藏后熟：将发酵结束后酸奶置于4℃冰箱中静置12～24 h后熟，即得炭烧慈酸奶。
1.3.3 炭烧慈梨酸奶工艺优化
（1）发酵条件优化单因素试验：设置慈梨浓缩汁添加量分别为5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%，褐变时间分别为90 min、105 min、120 min、135 min、150 min，接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%，发酵时间分别为6.0 h、6.5 h、7.0 h、7.5 h、8.0 h、8.5 h，低聚果糖添加量分别为0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%，采用单一变量的方法，考察各因素对炭烧慈梨酸奶的感官品质的影响。
（2）发酵条件优化响应面试验：在单因素试验结果的基础上，利用Box-Behnken试验设计原理[9-11]，选择接种量（A）、发酵时间（B）、低聚果糖添加量（C）为影响因素，以感官评分（Y）作为响应值，利用Design-Expert8.0.6软件对试验数据进行处理，从而确定最优的炭烧慈梨酸奶发酵工艺，试验因素与水平见表1。
表1 炭烧慈梨酸奶发酵条件优化Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for charcoal Cipear yogurt fermentation conditions optimization
水平A接种量/% B发酵时间/h C低聚果糖添加量/%123 123 678 0.8 1.0 1.2
1.3.5 炭烧慈梨饮用型酸奶的评测方法[12]
（1）感官评测：随机选定10名（男女各半）有经验的品评员组成的感官评分小组，根据产品香味、组织状态、滋味和口感4项指标对炭烧慈梨酸奶进行感官评价，采用加权平均法对产品的感官品质进行综合评定，感官评分满分为100分，各项指标所占分值及评定标准如表2所示。
表2 炭烧慈梨酸奶感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of charcoal Cipear yogurt
项目 评分标准 分值/分香味（20分）组织状态（30分）滋味（30分）口感（20分）有明显的发酵酸奶的香味，慈梨的香甜味，无异味奶香突出，慈梨的香甜味较淡，无异味奶香突出，慈梨的香甜味不足，异味较大有明显异味凝乳均匀、黏稠度好、无沉淀和分层、褐色适中凝乳均匀、黏稠度好、略有沉淀和分层、褐色适中凝乳不均匀（过稠或过稀）、有明显的沉淀和分层、颜色偏深或偏浅状态极为不稳定、沉淀和分层严重、颜色过深或过浅具有酸奶特有的味道、酸甜适口、有慈梨独特风味酸味或甜味稍重、有慈梨独特风味酸味过重或甜味过重、慈梨风味过淡口味差、难以接受口感细腻爽滑、有酸奶黏稠感、无粗糙感口感较为细腻、有酸奶黏稠感、略有粗糙感口感粗糙、奶质过稀或过黏、粗糙感明显口感差、难以接受15～20 10～15 5～10 0～5 25～30 20～25 15～20 0～15 25～30 20～25 15～20 0～15 15～20 10～15 5～10 0～5
（2）指标测定
色差分析：采用色差计定量测定颜色的变化。用标准白板对色差计进行校准后，在比色皿内取适量的褐变后的原料乳，在同样的光源下测量样品的L*值、a*值、b*值，每个样品测定3次，取平均值。其中L*值为亮度、a*值为红/绿、b*值为黄/蓝，最后计算色差ΔE*值[13]。酸度：根据GB 5009.239—2016《食品中酸度的测定》中的酚酞指示剂法[14]；蛋白质含量：根据GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法[15]；脂肪含量：根据GB5009.6—2016《食品中脂肪的测定》中的盖勃氏法[16]；黏度：采用黏度计测定；微生物：根据GB 4789.18—2016《食品微生物学检验》[17]。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 慈梨浓缩汁添加量对炭烧慈梨酸奶感官评分及酸度的影响
图1 慈梨浓缩汁添加量对炭烧慈梨酸奶感官品质及酸度的影响
Fig.1 Effect of Cipear concentrate juice addition on sensory quality and acidity of charcoal Cipear yogurt
由图1可知，慈梨浓缩汁添加量＜6.5%之前，酸奶的颜色变化不明显，原因是慈梨浓缩汁添加量较低时，其还原糖含量较低，美拉德反应不明显[18]。当慈梨浓缩汁添加量＞6.5%之后，随着慈梨浓缩汁添加量增加，感官评分降低。原因是随着慈梨浓缩汁添加量的增加，褐变颜色不断加深，且酸奶组织状态不稳定，由于蛋白质在等电点附近时，分子之间缺乏静电排斥力，不利于形成稳定的乳状液[19-20]。因而确定慈梨浓缩汁的添加量为6.5%，此时得到的酸奶褐变颜色适中，组织状态均匀稳定，且有浓郁的慈梨风味，感官评分为92.1分。
2.1.2 褐变时间对炭烧慈梨酸奶感官评分及色差的影响
不同复原脱脂乳褐变时间对炭烧慈梨酸奶感官评分和酸奶色度的影响结果见表3。由表3可知，随着褐变时间的增加，原料乳的L*值逐渐降低，原料乳的颜色逐渐加深；a*值逐渐上升，红色越来越明显；b*值到105 min时基本保持不变，表明随着褐变时间的增加，黄蓝值变化不大。总色差在褐变90 min后有较明显的变化，色泽变化可以由肉眼直接观察到，每15 min后测一次色差，得知在120 min时色差较大，其余每15 min测得的奶液没有明显的颜色变化。感官评分随着褐变时间的增加，呈现先升高后降低的趋势，在褐变时间为120 min时，感官评分最高，为92.13分。因此，最佳褐变时间为120 min。
表3 褐变时间对炭烧慈梨酸奶颜色及感官品质的影响
Table 3 Effect of browning time on color and sensory quality of charcoal Cipear yogurt
时间/min L*值 a*值 b*值 感官评分/分 色差△E*褐变前90 105 120 135 150 68.85 67.79 66.40 64.74 63.90 63.74 3.48 2.47 2.68 2.91 2.84 3.04 10.90 11.71 12.37 12.16 12.37 12.39 85.52 87.13 87.50 92.13 89.32 84.90 6.59 2.01 0.32 1.61 0.10 0.38
2.1.3 接种量对炭烧慈梨酸奶感官评分及酸度的影响
图2 接种量对炭烧慈梨酸奶感官评分及酸度的影响
Fig.2 Effect of inoculum on sensory evaluation and acidity of charcoal Cipear yogurt
由图2可知，当接种量为3%时，感官评分最高，为88.2分。当接种量＜3%之前，由于酸奶中菌种的数量少，一定的发酵时间内产酸不足，导致酸奶凝乳不均匀，口感较差。当接种量＞3%之后，随着接种量不断增加，酸奶中活菌数不断增加，产酸增多，凝乳状态逐渐变好。但当接种量过高时，产酸过多，导致酸奶中微小蛋白质亚胶分子团稳定状态被改变，不易形成稳定的乳状液[19]。因此，最佳接种量为3%，此时酸奶的凝乳状态较好、口感细腻，且酸甜适中。
2.1.4 发酵时间对炭烧慈梨酸奶感官评分及酸度的影响
图3 发酵时间对炭烧慈梨酸奶感官评分及酸度的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on sensory evaluation and acidity of charcoal Cipear yogurt
由图3可知，当发酵时间为7.0 h，酸奶的感官评分最高，为88.7分，此时，炭烧慈梨饮用型酸奶凝乳均匀，且酸奶质地细腻，口感较好。发酵时间＜7.0 h之前，发酵的酸奶由于发酵时间短，菌种产酸不足，导致酸奶较稀，凝乳不好。随着发酵时间的延长，酸奶的酸度升高，酸奶中原有的聚集体发生改变，最终形成以酪蛋白胶粒为基础的凝胶状态[20]。发酵时间＞7.0 h之后，发酵酸奶由于发酵时间过长，产酸过多，导致酸奶的组织状态不好，并且出现了凝块的现象。因此，确定酸奶的发酵时间为7.0 h。
2.1.5 低聚果糖添加量对炭烧慈梨酸奶感官评分及酸度的影响
图4 低聚果糖添加量对炭烧慈梨酸奶感官评分及酸度的影响
Fig.4 Effect of fructo-oligosaccharide addition on sensory evaluation and acidity of charcoal Cipear yogurt
由图4可知，当低聚果糖添加量为1.2%时，酸奶的感官评分最高，为88.3分。此时，酸奶的凝结度适中，甜度适宜，且口感顺滑适口。当低聚果糖的添加量＜1.2%之前，酸奶的凝结度较低，且甜度较低。当低聚果糖的添加量＞1.2%之后，酸奶过于黏稠，且甜度过高。因此，最佳低聚果糖添加量为1.2%。
2.2 响应面试验结果及分析
在单因素试验的基础上，以接种量（A）、发酵时间（B）、低聚果糖添加量（C）为影响因素，以感官评分（Y）作为响应值，利用Design-Expert8.0.6软件对试验数据进行处理，从而确定炭烧慈梨酸奶的最优工艺。试验设计及结果见表4，方差分析见表5。
表4 炭烧慈梨酸奶发酵条件优化Box-Behnken试验设计及结果
Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments for charcoal Cipear yogurt fermentation conditions optimization
试验号 A接种量/%B发酵时间/h C低聚果糖添加量/%Y感官评分/分1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 2 1 1 2 3 1 3 2 2 2 1 2 2 3 3 2 2 6 6 7 7 8 7 6 7 7 7 8 6 8 7 7 7 8 1.2 1.0 0.8 1.0 1.0 1.2 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.8 1.2 0.8 1.2 1.0 0.8 71.70 74.57 73.61 90.84 78.75 72.34 77.65 89.65 89.22 88.73 87.82 85.65 82.47 75.45 69.56 91.34 80.50
表5 回归模型方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01），“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型ABCA B*********AC BC A 2 B2 C 2残差失拟项纯误差总和890.90 173.61 85.97 17.51 36.91 5.34 63.36 326.01 8.97 298.28 20.45 15.62 4.84 911.36 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 1 6 98.99 173.61 85.97 17.57 36.91 5.34 63.36 326.01 8.97 298.28 2.92 5.21 1.21 33.88 59.41 29.42 6.01 12.63 1.83 21.68 111.57 3.07 102.08＜0.000 1 0.000 1 0.001 0 0.044 0 0.009 3 0.218 6 0.002 3＜0.000 1 0.123 3＜0.000 1******4.31 0.096 1
利用Design Expert8.06软件对表4结果进行回归方程拟合，得到炭烧慈梨酸奶的响应面回归方程：Y=88.19+7.93A+4.02B-1.82C-3.04AB-1.15AC+3.98BC-8.80A2-1.46B2-8.42C2。
由表5可知，当模型F=33.88时，P＜0.000 1，说明该模型是极显著的，当失拟项F=4.31时，P=0.096 1＞0.05，说明模型的失拟项不显著。决定系数R2=0.977 6，校正决定系数R2Adj=0.948 7，表示感官评分的实际值和预测值之间有较好的拟合度，因而证明该模型能够很好的对炭烧慈梨酸奶工艺进行分析和预测。该模型中的一次项A、B，交互项AB、BC与二次项A 2、C 2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项C对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。影响炭烧慈梨酸奶品质的主次顺序为接种量＞发酵时间＞低聚果糖添加量。
利用Design-Expert软件对回归方程进行运算，分别做出两个交互项之间的响应面及等高线，结果见图5。由图5可知，接种量和发酵时间交互作用对感官评分的影响显著；低聚果糖添加量和接种量交互作用对感官评分的影响不显著；发酵时间和低聚果糖添加量对感官评分的影响显著，发酵时间为6～7.21 h时，随着发酵时间的延长，感官评分快速增长，但当发酵时间过长时，菌种产酸过多导致酸奶黏度增大，进而影响炭烧慈梨酸奶的口感和质地，低聚果糖添加量为0.80%～0.98%时，随着添加量的增加，感官评分迅速增加，但当低聚果糖添加量过多时，酸奶过于黏稠，炭烧慈梨酸奶感官评分降低。
通过Design-Expert软件对已建立的回归方程进行优化分析，可得到最佳发酵工艺条件为接种量3%、发酵时间7.21 h、低聚果糖添加量0.98%。在此条件下，炭烧慈梨酸奶的感官评分预测值为88.0分。为了便于实际操作，将工艺条件修正为接种量为3%、发酵时间7.5 h、低聚果糖添加量为1%。在此最优发酵工艺条件下进行3次平行试验，感官评分实际值为91.8分，与模型预测值（88.0分）较一致，说明该模型可行。
图5 各因素交互作用对炭烧慈梨酸奶感官品质影响的响应面和等高线
Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on sensory quality of charcoal Cipear yogurt
2.3 炭烧慈梨酸奶质量评价
2.3.1 感官指标
炭烧慈梨酸奶组织状态良好，具备特有焦糖香气和慈梨风味、酸甜适宜、黏稠度适当，具有较好的口感，感官评分的平均值为91.8分。
2.3.2 理化指标
炭烧慈梨酸奶色差为2.19，酸度为84°T，蛋白质含量为2.6%，黏度为1 822.67 mPa·s，理化指标均符合国家相关标准。
2.3.3 微生物指标
大肠杆菌含量＜5 MPN/100 mL，活菌数＞107 CFU/mL，致病菌未检出，微生物指标均符合国家相关标准。
3 结论
以脱脂奶粉、浓缩梨汁为主要原材料，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌（1∶1）为发酵剂，添加低聚果糖增强其保健功能和口感。以感官评价和色差分析作为评价标准，通过单因素试验和响应面法确定炭烧慈梨饮用型酸奶的工艺。最后，确定了炭烧慈梨饮用型酸奶的最佳工艺条件：褐变条件98℃、120 min，接种量3%，浓缩梨汁的添加量6.5%，发酵时间7.5 h、低聚果糖添加量1%。在此优化发酵工艺条件下，炭烧慈梨饮用型酸奶颜色适中，质地均匀细腻，无乳清析出，具备特有焦糖香气和慈梨风味。
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