维生素B12（vitamin B12，VB12）又称为钴胺素（cobalamin），是一类含钴的咕啉类化合物的总称，羟基钴胺素（hydroxycobalamin）、氰钴胺素（cyanocobalamin）、脱氧腺苷钴胺素（deoxyadenosylcobalamin）和甲基钴胺素（methylcobalamin）是维生素B12主要存在形式[1]。
天然维生素B12存在于动物产品中，包括鱼、肉、鸡蛋和牛奶等，一般由微生物代谢合成，植物和高等动物无法合成维生素B12[2]。2016年对上海地区素食人群膳食营养摄入调查发现，素食者维生素B12的每日摄入量远低于中国居民膳食维生素B12适宜摄入量[3]。许多学者开始关注到缺乏维生素B12对人体的影响，研究表明，维生素B12对糖尿病视网膜神经细胞有一定的保护作用；母亲的维生素B12缺乏或者摄入不足，可能会因为乳汁中维生素B12含量低导致婴儿的维生素B12缺乏[4]，人体血清中维生素B12浓度还与帕金森病患者周围神经损害程度呈负相关性[5]。
朴相哲等[6]对韩国某地区百岁老人长寿原因进行分析发现，血清中稳定的维生素B12含量是长寿的一个重要因素。通过对当地老人饮食的调查发现，韩国传统发酵产品及泡菜和某些种类的海藻中发现大量维生素B12，这些食物的摄入对以蔬菜为主的营养不均衡的膳食结构起到互补作用，从而提高韩国人寿命。
越来越多的天然发酵食品被报道含有丰富的维生素B12，如韩国泡菜（kimchi）、大豆发酵食品[7]、丹贝（Tempe）[8-9]等。虽然王绪卿等[10-11]在1981年建立维生素B12生物自显谱面积定量法，用于测定豆类发酵食品中维生素B12含量。但中国食物维生素B12含量的数据依旧匮乏，国内几个广泛使用的营养计算软件中均不包含维生素B12项目。为弥补这个空白，顾娅楠等[12]收集国内外现有维生素B12食物数据库，整理分析成中国常见食物的维生素B12数据表。
目前，能够用于测定维生素B12的方法有很多，如仪器法[12-13]、酶联免疫法[14]、化学发光分析法[15-16]、微生物法[17-18]等。由于发酵食品基质成分复杂，发酵产物干扰较大，一般仪器法难以满足定量要求，微生物法是经典的维生素测定方法，可灵敏地检测出基质中存在可被微生物吸收具有生物学活性的维生素B12，这是微生物法区别于其他方法的最大特点。
发酵食品由于微生物的发酵作用使得除了食品本身的营养外，具备了由微生物发酵过程中代谢所积累的益生物质，而食品中的维生素B12也主要由微生物代谢产生。本研究以维生素B12为指标，采用微生物法进行检测，对市场上常见的发酵食品进行含量测定，了解发酵食品中维生素B12的潜在价值。同时为完善食品膳食成分表提供食品中维生素B12含量的基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
本实验样品采购于当地集贸市场和超市，详见表1。
表1 市售大豆发酵食品样品
Table 1 Commercially available samples of fermented soybean foods
注：相同数字表示来源同一个厂家。
类型 编号 品名 类型 编号 品名 类型 编号 品名红腐乳奶酪H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6 H-7 H-8 H-9 NL-1 NL-2 NL-3 NL-4 NL-5 NL-10 NL-11红方腐乳1玫瑰腐乳2小红乳玫瑰豆腐乳玫瑰腐乳麻油红方豆腐乳红腐乳4大块腐乳腐乳彭勒维克干酪图尼小布里干酪昂贝尔蓝纹圆柱干酪（蓝纹奶酪）拉芳丹王子布里奶酪安达奶酪蓝纹高达芝士（蓝纹奶酪）高根佐拉奶酪（蓝纹奶酪）白腐乳纳豆酱豆汁B-1 B-2 B-3 B-4 B-5 B-6 B-7 B-8 B-9 ND-1 ND-2 DJ-1 DJ-2 DZ白方腐乳1淡口白腐乳2香辣腐乳台湾豆腐乳豆腐乳3糟方豆腐乳白腐乳腐乳（微辣）豆腐乳西尾纳豆九州物语纳豆清净园大酱清净园顺昌大酱豆汁（熟）臭腐乳C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 C-8 C-9臭腐乳1精品臭豆腐2青方豆腐乳3臭豆腐乳4臭腐乳青方腐乳精品青方腐乳臭豆腐乳臭豆腐
1.1.2 菌株
莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830：中国工业微生物菌种保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）。
1.1.3 试剂
维生素B12标准品（纯度≥99%）：美国Sigma-Aldrich公司；无水磷酸氢二钠、无水偏重亚硫酸钠、柠檬酸（含一个结晶水）（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.1.4 培养基
乳酸杆菌琼脂培养基、乳酸杆菌肉汤培养基、维生素B12测定用培养基：美国BD公司。
1.2 仪器与设备
GI6-2型电热恒温培养箱：美国SHELLAB公司；MS204S电子天平、Seven Easy酸度计：美国METTLER TOLEDO公司；Infinite M200全波长多功能微孔板分析系统：瑞士Tecan公司；Milli-Q超纯水机：德国Merck公司；GZ99/JP-C100B型超声波振荡器：北京中西远大科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理
样品处理参考GB5413.14—2010《婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》[19]并稍做修改，固体粉碎均质后称取一定质量的样品，加入10 mL维生素B12前处理液（维生素B12前处理液：称取无水磷酸氢二钠1.3 g，无水偏重亚硫酸钠1.0 g，柠檬酸1.2 g，用100 mL水溶解）混合后再加150 mL水，经超声波振荡器处理30 min后于121℃水解10 min，冷却后调pH值至4.5±0.2，再用水定容至250 mL，过滤。移取滤液5 mL，加入水20～30 mL，调pH值至6.8±0.2，用水定容至100 mL，作为试样溶液。
1.3.2 接种菌悬液的制备
将保存的莱士曼氏乳酸杆菌转接到乳酸杆菌琼脂培养基中，在36℃培养18～24 h，再将其接种于乳酸杆菌肉汤培养基中，36℃培养24 h。将乳酸杆菌肉汤培养液4 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入10 mL生理盐水，混匀，再4 000 r/min离心5 min，弃去上清液，重复清洗3次。最后加10 mL生理盐水，混匀，制成菌悬液。以生理盐水作空白，于波长550 nm处测定菌悬液的透光率，调节菌悬液的透光率为60%～80%用于维生素B12含量的测定。
1.3.3 维生素B12标准溶液的制备
维生素B12标准贮备液的制备：精确称取1 mg维生素B12标准品，用体积分数25%的乙醇溶液溶解，稀释并定容至维生素B12质量浓度为100 ng/mL。从中吸取5 mL，用体积分数25%的乙醇定容至维生素B12质量浓度为1 ng/mL，再分别吸取5 mL用水定容至250 mL和500 mL容量瓶中，作为高浓度标准溶液（0.02 ng/mL）和低浓度标准溶液（0.01 ng/mL）。
按表2顺序加入水、标准曲线工作液和维生素B12测定用培养基于培养管中，平行配制3份。
表2 标准溶液的配制
Table 2 Preparation of standard solution mL
注：S3～S7号试管加入低浓度标准溶液，S8～S10号试管加入高浓度标准溶液。
试管号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10水0.01 ng/mL标准曲线工作液0.02 ng/mL标准曲线工作液培养基5 0 0 5 5 0 0 5 4 1 0 5 3 2 0 5 2 3 0 5 1 4 0 5 0 5 0 5 2 0 3 5 1 0 4 5 0 0 5 5
1.3.4 样品待测液的制备
按表3顺序加水、样品溶液和维生素B12测定用培养基于培养管内，平行配制3份。每份样品需带样品空白试管一支，管内分别加入5 mL待测液和5 mL维生素B12测定用培养基。
表3 样品待测液的配制
Table 3 Preparation of sample solution
mL
试管号 1 2 3 4 样品空白水样品溶液培养基4 1 5 3 2 5 2 3 5 1 4 5 0 5 5
1.3.5 接种培养
将标准曲线培养管和样品管于121℃灭菌5 min，取出后将试管迅速冷却。接种菌悬液50μL至上述各试管中，其中标准曲线1号管和样品空白管除外。将试管放入培养箱，36℃培养19～20 h。
1.3.6 结果测定和计算
以标准曲线培养管2号为空白，在波长550 nm处测定各试管吸光度值（A）。以维生素B12标准品质量浓度（x）为横坐标，吸光度值A（y）为纵坐标绘制标准曲线。
根据VB12标准曲线计算样品中维生素B12含量，其计算公式如下：
式中：X为试样中维生素B12的含量，μg/100 g；C x为试样管中每毫升测定液中维生素B12含量的平均值，ng；m为试样的质量，g；f为稀释倍数。
2 结果与分析
2.1 维生素B12标准曲线
以维生素B12含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制VB12标准曲线，结果见图1。由图1可知，维生素B12含量为0.001～0.010 ng/mL时，回归方程为y=3.884x+0.045，R2=0.995，线性关系良好，达到检测要求。
图1 维生素B12标准曲线
Fig.1 Standard curve of vitamin B12
2.2 市售发酵食品中维生素B12含量的检测分析
本研究共采集了样品种类及数量分别是发酵豆制品（3种类型腐乳27批次[20]、纳豆2批次、韩国大酱2批次、豆汁（熟）1批次）和发酵乳制品（奶酪7批次），利用本研究建立的微生物法对样品中维生素B12的含量进行了测定，结果见表4。
由表4可知，不同厂家生产的同一类型腐乳维生素B12含量不同：红腐乳各批次间维生素B12含量为0.26～0.79μg/100 g，变异系数（coefficient of variance，CV）为42.7%，白腐乳各批次间维生素B12含量为0.18～0.66μg/100 g，CV为40.4%，臭腐乳各批次间维生素B12含量为2.41～5.35μg/100 g，CV为30.2%。说明各个独立腐乳样品之间维生素B12的含量差别很大，同一类型腐乳维生素B12含量最大值是最小值的3.6倍（白腐乳）、3倍（红腐乳）和2.2倍（臭腐乳）。
同时发现虽然同为腐乳但不同类型腐乳维生素B12含量差别较大：臭腐乳9个批次间平均维生素B12含量为（3.57±1.08）μg/100 g，红腐乳和白腐乳中分别为（0.48±0.21）μg/100g和（0.41±0.16）μg/100 g，虽然不同厂家产品维生素B12的含量有较大的差异性，但是臭腐乳这一类型产品维生素B12含量显著高于红腐乳和白腐乳（P＜0.01）。同一个生产企业不同腐乳类型维生素B12具有显著差异：如样品H-1、B-1、C-1和H-2、B-2、C-2分别来源于浙江省和北京市某生产厂家，但是臭腐乳（C-1、C-2）显示出更高含量的维生素B12，推测臭腐乳中高含量的维生素B12可能是有别于红腐乳和白腐乳的生产工艺所引起的。
表4 腐乳样品维生素B12的含量
Table 4 Contents of vitamin B12 in sufu sample
注：“**”表示差异极显著（P＜0.01）。
类别 样品编号含量/（μg·100 g-1）类别样品编号含量/（μg·100 g-1）类别样品编号含量/（μg·100 g-1）红腐乳H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 0.48±0.21 42.7 0.67 0.36 0.42 0.38 0.41 0.79 0.76 0.26 0.27白腐乳B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 0.41±0.16 40.4 0.49 0.28 0.39 0.55 0.26 0.66 0.30 0.18 0.54臭腐乳C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 3.57±1.08**30.2 2.55 2.80 3.87 2.90 2.41 3.08 4.15 5.35 4.99平均CV/%
除腐乳外其他发酵豆制品及奶酪样品的维生素B12含量见表5。由表5可知，纳豆（ND-1：0.50μg/100 g，ND-2：0.20μg/100 g）、韩国大酱（DJ-1：0.97μg/100 g，DJ-2：0.10μg/100 g）和豆汁（熟）（0.52μg/100 g）的维生素B12含量均低于臭腐乳，说明同为大豆发酵食品，使用不同的发酵菌种、发酵过程对于维生素B12含量有着显著性差异。奶酪样品NL-1和NL-10的维生素B12含量分别为1.24μg/100 g和1.54μg/100 g，相比较其他发酵产品的维生素B12含量高，但其总体维生素B12的分布及含量也均低于臭腐乳。
表5 其他发酵食品维生素B12的含量
Table 5 Contents of vitamin B12 in other fermented foods
类别 样品编号（μg·100 g-1）类别样品编号含量/含量/（μg·100 g-1）NL-1 NL-2 NL-3 NL-4 NL-5 NL-10 NL-11 1.24 0.83 1.04 0.83 0.86 1.54 0.82纳豆奶酪 韩国大酱豆汁ND-1 ND-2 DJ-1 DJ-2 DZ 0.50 0.20 0.97 0.10 0.52
3 结论
本研究建立的微生物法可用于食品中维生素B12含量的测定。以腐乳、纳豆、韩国大酱、豆汁以及奶酪为研究对象，利用微生物法对其维生素B12含量进行了测定。发现臭腐乳所含维生素B12的含量显著高于白腐乳和红腐乳。其他发酵豆制品维生素B12的含量均低于臭腐乳。通过本研究明确了发酵食品维生素B12的含量及分布，为完善食品膳食成分表提供基础数据。
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