果醋类产品是经过生物发酵的健康饮品，其中醋酸发酵是生物发酵中的关键环节，其对果醋产品最终的营养风味及保健功效起到非常重要的作用。国内外学者一直都对醋酸发酵工艺及关键点的研究非常重视。刘国明等[1]利用正交分析法对荔枝醋酸发酵菌种筛选及工艺进行优化，探明风味最佳荔枝醋的发酵工艺；屈利民等[2]研究了荔枝果醋的3种不同发酵方式，并采用顶空固相微萃取-气质联用技术对挥发性风味成分进行了分析比较；张霁红等[3]研究了苹果醋液态深层发酵方法，优选出了菌株Y010及其在发酵过程中乙醇脱氢酶活性与产酸量和产酸速率的关系；HIDALGO C等[4]应用分子生物学方法对柿子醋酸发酵进行研究，对柿子在醋酸化过程中产生的醋酸菌进行了鉴定。
醋酸发酵是在醋酸菌氧化酶的作用下将酒精氧化生成醋酸，理论上100 g酒精能生成130.4 g醋酸，由于发酵过程中醋酸会被作为醋酸菌生长繁殖的碳源营养而被消耗一部分，外加醋酸的挥发、氧化分解、酯化反应等原因，在实际中一般只能达到理论值的85%左右[3-5]。醋酸发酵受到醋酸菌接种量、发酵温度、发酵时间、初始酒精度等因素的影响。本试验应用响应面优化方法对荔枝醋酸发酵工艺条件进行优化研究，以考察荔枝醋酸发酵的最佳工艺参数，提高醋酸产量，旨在为荔枝醋的工业化生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
荔枝清汁：广东祯州荔枝产业股份有限公司；沪酿1.01号醋酸菌：海博生物技术有限公司；澳大利亚R2酵母：上海杰兔工贸有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
UV1810紫外可见分光光度计、爱拓RX-5000α自动阿贝折光仪：北京普析通用仪器公司；DDSJ-318型电导率仪：上海仪电科学仪器股份有限公司；雷磁PHSJ-5型pH测定仪：上海仪电分析仪器有限公司；生物发酵罐：张家口奥斯特不锈钢有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 荔枝醋酸发酵工艺
荔枝清汁→成分调整（总糖250 g/L）→酒精发酵（酵母菌250 mg/L 28℃、6～8 d）→醋酸发酵（11 d）→指标检测→过滤→灭菌（130℃、2 min）→荔枝原醋
1.3.2 单因素试验设计
通过单因素试验分别考察醋酸菌接种量（0.30 g/L、0.50 g/L、0.70 g/L、0.90 g/L）、初始酒精度（5%vol、6%vol、7%vol、8%vol）、醋酸发酵温度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）对醋酸发酵中总酸含量的影响。
1.3.3 响应面试验设计
利用在单因素试验获得的最佳接种量、温度和初始酒精度范围，在Box-Behnken响应曲面法设计3因素3水平试验，以醋酸菌接种量、发酵温度和初始酒精度3个因子为自变量，以总酸含量为响应值，试验设计因素与水平见表1。
表1 醋酸发酵条件优化响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology for conditions optimization of acetic acid fermentation
水平A醋酸菌接种量/（g·L-1）B初始酒精度/%vol C发酵温度/℃-1 01 0.30 0.50 0.70 567 30 35 40
1.3.4 指标测定
总酸的测定[6]：酸碱中和滴定法（以醋酸含量计）；酒精度的测定[7]：密度瓶法。
2 结果与分析
2.1 接种量对醋酸发酵的影响
醋酸菌接种量对荔枝醋酸发酵的影响见图1。由图1可以看出，各发酵样在前6 d的产酸量都呈现递增趋势，彼此差别不明显。在第7天后，接种量0.70～0.90 g/L的发酵样产酸速度变缓，发酵周期较长，接种量0.30～0.50 g/L的发酵样产酸速度较高，当接种量为0.30 g/L时醋酸产量达到5.14 g/100 mL。可见最优接种量范围为0.30～0.50 g/L。
图1 醋酸菌接种量对荔枝醋酸发酵的影响
Fig.1 Effect of acetic acid bacteria inoculum on acetic acid fermentation of litchi
在醋酸发酵中，醋酸杆菌的主要作用是将酒精氧化为醋酸，足量的醋酸菌不仅可以缩短发酵周期，还能降低污染杂菌的几率，但如果醋酸菌接种量过大，不仅将酒精作为碳源，还会以甘油、甘露醇等多元醇作为碳源，发酵液中的营养物质会供应不足，会继续把醋酸氧化成二氧化碳和水，也会氧化乙醇之外的其他醇类和糖类生成相应的酸、酮等物质，同时会导致代谢杂质增多，容易产生过早老化和自溶现象[8-11]。
2.2 初始酒精度对醋酸发酵的影响
初始酒精度对醋酸发酵的影响见图2。由图2可知，在前3 d中，4个发酵样的产酸速度都呈现递增的趋势。第4天后表现出不同的趋势，初始酒精度5%vol～6%vol的发酵样产酸一直呈现递增趋势。初始酒精度5%vol和6%vol的发酵样在第11天时总酸含量分别达到5.39 g/100 mL和5.38 g/100 mL，而初始酒精度为4%vol和7%vol的发酵样仅为1.83 g/100 mL和3.14 g/100 mL，其中初始酒精度7%vol的发酵样，产酸速率缓慢，产酸量不断下降。可见初始酒精度范围在5%vol～6%vol时最有利于醋酸发酵。
图2 初始酒精度对醋酸发酵的影响
Fig.2 Effect of initial alcohol content on acetic acid fermentation of litchi
在醋酸发酵过程中，随着发酵时间的延长，酒精度逐渐下降，酸度不断升高，一般醋酸发酵的适宜酒精度范围为5%vol～12%vol。初始酒精度为醋酸菌的繁殖代谢提供了必需的营养物质，在一定的酒度范围内，总酸产量会随着酒精度的增大逐渐增加，但是初始酒精度过高时，反而会抑制醋酸菌的生长代谢活动，导致醋酸菌不适应高酒精度环境，从而影响发酵进程，使醋酸产量下降，同时延长了发酵周期[12-16]。
2.3 发酵温度对醋酸发酵的影响
发酵温度对荔枝醋酸发酵的影响见图3。由图3可知，当醋酸发酵温度为30～35℃时产酸速度最快，产酸量也较高。在35℃时，醋酸产量在第11天达到5.22 g/100 mL。发酵温度在40℃时，醋酸产率先升高后降低，这是由于发酵温度过高，醋酸菌在第8天时失活，提前老化而导致醋酸量下降。发酵温度在25℃时，虽然醋酸产量整体呈现上升趋势，但是醋酸菌生长代谢缓慢，发酵周期长，醋酸产量偏低。可见最适醋酸发酵温度为30～35℃。
一般情况下，醋酸菌生长繁殖的适宜温度为28～33℃，醋酸菌生长的最适pH值为3.5～6.5，在发酵液中醋酸含量达1.5%～2.5%时，其生长繁殖就会停止，醋酸发酵过程依赖于细胞膜上具有高活性的乙醇脱氢酶以及乙醛脱氢酶，发酵过程中乙醇在乙醇脱氢酶作用下被氧化成乙醛，乙醛在乙醛脱氢酶作用下被氧化为乙酸。酶的催化反应有最适条件，一般在最适温度下，酶的催化反应才能达到最大值[17-19]。理论上，一般发酵温度每上升10℃，催化反应速率提升1～2倍。但是，当温度过高时，酶的催化能力会大大降低，甚至会导致其丧失催化活性[20-22]。
图3 发酵温度对荔枝醋酸发酵的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on acetic acid fermentation of litchi
2.4 响应面法优化醋酸发酵条件
在单因素试验的基础上，利用响应面法优化荔枝醋酸发酵工艺，根据Box-Behnken中心组合设计原理，以发酵11 d的总酸产量为响应值，利用Design-Expert.V8.0.6软件对A（醋酸菌接种量）、B（初始酒精度）、C（发酵温度）3个因素设计3因素3水平的响应面试验，试验设计及结果见表2。
表2 醋酸发酵条件优化响应面试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of response surface methodology for conditions optimization of acetic acid fermentation
试验号A B C 总酸/（g·100 mL-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0-1 1-1 1-1 1-1-1-1 1 1 0 0 0 0 -0 0 0 0 -1-1 1 1 -1-1 11 12 13 14 15 16 17 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 -1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 4.15±0.11 4.69±0.11 4.61±0.08 4.54±0.12 4.16±0.06 4.76±0.10 4.31±0.06 4.16±0.11 4.79±0.10 4.46±0.12 4.14±0.11 4.85±0.12 4.97±0.08 5.13±0.10 5.08±0.11 5.19±0.07 5.00±0.12
应用Design-Expert.V8.0.6软件对荔枝醋酸发酵条件进行3因素3水平的响应面分析试验设计，对响应面试验结果进行回归分析，获得自变量为A（接种量）、B（初始酒精度）、C（温度），响应值为Y值（总酸产量）的二次多元回归方程：Y=50.74+1.16A+0.86B-0.89C-1.56AB-1.88AC+2.60BC-3.97A 2-1.79B2-3.33C 2。为检验方程的可靠性，对方程进行方差分析，结果见表3。
表3 响应面试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of response surface methodology results
注：“*”表示差异显著（P＜0.05）；“**”表示差异极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型ABCA B********AC BC A2 B2 C 2 43.59 19.65 10.93 11.68 17.83 25.98 49.59 122.18 24.69 85.74＜0.000 1 0.003 0 0.013 0 0.011 2 0.003 9 0.001 4 0.000 2＜0.000 1 0.001 6＜0.000 1**********残差失拟项纯误差总和213.54 10.70 5.95 6.35 9.70 14.14 26.99 66.50 13.44 46.66 3.81 0.52 3.29 217.35 91111111117341 6 23.73 10.70 5.95 6.35 9.70 14.14 26.99 66.50 13.44 46.66 0.54 0.17 0.82 0.21 0.885 8 R2=0.982 5 R2adj=0.959 9
如表3所示，P失拟项=0.885 8＞0.05，说明模型失拟度不显著；回归模型的调整确定系数（R2adj）为0.959 9，表明有95.99%响应值变化是可解释的，且相关系数（R2）为0.982 5，与R2adj比较接近，说明此模型拟合程度好，误差也较小，在荔枝醋酸发酵工艺参数的优化实验上可以使用该模型进行分析。一次项A（接种量）、交互项AB、AC、BC、二次项A 2、B2、C2的P值均＜0.01，说明对结果影响极显著（P＜0.01）；B（初始酒精度）、C（温度）的P值小于0.05，说明对结果影响显著。
2.5 发酵条件的响应面分析与优化
在回归模型方差分析结果的基础上，进一步考察醋酸菌接种量（A）、初始酒精度（B）和发酵温度（C）其交互作用对响应值Y（总酸产量）影响的响应面及等高线，结果见图4。等高线形状可以反映交互作用大小，当为椭圆形时，表示交互作用显著；而当等高线形状为圆形，则表示交互作用不显著。
由图4可知，接种量和初始酒精度的交互作用对总酸含量的影响极显著，发酵温度和初始酒精度的相互作用对总酸含量影响极显著，发酵温度与接种量的交互作用对总酸含量的影响极显著。
图4 各因素交互作用对总酸含量影响的响应面和等高线
Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interactions between various factors on total acid content
根据所建立的数学模型进行参数的最优化分析，可得荔枝醋酸发酵的最佳发酵条件为发酵温度32.08℃，初始酒精度5.52%vol，接种量0.42 g/L，该工艺条件下荔枝果醋含量的总酸理论值为5.10 g/100 mL。
2.6 验证试验
为了验证响应面优化方法得到的多元回归模型的准确性，保证试验的可操作性，将最佳发酵工艺条件修正为发酵温度32℃，初始酒精度5.5%vol，接种量0.42 g/L。在该条件下进行3次平行试验，得到醋酸发酵后总酸的平均值为4.91 g/100 mL，实际值与理论值较为接近，说明该模型准确可靠，能较好地预测荔枝果醋饮料的酸度，利用该模型在实践中进行预测是可行的。
3 结论
在单因素试验的基础上，利用响应面法对荔枝醋酸发酵条件进行了优化，建立了总酸产量与初始酒精度、发酵温度、接种量3个因素的二次多项式回归模型，由该模型得到的优化发酵工艺参数为发酵温度32℃，初始酒精度5.5%vol，醋酸菌接种量0.42 g/L。在此优化条件下，总酸产量为4.91 g/100 mL，与理论值5.10 g/100 mL接近。经验证实验证明该模型合理可靠。
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