日本酱油与中国酱油在不同模拟条件下挥发性呈香物质分析

酱油是我国的传统调味品，也是每家每户佐餐的必需品，由于其独特的风味物质和营养成分而被广为流传[1-2]。近年来，我国酱油市场发展迅猛，呈现快速增长趋势，但是高端酱油产品占比较少。目前随着中国社会的发展及人们消费水平的不断提高，消费观念逐渐变化，对酱油的需求也不只是满足于基本调味功能，而是逐渐走向营养化、健康化、高端化[3]。日本酱油酿造企业也看到了中国庞大的消费群体这一优势，依靠其优质的产品以及强大的品牌效应，不断扩大市场份额[4]。其中，日本龟甲万酱油依靠其独特的风味和怡人的口感，使其产品畅销全国各地，并始终处于领先水平。但由于日本用餐习俗、饮食文化、烹饪方式与中国差异明显，赋予了酱油的不同食用价值[5-7]，也使得酱油在不同的食用条件下，表现出不同的风味属性。

目前，顶空-固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）技术已被广泛用于挥发性风味物质的检测，它是集采样、萃取、净化、浓缩、进样功能于一体的分析检测技术，可以在一定程度上检测出酱油中的可挥发性物质的成分和相对含量，使用方便，操作简单，安全环保[8-9]，对挥发性组分具有很好提取效果。主成分分析（principle componentanalysis，PCA）是一种多元统计分析法，利用PCA分析能降低实验维度，可将多个变量间的复杂关系转为较少的几个变量。既保证原始变量信息的完整性，同时使得分析变得简单[10]。

为进一步对比研究日本酱油和中国酱油在不同模拟条件下（在模拟蘸料条件下为25℃、在模拟炒菜条件下为95℃）的挥发性呈香物质，并找出两者具有特征性差异的呈香物质，本研究不使用溶剂萃取方法，而采用无溶剂萃取，即顶空-固相微萃取技术结合气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）进行定性定量检测，通过PCA进行主成分分析，阐明两者挥发性呈香物质的差异，揭示中日酱油之间品质、风味之间的区别与联系，进一步改善中国民族酱油的质量，提升民族自主品牌的竞争力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选取日本浓口酱油（3种）、中国传统酱油（3种，其中1种酱油与日本酱油相近）：所有酱油均为高盐稀态酿造，购买于网上商城；2-辛醇（纯度99%）：上海安谱实验科技股份有限公司；甲醇（色谱纯）：天津泰艾瑞科技有限公司。

1.2 仪器与设备

GCMS-QP2010 Ultra气相色谱-质谱联用仪：日本岛津公司；SAAB-57348U 50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头和SAAB-57330U顶空-固相微萃取SPME手动进样手柄装置：上海安谱实验科技股份有限公司；RCT磁力搅拌器：德国IKA公司。

1.3 实验方法

1.3.1 顶空-固相微萃取

量取5 mL酱油样品，30μL内标（0.125 mg/L的2-辛醇甲醇溶液）于15 mL顶空瓶中，拧好瓶盖，分别置于不同的模拟条件下25℃、95℃水浴中加热平衡15 min后，用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头在25℃、95℃模拟条件下萃取30 min，萃取结束后在GC进样口250℃下解极5 min。首次萃取时需将萃取头老化1 h，以去除萃取头上所吸附的杂质，防止交叉污染。

1.3.2 GC-MS条件分析

气相色谱条件：Rtx-5MS毛细色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；程序升温条件：起始温度40℃，保持3 min，以4℃/min升至150℃，保持1 min，再以8℃/min升到250℃，保持6 min；载气为氦气（He）；流速1.0 mL/min；分流比：10∶1。

质谱条件：离子源温度200℃；传输线温度220℃；溶剂延迟时间1.5 min；质量扫描范围35～500 m/z，扫描模式为全扫描。

1.3.3 数据统计分析

化合物的鉴定根据美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）11数据库进行数据收集，参考相关文献和谱库初步鉴定物质成分，结合保留时间，特征离子峰和峰度比进行准确定性，相似度在80%以上的化合物会在文中列出。通过内标（2-辛醇）对酱油中所有挥发性呈香物质进行半定量分析（响应因子=1），每个样品平行测定3次，取其平均值进行后续分析，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）法对酱油中挥发性呈香物质进行分析。

2 结果与分析

2.1 日本酱油和中国酱油中挥发性呈香物质的鉴定结果分析

在两种模拟条件下，6种不同品牌的酱油通过HS-SPMEGC-MS方法，经分离鉴定出6种不同品牌的酱油中共有挥发性呈香物质9类，合计325种物质，主要有挥发性醇类、酸类、酯类、醛类、酮类、酚类、呋喃类、吡嗪类和杂环类（包括含氮化合物和含硫化合物）。采用内标物半定量分析法求得各挥发性呈香物质在酱油中的含量和各类呈香物质的总含量，结果如图1所示。由图1可以看出，在两种模拟条件下，随着温度的升高，日本品牌酱油中的醇类、酸类、醛类和酚类物质含量变化较大，中国品牌酱油则以酯类、酮类和吡嗪类物质含量变化明显。

2.1.1 日本酱油和中国酱油在25℃条件下挥发性呈香物质的鉴定分析

在25℃条件下，中国酱油共鉴定出131种挥发性呈香物质，日本酱油共鉴定出106种。如图1所示，在25℃条件下，中国酱油与日本酱油在挥发性醇类、酸类、醛类、酮类、酚类、呋喃类和杂环类等呈香物质的含量相差不大，但吡嗪类物质的含量明显高于日式，因为吡嗪类的来源是蛋白质或氨基酸的热分解、蛋白质或氨基酸与糖类发生美拉德反应的产物，造成差异的原因可能是原料不同[11]。由于本文所用的中国品牌酱油是以黄豆和小麦粉为主要原料，而日本品牌酱油的原料则是以脱脂大豆和炒小麦为主，这也与吡嗪类物质的来源分析相一致[12]。其中2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪赋予中国酱油坚果、烤土豆、焙烤类香气。就挥发性酯类物质而言，日本酱油优于中国酱油，主要贡献来源于产酯产香的乙基酯类物质，其生成途径一是在发酵过程中由酵母酶和乳酸菌催化生成[13]，二是由大豆中的蛋白质降解成为氨基酸与乙醇酯化产生[14]。乙基酯类物质具有诱人的果香和甜香，对日本酱油的香味具有很强的贡献度。

2.1.2 日本酱油和中国酱油在95℃条件下挥发性呈香物质的鉴定分析

在95℃条件下，中国酱油共鉴定出208种挥发性物质，日本酱油共鉴定出143种。如图1所示，日本酱油中挥发性醇类、酸类、醛类、酚类的含量均高于中国酱油，尤其突出表现为醇类，其含量比中国酱油高出1.6倍。但是，中国酱油在挥发性酯类、酮类、吡嗪类、杂环类的含量均高于日本酱油。在挥发性醇类物质中，乙醇主要是酱油发酵过程中由酵母作用，通过酒精发酵产生的，在高盐稀态酱油中乙醇主要是酵母菌和糖类通过代谢作用共同产生的[23]，而其他高级醇（如苯乙醇）则是由支链氨基酸异亮氨酸和亮氨酸以及芳香族氨基酸苯丙氨酸在代谢过程中脱氨基、脱羧基后产生的[13]。日本酱油中乙醇含量远高于中国酱油，因此，日本酱油的醇香味更加浓厚怡人。在此条件下，中国酱油在挥发性酯类物质的含量上占据优势，主要是长链的脂肪酸酯类物质，赋予中国酱油浓郁而饱满的酱香和酯香，来源于原料中的脂肪酸和醇类的相互作用，同时也与大豆油的降解有关[15]。

2.2 日本酱油和中国酱油中典型挥发性呈香物质的结果分析

对6种不同品牌的酱油中典型挥发性呈香物质进行比较分析，在25℃条件下，日本酱油和中国酱油中典型呈香物质的结果分析如表1所示，共确定出39种典型挥发性呈香物质，其中3种日本酱油共鉴定出32种，3种中国酱油共确定出33种。日本酱油中典型呈香物质主要是乙醇，其平均含量约是中国酱油的3倍，主要贡献醇香和酒香；乙基酯类物质贡献果香和甜香，两类物质的总含量远远高于中国酱油，这主要是与日本酱油所使用的主要原料、发酵菌种以及高盐稀态控温发酵工艺有关[7]。中国酱油中典型呈香物质主要是由苯乙醇贡献花香和甜香；2-乙酰基吡咯、愈创木酚、糠醇、5-甲基-2-呋喃甲醇及吡嗪类物质贡献烟熏香、（烧）烤香、坚果香和酱香，这些物质主要来源于氨基酸的Strecker降解反应，是中国酱油产生浓郁香气的主要因素[14]。

在95℃条件下，日本酱油和中国酱油中典型呈香物质的结果分析如表2所示，结果表明，共确定出79种典型挥发性呈香物质，其中3种日本酱油共确定出62种，3种中国酱油共确定出66种。日本酱油中典型呈香醇类主要有乙醇、异丁醇、异戊醇、2-甲基丁醇、正丁醇、2,3-丁二醇（两种同分异构体）占主体地位，贡献醇香、麦芽香和果香等芳香气味，以丰富日本酱油独特的风味特征，使其醇香味更加浓厚怡人；中国酱油是以糠醇、苯乙醇、5-甲基-2-呋喃甲醇、麦芽醇和月桂醇为典型，贡献一定的烤香、花香和果香，以缓和酱油中的不良气味。醋酸在日本酱油中占有绝对优势，它是厌氧微生物发酵的产物，说明日本酱油在发酵过程中，厌氧发酵占据一定的比重[16]。典型呈香醛类共确定13种，日本酱油中以α-戊基桂醛和（Z）-7-十六碳烯醛为典型，赋予其一定的果香和烤香；中国酱油以3,4,5-三甲氧基苯甲醛为典型，为其提供一定的甜香和果香。呈香酚类物质主要是曲霉在发酵过程中通过降解作用生成的，主要贡献给酱油烟熏香和焦糖香味[17]，中国酱油以2,6-二甲氧基苯酚、2-甲氧基-3-（2-丙烯基）苯酚为典型，日本酱油以3,5-二叔丁基苯酚为典型。中国酱油的呈香酯类物质比重占据较大，主要是苯基酯类物质和长链脂肪酸乙酯类物质贡献较突出，赋予酱油良好的果香、酱香和酯香，尤其是乙酸苯乙酯，苯甲酸-2-苯乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、反油酸乙酯；日本酱油以烟酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸异丁酯、2,2-二甲基乙烯基丁酸酯为典型。挥发性呈香酮类物质包含了呋喃酮和吡喃酮类物质，其都是由糖代谢途径产生的[18]，5-乙基-4-羟基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮（4-hydroxy-5-ethyl-2-methyl-3（2H）-furanone，HEMF）是共有的酮类物质，赋予酱油很好的果香、烟草香和焦糖香，中国酱油以2-甲基四氢呋喃-3-酮、1-（6-甲基-2-吡嗪基）乙酮和2,4-二甲氧基苯乙酮为典型；日本酱油以3,6-二甲基四氢吡喃-2-酮和香叶基丙酮为典型。吡嗪类物质是中国酱油中典型呈香成分，贡献酱油焦香、烤香和坚果香，在已鉴定的8种吡嗪类物质中，2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪是共有物质，其余5种是中国酱油特有的物质。2-乙基-5-甲基呋喃是日本酱油特有，贡献出焦糖香、酱香；薄荷呋喃和4-羟基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮（HDMF）是中国酱油特有。D-柠檬烯是日本酱油特有，贡献出果香[19]。

2.3 日本酱油和中国酱油中典型挥发性呈香物质的差异比较分析

通过HS-SPME-GC-MS方法，对比表1和表2发现，在25℃条件和95℃条件下，从6种品牌酱油中共检测出典型挥发性呈香物质共94种，26种典型呈香物质在两种条件下均有检出（表1和表2中的前26种），13种典型呈香物质仅在25℃条件下检出（表1中的后13种），53种典型呈香物质在95℃条件下检出（表2中的后53种），由此可见，酱油在不同处理条件下，呈香物质的种类表现出较大的差异性，对中日两类6种酱油中典型挥发性呈香物质的差异比较分析如图2所示。

在25℃条件下，对挥发性典型呈香酸类、酮类和呋喃类物质均无检出，这与低温条件有关，不利于这几类物质的提取与检测，因此挥发性典型呈香物质以酯类和醇类为主。在95℃条件下，挥发性典型呈香物质增高最为明显的是酮类、酚类和醛类。由此可见，酱油在不同处理条件下，呈香物质的种类差异性较大。

在26种共有的典型物质中，呈香醇类物质共有10种，其含量差异也较为突出。在25℃条件下日本酱油中醇类的相对总含量与中国酱油差异较小，而95℃条件下两类酱油的相对总含量差异极大，尤以乙醇明显。在两种萃取条件下，日本酱油中醇类物质平均含量分别约是中国酱油的2.2倍和9倍，乙醇是日本酱油中最为突出的呈香醇类物质，其醇厚的香气可以调和海产品中的土腥味，有助于增强海鲜类产品的口感，符合日本蘸料的饮食风俗。中国酱油以苯乙醇为典型，苯乙醇是由芳香族氨基酸苯丙氨酸在代谢过程中脱氨基、脱羧基后产生的[20]，在两种萃取条件下，苯乙醇在中国酱油中的平均含量约是日本酱油的5倍。乙酸乙酯的相对含量在两类酱油中差异明显，在日本酱油为典型，乙酸乙酯表现为高挥发性，呈较强烈的果香和酒香，对日本酱油的风味贡献尤为突出。在高温萃取时，乳酸乙酯和柠檬酸三乙酯在中国酱油的相对含量高于日本酱油，以此赋予中国酱油绵长醇厚的后味，使其在高温烹饪时表现出独有的特性。吡嗪类物质的阈值低，具有特殊坚果和焦糖香气，对酱油香气赋予作用较大[21-22]。中国酱油吡嗪物质的含量要远远高出日本酱油，赋予中国酱油独特的后味而应用于更广泛的烹饪领域。其中2-乙基-3,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪是中国酱油区别于日本酱油的关键物质。

酱油的酱香风味是多种呈香物质共同作用的结果。中日酱油中在典型挥发性香气物质如异戊醛、2-甲基丁醛、愈创木酚、HEMF等主要呈香物质相似，但在高温条件下，日本酱油中HEMF含量约为中国酱油的2倍。日本酱油的典型呈香物质是乙醇、乙酸乙酯等挥发性强的小分子醇类和脂类，这些物质往往具有诱人的果香和独特的芳香气味，给人以清香恬淡的感觉。在日本饮食文化和地域环境的影响下，酱油主要作为蘸料被使用，而日本酱油诱人的酱香和怡人的醇香刚好满足这种饮食需求。但日本酱油中吡嗪类、酮类化合物含量和种类较少，后味缺失，因此使用范围也受到较大的制约。对于中国酱油，其典型呈香物质源于吡嗪类、酮类和酯类化合物。糠醇、柠檬酸三乙酯、2-乙基-3,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙酰基吡咯是其区别于日本酱油的关键物质，它们赋予中国酱油醇厚绵长的后味，在高温烹饪时展现其特有的酱香风味。

2.4 日本酱油和中国酱油中挥发性呈香物质的主成分分析

为了更加明确地探究中国酱油和日本酱油的典型挥发性呈香物质，对中日两类的6种酱油中的呈香物质对中日两种品牌6种酱油中的呈香物质组分进行主成分分析，结果如图3所示。

图中的6个红色数据点代表中日两类的6种不同酱油，其中在25℃条件下，第一主成分（PC1）的方差贡献率为65.40%，贡献最大的呈香物质是异戊醇，第二主成分（PC2）的方差贡献率为21.24%，贡献最大的呈香物质为乙酸乙酯；在95℃条件下，第一主成分（PC1）的方差贡献率为66.26%，贡献最大的呈香物质是乙醇，第二主成分（PC2）的方差贡献率为29.78%，贡献最大的呈香物质为苯乙醇，在两种条件下，前两个主成分的累计方差贡献率均大于85%，以充分说明了该两个主成分已包含了样品的整体数据信息。

由图3可看出，在两种条件下，中日两国的6种酱油被显著区分成2类，即是中国酱油样品C1与C3聚为一类，中国酱油样品C2与日本的三个酱油样品聚成一类，说明该两种中国酱油产品C1与C3中的呈香物质较为相近，差异较小；而C2则与日本酱油中的呈香物质较为接近，与C1和C3的呈香物质相差较远，差异较大。在25℃条件下，中国酱油中的典型呈香物质以苯乙醇，2-甲基丁醇和异戊醇贡献度为主，日本酱油中的典型呈香物质以乙酸乙酯，乙醇和2-甲基丁醛为主。在95℃条件下，中国酱油中的典型呈香物质以苯乙醇，2-甲氧基-4-乙烯苯酚，异戊醛，2-甲基丁醛和苯乙醛为主，日本酱油中的典型呈香物质以乙醇，异戊醇和4-乙基-2-甲氧基苯酚为主。由此可见，不同品牌酱油中的呈香物质差异较为明显。

通过该主成分聚类分析图可以将6种酱油中呈香物质组分间差异较大的产品很好地区分开，这一结果也与SPME-GC-MS检测结果基本一致。通过对SPME-GC-MS检测技术可对样品中挥发性呈香物质的具体种类和含量进行分析与比较，但不能确定这些物质作为一个整体时对样品风味特征的贡献度，而主成分聚类分析与之互补，得到的不是被测样品中各挥发性呈香物质的定性或定量结果，而是样品整体的风味信息，因此两者配合有利于同时从宏观和微观上共同研究酱油样品中的呈香物质。

3 结论

酱油的独特风味是多种挥发性呈香物质共同作用的结果，中日两类酱油中典型的呈香物质虽具有相似性，但又各自富有独特风味。在两种不同萃取条件下，日本酱油中的呈香物质以小分子醇类和酯类作为典型香气成分，赋予日本酱油清淡爽口的风味特征，符合其作为蘸料佐料的产品定位。而中国酱油中以呈香吡嗪类、酯类和酮类化合物为主，赋予中国酱油绵长醇厚的独特后味，适合其在高温炒菜条件下展现出浓郁的酱香风味。通过本实验，揭示了中日酱油在不同温度处理条件下挥发性呈香物质的具体差异性，并结合主成分分析确定了不同模拟条件下两种品牌酱油中贡献最大的典型呈香物质，为区别中日两种品牌酱油的风味特征提供数据参考，为中国民族酱油新产品的改进和革新提供科学的理论依据。

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