黑豆为豆科植物大豆的干燥种子，味甘性平，含有不饱和脂肪酸、蛋白质、碳水化合物、纤维素、花青素、硒、磷、铁多种微量元素和营养成分[1]。此外，黑豆还含有多种具有生理功效的物质，如黑豆红色素、多糖和皂苷等。其中花青素是黑豆色素的重要成分，具有较强的抗氧化能力，对机体代谢过程中产生多余的自由基，并且对增加血管弹性、延缓机体衰老等都有一定的作用[2-3]。黑豆比黄豆有更高的医药价值和开发前景，花青素属于类黄酮类的化合物，黑豆皮色素含量高，是一种天然、安全、健康的食用色素。
目前，采用浸提法提取花青素的应用较多，但此法溶剂用量大，耗时长，且花青素得率较低[4]。超声提取法在中草药提取中应用较多，利用超声波的空化效应和机械效应，破坏植物组织细胞[5-7]，加强成分的溶出和扩散，将植物中的化学成分快速提取，提高产物的得率，具有操作简单方便，耗时短，不破坏有效成分、提取液杂质少等特点。离子液体（ionic liquid）是在室温条件下完全由离子组成的液体物质[8-12]。离子液体能够吸收超声波，可用于超声辅助提取的天然产物的溶剂，具有理化性质稳定、不易燃烧、提取过程萃取能力好、可重复利用，在黏度、极性、密度、蒸气压等方面具有和传统溶剂不同的特殊性质[13-16]，同时可以通过超声或升高温度等方法提高有效成分的得率，保持其高溶解性和萃取能力[17-18]。本文以黑豆皮为原材料提取花青素，通过响应面法得出最佳的提取工艺，同时研究花青素的抗氧化活性，为深入研究其应用价值提供了依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
青仁黑豆：黑龙江省市售。
原花青素标准品：中国药品生物制品检定所；1-己基-3-甲基咪唑溴盐（纯度99%）：阿尔法试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
VGT-2013QT超声波清洗器：广州固特超声仪器有限公司；XV-9200紫外分光光度计：北京市精密仪器厂；DFYX500高速万能粉碎机：北京科伟永兴仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 黑豆皮花青素的提取
黑豆轻微粉碎→人工剥离豆皮→豆皮粉碎→60℃烘干至质量恒定→过60目筛→称质量→超声波提取→提取液离心（离心30 min，转速3 500 r/min）→花青素
提取剂为体积分数70%乙醇稀释的1-己基-3-甲基咪唑溴盐，超声功率300 W，温度40℃，提取时间40 min，料液比1∶35（g∶mL）。
1.3.2 花青素得率计算
移取1.0 mL提取液，置于25 mL容量瓶中，定容，在波长530 nm处测定吸光度值，采用香草醛-盐酸法测定黑豆皮花青素的质量浓度，计算花青素得率，其计算公式如下：
式中：Y为花青素得率，mg/g；C为花青素质量浓度，mg/mL；V为定容体积，mL；n为稀释倍数；M为黑豆皮质量，g。
1.3.3 黑豆皮花青素提取工艺优化单因素试验
准确称取黑豆皮1.0 g，采用离子液体-超声辅助法提取黑豆花青素，考察离子液体1-己基-3-甲基咪唑溴盐浓度（0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L、1.2 mol/L、1.4 mol/L）、提取时间（15 min、25 min、35 min、45 min、55 min、65 min）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70）、提取温度（20 ℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）对黑豆皮花青素得率的影响，以黑豆皮花青素得率为指标，以确定响应面设计的水平。
1.3.4 黑豆皮花青素提取工艺优化响应面试验设计
根据单因素试验，选取离子液体浓度（A）、提取时间（B）、液料比（C）、提取温度（D）为考察因素，黑豆皮花青素得率（Y）为响应值，根据Box-Behnken Design中心组合设计原理，优化黑豆皮花青素提取工艺，因素与水平见表1。
表1 黑豆皮花青素提取条件优化响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology for extraction conditions optimization of anthocyanin from black soybean peel
因素-1 0 1 A离子液体浓度/（mol·L-1）B提取时间/min C 料液比（g∶mL）D提取温度/℃0.6 35 1∶40 40 0.8 45 1∶50 50 1.0 55 1∶60 60
1.3.5 黑豆皮花青素抗氧化能力的测定
采用水杨酸法测定黑豆皮花青素对羟自由基清除能力，在比色管中依次先加入9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L乙醇-水杨酸以及适量去离子水，最后加入8.8 mmol/L H2O2后摇匀，37℃水浴加热15 min后取出，测其吸光度值A 0。测定时，参比溶液为不加双氧水的体系。按照式（1）计算OH·的清除率。以维生素C（vitamin C，VC）为阳性对照。
式中：A 0为空白对照的吸光度值；A a为分别加入花青素、VC的吸光度值；A b为不加H2O2的吸光度值。
分别量取0.05mg/mL、0.10 mg/mL、0.15mg/mL、0.20mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL的黑豆皮花青素提取液和0.1 mol/mL DPPH·溶液各2 mL，置于10 mL比色管中混合，加入体积分数60%乙醇定容，避光室温条件放置30 min，波长517 nm处测其吸光度值。以无水乙醇溶液代替样品溶液作对照，按照式（2）计算DPPH·清除率。VC对DPPH·清除率的测定同上述操作。
式中：A m为对照品的吸光度值；A n为样品的吸光度值。
2 结果与分析
2.1 黑豆皮花青素提取工艺优化单因素试验结果分析
2.1.1 离子液体浓度对花青素得率的影响
由图1可知，随离子液体1-己基-3-甲基咪唑溴盐浓度的增加，花青素的得率逐渐变大，当1-己基-3-甲基咪唑溴盐浓度为0.8 mol/L时，花青素得率达到最大值，但随着离子液体浓度继续增大，得率逐渐下降。原因可能是与提取溶剂的黏度相关，离子液体的浓度过高，提取液黏度也会增大，提取剂的扩散能力变差，难以渗到黑豆细胞的内部，使得离子液体对黑豆花青素的溶出能力降低。因此，最佳离子液体浓度为0.8 mol/L。
图1 离子液体浓度对花青素得率的影响
Fig.1 Effect of ionic liquids concentration on anthocyanin yield
2.1.2 提取时间对花青素得率的影响
由图2可知，随提取时间的不断延长，花青素得率呈现增长趋势，提取时间为45 min时，得率达到最大值，但时间＞45 min之后，得率开始降低。随着超声时间继续延长，通过超声波空化作用和机械震动的持续作用，黑豆皮花青素向溶剂中逐渐溶出，得率逐渐升高；但是提取时间过长导致细胞组织中大量细胞破裂，增加了其他杂质的溶出；同时，提取时间过长会破坏花青素的结构，从而使得率下降。因此，最佳提取时间选择45 min。
图2 提取时间对花青素得率的影响
Fig.2 Effect of extraction time on anthocyanin yield
2.1.3 料液比对花青素得率的影响
由图3可知，随着料液比的减小，花青素得率逐渐增大，料液比为1∶50（g∶mL）时，花青素得率达到最大值，但料液比＜1∶50（g∶mL）之前，花青素的得率开始下降。原因可能是黑豆皮的质量一定，提取剂的料液比过大，离子液体有一定的黏度，不利于花青素在溶剂中扩散；随着料液比的减小，原料在溶液中与提取液的接触面积增大，有利于花青素的溶出；但大量溶剂会吸收一定的超声波，降低了超声波对细胞的破碎能力，导致细胞内花青素溶出减少；还可能是1-己基-3-甲基咪唑溴盐与花青素分子上的羟基之间存在氢键作用，随着料液比的不断减小，氢键作用逐渐增强，导致花青素的得率降低。因此，最佳料液比选择1∶50（g∶mL）。
图3 料液比对花青素得率的影响
Fig.3 Effect of material-liquid ratio on anthocyanin yield
2.1.4 提取温度对花青素得率的影响
由图4可知，随着提取温度的升高，花青素得率逐渐增大，当提取温度为50℃时，得率最大，但温度继续升高，花青素得率出现不断降低的趋势。原因可能是随着体系的温度升高，离子液体的运动速率和频率也不断变大，使其更容易渗透到黑豆皮组织细胞中，加速花青素的溶出，从而增加花青素的得率。但继续升高体系的温度，过高的温度会使花青素结构上的酚羟基发生氧化，导致其结构被破坏；也可能因为随着温度升高，细胞中其他内容物溶出增多，导致溶液黏度增大，影响花青素向外溶出，从而使得率下降。所以，最佳提取温度为50℃。
图4 提取温度对花青素得率的影响
Fig.4 Effect of extraction temperature on anthocyanin yield
2.2 黑豆皮花青素提取工艺优化响应面结果与分析
2.2.1 响应面试验设计及结果
表2 黑豆皮花青素提取条件优化响应面试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of response surface methodology for extraction conditions optimization of anthocyanin from black soybean peel
试验号A B C D Y花青素得率/（mg·g-1）1234567891 0 00-0 100-000-0100-11--1 1-1 1-1 11-001-11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 100110-1 100110001-10-100000000-1-1-1 1-1 000-10100-100000010 111-1-1 0-1 1100-00000 1000000010011-10000 110-10010 4.182 3.841 3.726 3.786 3.993 3.567 3.763 3.639 3.897 3.727 4.261 3.918 3.729 3.779 3.866 3.568 3.562 3.763 3.868 4.005 3.507 3.854 3.940 4.003 3.813 4.236 4.128 3.678 4.221
2.2.2 响应面试验的建立与分析
表3 响应面试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of response surface methodology results
注：P＞0.05为对结果影响不显著；P＜0.05为对结果影响显著；P＜0.01为对结果影响极显著。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值模型14 ABCDA B AC AD BC BD CD A2 B2 C 2 D2 88.57 84.4 18.26 77.49 3.66 2.41 0.03 2.88 1.61 2.17 1.65 892.88 186.16 71.35 213.31＜0.000 1＜0.000 1 0.000 8＜0.000 1 0.076 5 0.142 7 0.864 1 0.112 0 0.225 5 0.162 6 0.220 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1残差失拟项纯误差总变异1.230 0.084 0.018 0.077 3.64×10-3 2.401×10-3 3.025×10-5 2.862×10-3 1.600×10-3 2.162×10-3 1.640×10-3 0.890 0.190 0.071 0.250 0.014 3.124×10-3 0.011 1.250 111111111111111 4 10 4 28 0.088 0.084 0.018 0.077 3.640×10-3 2.401×10-3 3.025×10-5 2.862×10-3 1.600×10-3 2.162×10-3 1.640×10-3 0.890 0.190 0.071 0.250 9.952×10-4 3.124×10-4 2.702×10-3 0.15 0.997 2
采用Design-Expert8.0.6软件对表2数据分析，得到二次回归拟合方程Y=4.21+0.084A+0.039B+0.080C-0.017D-0.025AB+2.750E-003AC-0.027AD-0.020BC+0.023BD-0.020CD-0.37A2-0.17B2-0.10C2-0.20D2。对回归方程进行方差分析，结果见表3。
由表3可知，P＜0.000 1，说明数据模型方程达到极显著水平；失拟值P=0.997 2＞0.05，无显著差异，说明回归方程与试验拟合良好，误差小。回归方程各项方差分析表明，回归模型一次项A、B、C对模型影响极显著（P＜0.01），二次项A 2、B2、C 2和D2对模型影响极显著（P＜0.01），其余各项对黑豆皮花青素得率影响均不显著（P＞0.05）。因此，可用此模型对黑豆皮花青素提取工艺进行分析及预测。
2.2.3 响应面分析
响应曲面图可以显著反映各因素之间相互作用的强弱，采用Box-Behnken软件对响应曲面图进行分析，可以得到各因素交互作用对响应值的影响，结果如图5所示。
如果响应曲面较陡峭，说明该因素对花青素得率的影响较大，响应值对于提取条件的改变就越敏感；如果响应曲面相对平缓，说明该因素的波动对响应值的影响较小。由图5可知，离子液体浓度与提取温度之间交互作用的响应曲面最陡峭，对响应值影响最显著；离子液体浓度与提取时间之间交互作用的响应曲面相对陡峭，说明对响应值影响显著程度次之；提取时间与提取温度、料液比与提取温度、提取时间与料液比、离子液体浓度与料液比的交互作用对得率的影响显著程度逐渐减小，表现为曲线较为平滑，响应值无显著性变化。可知，影响黑豆皮花青素得率的各交互作用因素顺序为AD＞AB＞BD＞CD＞BC＞AC。
图5 各因素交互作用对花青素得率影响的响应面和等高线
Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factor on anthocyanin yield
2.2.4 验证试验
结合单因素试验，分析回归模型，经过验证，最终得出黑豆皮花青素的最佳提取条件：离子液体浓度0.93 mol/L，提取时间45.39 min，料液比1∶53.97，提取温度43.96 ℃，花青素得率的理论预计值为4.13 mg/g。结合试验实际情况，最终选择离子液体浓度0.9 mol/L，提取时间45 min，料液比1∶53（g∶mL），提取温度43℃，进行5次平行试验，得到花青素得率平均值为4.12 mg/g，与预测值接近，验证了此模型的有效性，说明预测模型与实际情况拟合较好。
2.3 黑豆皮花青素的抗氧化活性分析
2.3.1 黑豆皮花青素对DPPH自由基的清除能力
VC和黑豆皮花青素对DPPH·的清除能力结果见图6。由图6可知，在一定范围内，随着质量浓度的增加黑豆皮花青素和VC对DPPH·清除率均逐渐增强，说明二者对DPPH·的清除能力均存在着一定的量效关系。结果表明，花青素在150～350μg/mL质量浓度范围内对DPPH·有较强的清除能力。
图6 黑豆皮花青素对DPPH·的清除作用
Fig.6 DPPH·scavenging ability of anthocyanin from black soybean peel
2.3.2 黑豆皮花青素对OH·的清除能力
VC和黑豆皮花青素对OH·的清除能力结果见图7。由图7可见，花青素对OH·有一定的清除能力，且随着花青素质量浓度的增大，其清除能力也不断增强。花青素在试验的质量浓度范围内对羟自由基的清除能力要高于VC。
图7 黑豆皮花青素对OH·清除作用
Fig.7 OH·scavenging ability of anthocyanin from black soybean peel
3 结论
本研究采用离子液体-超声辅助提取法，对黑豆皮花青素的提取工艺进行了研究。根据响应面法优化提取工艺，得到最佳工艺条件为：离子液体浓度为0.9 mol/L、料液比1∶53（g∶mL）、提取温度43 ℃、超声时间 45 min，进行5次平行试验；在此条件下黑豆皮花青素的得率可达4.12 mg/g。
黑豆皮花青素抗氧化性能结果表明，花青素具有较强的抗氧化活性，在一定质量浓度范围内，随样品质量浓度的增加，其抗氧化性能也不断提高；其清除羟自由基的能力高于VC，当质量浓度＞150mg/mL之后，对DPPH·清除率高于VC。
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