铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）又称绿脓杆菌，在自然界分布广泛，土壤、水、空气及正常人和动物的机体皮肤、呼吸道和肠道中都有该菌的存在，它是一种条件致病菌[1]，能够产生粘附素、多糖荚膜、内毒素和外毒素等多种致病因子，威胁人体健康[2]，是医院内感染的主要病原菌之一[3-4]。近年来，铜绿假单胞菌污染饮用水的报道逐渐增多，廖振宇等[5]在492份成品水中检出7份样品铜绿假单胞菌阳性，由铜绿假单胞菌引发的食物中毒事件也陆续有报道[6-12]，证实铜绿假单胞菌是一种重要的食源性和水源性致病菌。2015年以前，我国国家标准中只有矿泉水标准有铜绿假单胞菌的检测指标[13]。在2015年5月24日开始实施的国标GB 19298—2014《食品安全国家标准包装饮用水》中，铜绿假单胞菌才被列入新增致病菌指标。从全国抽检信息中公布的包装饮用水抽检不合格信息来看，铜绿假单胞菌是造成包装饮用水不合格的最主要因素之一。目前，国内外对于包装饮用水，特别是饮用纯净水和其他饮用水中的铜绿假单胞菌污染及其耐药性分析的文献研究很少，对于铜绿假单胞菌污染的来源未进行系统分析[14-17]，而常见的分析方法也多集中在多位点序列分析（multilocus sequence analysis，MLSA）、脉冲场凝胶电泳分析（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）等[18-19]，耗时较长且操作较复杂。本研究在湖北省地区选取15家成品水中曾检出铜绿假单胞菌的包装饮用水生产企业，采集116份样品，分析生产过程各环节铜绿假单胞菌污染情况，对分离得到的阳性菌株通过梅里埃药敏鉴定卡进行耐药分析，利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF MS）同源性研究，以期为包装饮用水生产企业和食品安全监管部门防控铜绿假单胞菌污染提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
材料：本实验所用样品来自湖北省地区2015-2017年监督抽检中曾检出铜绿假单胞菌的生产企业（116份）。
假单胞菌琼脂基础培养基、乙酰胺液体培养基、金氏B（King's B）培养基、绿脓菌素测定用培养基、营养琼脂培养基、氧化酶、纳氏试剂等：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；VITEK-2GN鉴定卡及革兰氏阴性细菌药敏鉴定卡：法国生物梅里埃公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA）：德国布鲁克公司。实验所用到试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定仪：法国生物梅里埃公司；autoflex maX基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）：德国布鲁克公司；微生物膜过滤系统和配套滤膜：美国密理博公司。
1.3 方法
1.3.1 铜绿假单胞菌的分离鉴定
样品采集：选用2瓶带盖子无菌广口塑料瓶，擦拭干净水龙头嘴里外后，打开水龙头流2 min，关上水龙头并用体积分数95%的乙醇棉球灼烧灭菌，再次打开水龙头让水流1～2 min后，再接水样并装满取样瓶。包装容器则采取随机抽取桶体，用250 mL无菌生理盐水淋洗法将淋洗液作为检测样品。共采集15家生产企业116份检测样品。
铜绿假单胞菌的分离鉴定：按照GB 8538—2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》[20]中“57铜绿假单胞菌”对采集的样品进行检验。将250 mL水样用孔径0.45μm的滤膜过滤，然后将过滤后的滤膜贴在已制备好的假单胞菌琼脂基础培养基平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间产生气泡。将平板置于（36±1）℃培养40～48 h，并防止干燥。所有显蓝色或绿色（绿脓色素）的菌落，判定为铜绿假单胞菌。将需验证的可疑菌落（产荧光和红褐色不产荧光的菌落）划线接种营养琼脂培养基，于（36±1）℃培养20～24 h，进行氧化酶试验、乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证性试验。分离纯化后的菌落用VITEK-2 GN鉴定卡进一步确认。
1.3.2 耐药性分析
采用法国梅里埃公司的革兰氏阴性菌药敏卡片（ASTGN13卡）对分离得到的48株铜绿假单胞菌进行药敏试验，试验的药物分别为：哌拉西林/他唑巴坦（tazobactam，TZP）、头孢唑林（cefazolin，CEF）、头孢替坦（cefotetan，CFO）、头孢他啶（cef-tazidime，CAZ）、头孢吡肟（cefepime，FEP）、亚胺培南（imipenem，IMP）、阿米卡星（amikacin，AMK）、庆大霉素（gentamicin，GEN）、妥布霉素（tobramycin，TOB）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、左氧氟沙星（levofloxacin，LVX）和呋喃妥英（furadantin，FUR）共12种抗生素，以铜绿假单胞菌ATCC 27853作为质控菌株。
1.3.3 同源性分析
将PA菌株接种于营养琼脂平板，放置于36℃培养箱中培养24 h。用无菌接种环挑取适量细菌放入1.5 mL EP管，加入300μL纯水混匀，再加入900μL无水乙醇振荡混匀，静置15 min后离心（12 000 r/min、2 min），弃上清后重复离心，以彻底弃去上清。再向EP管内加入30μL体积分数70%的甲酸，振荡混匀后再加入20μL乙腈，再振荡混匀，静置1 min后高速离心（12 000 r/min、2 min），吸出上清蛋白提取液备用，做好标记及编号。取1μL处理好的上清液点加在MALDITOF MS的样品靶上，在室温条件下自然晾干（5～10 min），其上滴加1μL HCCA基质溶液均匀覆盖其表面，待自然晾干后上机检测。每一个样品的蛋白质谱峰通过不同位置100次的激光点击而获得，仪器可检测的蛋白质分子质量范围为2 000～20 000 Da，得到的蛋白质谱峰信息经软件校正，然后与仪器内的微生物数据库图谱进行比对，从而得到鉴定结果。通过MALDI-TOFMSbiotyper软件查看分析鉴定结果，并导入图谱数据库进行聚类分析，形成主成分分析（principal component analysis，PCA）聚类分析图谱。
2 结果与分析
2.1 铜绿假单胞菌检出情况
表1 包装饮用水生产各环节铜绿假单胞菌检出结果
Table 1 Detection results of Pseudomonas aeru ginosa in packaged drinking water of each production link CFU/250 mL
注：“/”表示未取样检测；“0”表示未检出。下同。
生产企业编号水源水石英砂过滤后水活性炭过滤后水精滤后水臭氧杀菌后水成品水包装容器（清洗前）包装容器（清洗后）1234567891 0 70 32 300 30 0 85 500 500 120 1 000 1 500 50 100002 003 8000 011 8005 000451 6 11 12 13 14 15 500 0 300 500 18 55/ 0//00200001 000 200 220 0 500 30 0 132 40 0 75 0 33 156 00/0 0300070000201 70 002001000010000 000000000000000
由表1可知，116份样品中，共有43份检出了铜绿假单胞菌，检出率为37.1%，分别计算各个工艺环节铜绿的检出率，则水源水、石英砂过滤后水、活性炭过滤后水、精滤后水、臭氧杀菌后水、成品水和清洗前包装容器的铜绿检出率分别为40.0%、46.7%、66.7%、66.7%、18.2%、33.3%、20.0%。由此可知，石英砂过滤、活性炭过滤和精滤环节铜绿的检出率最高，这与企业清洗、更换石英砂、活性炭和滤膜的频率呈一定的相关性。
对检出的阳性菌株进行编号，经过分离纯化后得到48个分离株，具体信息见表2。在假单胞菌琼脂基础培养基平板上，大部分铜绿为蓝绿色，少数黄褐色产荧光，典型菌落形态见图1。
表2 阳性菌株来源及编号
Table 2 Sources and number of the positive strains
注：编号前面数字代表生产企业，后面数字代表生产环节，同一来源不同形态（蓝绿色/黄褐色产荧光）的菌株用a、b、c区分。
水源水石英砂过滤后水活性炭过滤后水精滤后水臭氧杀菌后水成品水包装容器（清洗前）包装容器（清洗后）1-1a、1-1b 0 3-1 4-1 1-2 0 3-2 1-4 2-4 3-4 1-6 0 3-6 0 0 3-7a、3-7b 0 0 0 0 0 0 0 0 6-2 1-3 2-3 3-3 0 5-3 6-3 0 0 0/ 0 / / 0 0 0 0 0 6-7 0 0 7-4 8-4 9-4a、9-4b 10-4a、10-4b 0 12-4 0 14-4 15-4 0 0 0 7-5 7-6 9-1a、9-1b 10-1 0 12-1 0 0 0 0 0 0 0 0 10-2 11-2 12-2 13-2 9-3 10-3 0 12-3 13-3 0 15-3 0 0 0 0 11-7 12-5 0 0 0 0 0 0 / 0 12-6 0 14-6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
图1 假单胞菌琼脂基础培养基上典型菌落形态
Fig.1 Typical colony morphology of Pseudomonas on agar base medium
2.2 耐药性分析结果
48株铜绿假单胞菌对头孢唑林、头孢替坦和呋喃妥英的耐药率较高，分别为93.7%、87.5%和83.3%，对头孢他啶、头孢吡肟、亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星的耐药率分别为4.2%、6.3%、2.1%、4.2%、4.2%和4.2%，对哌拉西林/他巴唑坦、妥布霉素和左氧氟沙星均不耐药（见表3）。其中有6株铜绿假单胞菌（PA1-3、PA3-1、PA5-3、PA9-3、PA12-2、PA14-4）呈现多重耐药性，PA1-3的耐药水平最高，来自于活性炭过滤后水。
表3 48株铜绿假单胞菌的药敏结果
Table 3 Drug sensitivity of 48 Pseudomonas aeruginosa strains
注：R表示耐药，S表示敏感。
菌株编号PA1-1a PA1-1b PA1-2 PA1-3 PA1-4 PA1-6 PA2-3 PA2-4 PA3-1 PA3-2 PA3-3 PA3-4 PA3-6 PA3-7a PA3-7b PA4-1 PA5-3 PA6-2 PA6-3 PA6-7 PA7-4 PA7-5 PA7-6 PA8-4 PA9-1a PA9-1b PA9-3 PA9-4a PA9-4b PA10-1 PA10-2 PA10-3 PA10-4a PA10-4b PA11-2 PA11-7 PA12-1 PA12-2 PA12-3 PA12-4 PA12-5 PA12-5 PA13-1 PA13-3 PA14-4 PA14-6 PA15-3 PA15-4抗生素种类TZP CEF CFO CAZ FEP IMP AMKGEN TOB CIP LVX FUR SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS RRRRRRRRRSRRRRRRRRRSRRRRRRRSRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRSRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRSRRRSRRRRRSRRRRSSRR SSSSSSSSSSSSSSSSRSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSRSSS SSSSSSSSRSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSRSSSSSSRSSS SSSRSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS SSSRSSSSSSSSSSSSRSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS SSSRSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSRSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS SSSSSSSSRSSSSSSSRSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS RRSRRRRRRRRRRRRRRSSSSSRRRRRRRRRRRRRRSRRRRRRSRRRR
2.3 同源性分析结果
通过将48株PA的蛋白质指纹图谱进行聚类分析，48株PA分为两大簇（Ⅰ型31株，Ⅱ型17株），按照50%相似性作为判定水平，48株菌可被分为a～f共6个类群，a类群包括：PA1-1a、PA1-1b、PA1-3、PA1-4、PA1-6、PA2-3、PA2-4、PA3-1、PA3-4、PA4-1、PA6-2、PA6-7、PA7-6、PA8-4、PA10-3、PA10-4b、PA12-2、PA12-3、PA12-4、PA12-5、PA12-6、PA13-2、PA14-4、PA14-6、PA15-3和PA15-4。b类群包括：PA1-2、PA5-3、PA7-4、PA9-4b和PA13-3，c类群包括PA3-2和PA9-4a，d类群包括：PA3-7a、PA10-1和PA10-4a，e类群只有PA3-3和PA11-2，f类群包括：PA3-6、PA3-7b、PA6-3、PA7-5、PA9-1a、PA9-1b、PA9-3、PA10-2、PA11-7和PA12-1。
对铜绿假单胞菌蛋白质质谱数据进行主成分分析，欧氏距离反映了各菌株之间的相似程度，结果见图2。由图2可知，48株铜绿假单胞菌被聚成了4类。其中，来自于同一生产企业的菌株大多集中在同一类或两类，但是第3个生产企业的7株菌则被分到3个不同类别，结合样品的来源分析，发现菌株的分型与其来源没有明显的对应关系。
图2 铜绿假单胞菌主成分分数的三维散点分布图
Fig.2 Three-dimensional scatter plot of the principal component analysis of 48 Pseudomonas aeru ginosa strains
3 结论
本研究从水源及各环节水样中分别进行铜绿假单胞菌的分离和鉴定，在石英砂过滤、活性炭过滤和精滤环节均有较高的检出率，说明企业应在这三个环节加强铜绿假单胞菌的风险防控，在控制生产成本的同时加强石英砂、活性炭的清洗效果监测、增加滤膜的更换频率。耐药分析显示所分离到的铜绿假单胞菌的耐药水平要远低于临床分离株，这与铜绿假单胞菌所处的环境不同相关，与国内同行报道基本一致[14]，但仍发现了6株多重耐药菌株，多重耐药铜绿假单胞菌几乎具有目前已知的所有细菌耐药机制，是引起获得性肺炎主要细菌之一，其引起的院内感染治疗难度极大。加强铜绿假单胞菌耐药机制的研究，并加强监测包装饮用水中铜绿假单胞菌的污染现状及其耐药情况，从而保障广大消费群体的饮水安全。
MALDI-TOF MS主要通过细菌蛋白指纹图谱相似性进行聚类分析，操作过程简单，但细菌蛋白表达过程中其丰度会受到培养时间、培养基等因素的影响，从而使得MALDITOF MS同源性分析结果具有不稳定性，因此MALDI-TOF MS进行同源性分析具有一定局限性，目前没有制定统一的质谱标准化操作流程，实验结果的重复性和可靠性未得到不同实验室的验证，尚难以准确定论MALDI-TOFMS同源性分析能力。后续需进一步进行16S测序分析及PFGE分型来进行确证。
[1]李莉，朱晓露，马会会.桶装饮用水中铜绿假单胞菌的检测分析[J].中国卫生检验杂志，2016，26（3）：409-410.
[2]魏磊，吴清平，张菊梅，等.矿泉水和山泉水中铜绿假单胞菌污染调查及分离菌株毒力基因与耐药性分析[J].微生物学通报，2015，42（1）：125-132.
[3]FRANK D W.The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa[J].Mol Microbiol,1997,26(4)：621-629.
[4]AUJOULAT F,LEBRETON F,ROMANO S,et al.Comparative diffusion assay to assess efficacy of topical antimicrobial agents against Pseudomonas aeruginosa in burns care[J].Ann Clin Microbiol Antim,2011,10(27)：1-10.
[5]廖振宇，曹东丽，张华，等.我国包装饮用水行业发展现状及存在的问题[J].食品安全质量检测学报，2017，8（3）：737-741.
[6]刘小根，许春兰，金元宝.包装饮用水中铜绿假单胞菌检验析释[J].食品界，2017（12）：134-135.
[7]张晓丽.（瓶）桶装饮用水中铜绿假单胞菌污染情况分析[J].低碳世界，2017（22）：18-19.
[8]胡燕玲，康雪璐.市售饮用纯净水微生物污染状况检测与分析[J].佛山科学技术学院学报（自然科学版），2014，32（4）：80-82.
[9]陈松，李红，李德华，等.桶装饮用水中铜绿假单胞菌污染情况分析[J].现代预防医学，2015，42（6）：1129-1130，1135.
[10]FUENTEFRIA D B,FERREIRA A E,CORÇÃO G.Antibiotic-resistant Pseudomonas aeruginosa from hospital wastewater and superficial water：Are they genetically related?[J].J Environ Manag,2011,92(1)：250-255.
[11]NAGAVENIS,RAJESHWARIH,OLIA K,et al.Widespread emergence of multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa isolated from CSF samples[J].Ind J Microbiol,2011,51(1)：2-7.
[12]闫芳，隋英杰，孙静，等.桶装饮用水污染引起学生食物中毒的调查分析[J].中国卫生检验杂志，2011，21（8）：2082-2084.
[13]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB 8537—2008饮用天然矿泉水[S].北京：中国标准出版社，2008.
[14]周臣清，张娟，黄宝莹，等.广州市售瓶（桶）装水中铜绿假单胞菌污染现状及其耐药现象研究[J].中国酿造，2017，36（12）：168-171.
[15]李春辉.MDR、XDR、PDR多重耐药菌暂行标准定义—国际专家建议[J].中国感染控制杂志，2014，13（1）：62-64.
[16]JONES R N.Microbial etiologies of hospital-acquired bacterial pneumonia and ventilator-associated bacterial pneumonia[J].Clin Infect Dis,2010,51(S1)：S81-87.
[17]DING C,YANG Z,WANG J,et al.Prevalence of Pseudomonas aeruginosa and antimicrobial-resistant Pseudomonas aeruginosa in patients with pneumonia in mainland China：a systematic review and meta-analysis[J].Int J Infect Dis,2016,49：119-128.
[18]WATERS V,ZLOSNIK JE,YAUY C,etal.Comparison of three typing methods for Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2012,31(12)：3341-3350.
[19]SUZUKI M,YAMADA K,AOKI M,et al.Applying a PCR-based open-reading frame typing method for easy genotyping and molecular epidemiological analysis of Pseudomonas aeruginosa[J].J Appl Microbiol,2016,120(2)：487-497.
[20]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 8538—2016食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法[S].北京：中国标准出版社，2016.