枸杞（Lycium chinense Mill.）属茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium）落叶灌木[1]。全世界的枸杞约有80多种，多数种分布在南、北美洲；在我国大部分地区均有种植，其中以宁夏中宁枸杞最为出名，是枸杞中的精品。现代科学测试分析和临床试验证明，枸杞富含枸杞多糖、多种氨基酸、类胡萝卜素、维生素及矿物质，具有提高免疫力，抗癌，抗疲劳、辐射，耐缺氧，降血糖、血压、血脂，延缓衰老，治疗艾滋病和养颜美容等多种特效功能[2-3]。
果酒因酒精度低、健康闻名，被年轻人群所喜爱。近年来，已有研究者对适宜酿酒的水果（如苹果、香蕉、芒果等）进行了果酒酿造研究[1]。以枸杞为原料酿造的果酒，酒精度低，酒质柔和爽口，果香味浓，营养价值高，基本保持了枸杞的天然营养成分，并且富含人体所需的各种氨基酸，多种维生素及矿物质，是酒品中具有很大发展潜力的酒种[4]。
低温发酵可以延长发酵的时间，更能充分提取枸杞中的各类功能性因子和营养成分，还可以最大程度的保留枸杞清香典雅的果香，使其不被高温破坏，并且使各种杂菌对枸杞果酒可能带来的干扰和影响降至最低[5]。与枸杞本身相比，枸杞果酒不仅保留了原果实中特有的营养成分，且具有浓郁的枸杞香、酒香，味道酸甜可口，酒精度低，是滋补保健良品[6]。目前，关于枸杞果酒的研究多集中于营养成分变化[7-10]和生产工艺方面[11-13]。倪志婧等[14]探究了宁夏枸杞果酒最佳酿造工艺条件，生产的果酒果香浓郁，营养丰富。而有关枸杞果酒风味方面的研究报道较少。
本试验以宁夏枸杞汁为原料，以感官评价为考察指标，利用单因素试验与正交试验优化枸杞果酒的发酵工艺，同时采用顶空固相微萃取-气质联用技术（headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer，HS-SPME-GC-MS）对枸杞果酒中挥发性风味物质进行定性定量分析，以期为枸杞果酒的实际生产与应用提供科学的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
枸杞汁：宁夏杞源堂生物有限公司；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：中国普通微生物菌种保藏管理中心（China general microbiological culture collection center，CGMCC），菌株编号CGMCC 16558；白砂糖（食品级）：北京糖泰宗科技有限公司；氢氧化钠、盐酸、氯化钠、无水乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
YXQ-LS-75SⅡ型灭菌锅：上海东亚压力容器制造有限公司；UVmini-1240型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；TGL-16B高速离心机：上海安亭科学仪器厂；顶空固相微萃取装置（SPME手柄、50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头）：美国Supelco公司；Agilent 7890A/5975CGC-MS联用仪、Agilent HP-5色谱柱（60 m×0.25 mm×0.5μm）：美国安捷伦公司；IT-09A恒温磁力加热搅拌器：上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 枸杞果酒工艺流程及操作要点
操作要点：从斜面上挑取一环酿酒酵母接种到酵母培养基中，200 r/min、28℃恒温培养至OD600 nm值为0.8～1.0；添加白砂糖、柠檬酸调节枸杞汁糖度、pH至一定值，煮沸灭菌20 min；将活化的菌种以一定量接入已冷却的枸杞汁中；静置于18℃培养箱中恒温发酵一段时间，收集发酵液，5 000 r/min离心10 min；分装，巴氏杀菌，4℃保藏。
1.3.2 枸杞果酒发酵工艺优化单因素试验
（1）初始pH值对枸杞果酒品质的影响
将枸杞汁初始糖度调至12%，分别调节初始pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，酵母添加量为0.5%，将其置于18 ℃恒温培养箱中培养发酵7 d，发酵结束后，5 000 r/min离心10 min，取上清液，巴氏杀菌，进行感官评定。
（2）糖度对枸杞果酒品质的影响
将枸杞汁初始pH值调至5.0，分别调节初始糖度为8%、10%、12%、14%、16%，酵母添加量为0.5%，将其置于18℃恒温培养箱中培养发酵7 d，发酵结束后，5 000 r/min离心10 min，取上清液，巴氏杀菌，进行感官评定。
（3）发酵时间对枸杞果酒品质的影响
将枸杞汁初始糖度调至12%，初始pH值调至5.0，酵母添加量0.5%，将其置于18℃恒温培养箱中分别培养发酵5 d、6 d、7 d、8 d、9 d，发酵结束后，5 000 r/min离心10 min，取上清液，巴氏杀菌，进行感官评定。
（4）酵母接种量对枸杞果酒品质的影响
将枸杞汁初始糖度调至12%，初始pH值调至5，酵母接种量分别为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%，将其置于18℃恒温培养箱中培养发酵7 d，发酵结束后，5 000 r/min离心10 min，取上清液，巴氏杀菌，进行感官评定。
1.3.3 枸杞果酒发酵工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，分别选择初始pH值（A）、酵母添加量（B）、发酵时间（C）、初始糖度（D）为评价因素，每个因素选择3个水平，以感官评价为考察指标，选用L9（34）正交试验设计来优化枸杞果酒发酵工艺条件，正交试验因素与水平见表1。
表1 枸杞果酒发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for gojifruit wine fermentation conditions optimization
水平 A初始pH值 B酵母接种量/% C发酵时间/d D初始糖度/%1 2 3 4.0 5.0 6.0 0.3 0.5 0.7 6 7 8 12 14 16
1.3.4 测定方法
（1）质量指标
酒精度、总糖、总酸、干浸出物：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[15]；可溶性固形物：采用手持折光仪测定。
细菌菌落总数：参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》[16]；大肠菌群数：参照GB 4789.3—2016《食品微生物学检验大肠菌群测定》[17]；致病菌检测：参照GB 29921—2013《食品中致病菌限量测定》[18]。
（2）感官评价[19]
挑选9名（4女5男）在枸杞果酒行业从业5年及以上的专业人员作为评定人员，年龄在30～40岁。试验在宁夏杞源堂生物工程有限公司的标准品酒室完成。品评杯具为透明郁金香酒杯，样品随机放置。品评者分别从色泽、香气、口感及状态方面对样品打分，满分100分。具体感官评价标准见表2。
表2 枸杞果酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of gojifruit wine
感官指标 优 良 中 差色泽（20分）香气（20分）口感（40分）状态（20分）酒体呈金黄色，带有红色调，或显橙红，澄清透明有光泽悦目协调（17～20分）有浓郁的枸杞果香和酯香，微带醇香（17～20分）口味微甜，酸度适口，口感润滑稠厚（35～40分）不浑浊无沉淀物（17～20分）酒体呈琥珀色，澄清透明（14～16分）有淡淡的枸杞果香，酯香不显著，味微带醇香（14～16分）风味柔和，酸甜可口（30～34分）有少量沉淀物，轻微分层（14～16分）酒体呈琥珀色，失光（10～13分）原果香较淡，酯香不明显，醇香压过酯香（10～13分）酸甜较可口（25～39分）有大量沉淀物无分层（10～13分）严重褐变失光，酒体暗黄（＜10分）无果香有异味（＜10分）糖酸比失调（＜25分）严重浑浊（＜10分）
（3）枸杞果酒中挥发性化合物分析[20]
样品制备及分析：取5 mL样品置于20 mL螺口顶空样品瓶，加1 g氯化钠，放入磁性转子，样品在恒温磁力搅拌器中40℃平衡30 min，将萃取头插入瓶内顶空吸附30 min。萃取后将萃取头插入GC-MS系统进样口，250℃解吸8 min，同时进行数据采集。
气相色谱条件：色谱柱为AgilentCP-Wax（60 m×0.25mm×0.5μm）；进样口温度为250℃，不分流；载气为氦气（He），流速1 mL/min；升温程序为起始50℃维持1 min，按照3℃/min的速度升至220℃维持5 min。
质谱条件：电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，扫描范围 20～450 m/z；离子源温度230℃；四级杆温度150℃。
挥发性物质分析：化合物经计算机检索，与美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）谱库相匹配，并分析可能属于枸杞果酒的风味物质，取匹配度≥80%的组分；同时采用峰面积归一化法计算各挥发性风味物质的相对百分含量。
2 结果与分析
2.1 枸杞果酒发酵条件优化
2.1.1 初始pH值对枸杞果酒品质的影响
图1 初始pH值对枸杞果酒的影响
Fig.1 Effect of initial p H on gojifruit wine
由图1可知，不同初始pH值的枸杞汁发酵出的枸杞果酒感官评价差异较大，枸杞果酒的感官评分随初始pH值的增大呈先增大后减小的趋势；初始pH值过高或过低都不利于酿酒酵母的生长繁殖以及发酵，发酵效果不佳，以至于感官评价分值低，初始pH值为5.0时枸杞果酒的感官评价值为93分，酒体呈红色调，澄清透明，有浓郁的酒香和果香，酸甜可口。因此，选择初始pH值为5.0进行后续试验。
2.1.2 初始糖度对枸杞果酒品质的影响
图2 初始糖度对枸杞果酒的影响
Fig.2 Effect of initial sugar content on gojifruit wine
由图2可知，枸杞果酒的感官评分随初始糖度的增大呈先增大后减小的趋势；可能是酵母菌生长繁殖消耗部分糖，进而糖度较低发酵得到的酒精度较低，感官评价分值较低，而糖度较高会影响酿酒酵母的生长繁殖，糖利用不完全导致口感较差；在初始糖度为14%时，枸杞果酒感官评分最高为93分，酒体呈金黄色，澄清透明，有浓郁的酯香，酸甜较可口。因此，选择初始糖度为14%进行后续试验。
2.1.3 发酵时间对枸杞果酒品质的影响
由图3可知，枸杞果酒的感官评分随着发酵时间的延长呈先增大后减小的趋势；发酵7 d和8 d条件下枸杞果酒感官评价分值较高，发酵第5 d和第6 d分值相对较低，故判断发酵成熟阶段可能在7～8 d；第9 d感官评价分值降低可能是由于发酵体系中营养物质减少，酵母菌进入衰减阶段，菌体沉降死亡，酒体中溶入菌体内容物而影响感官评价值。发酵7 d时枸杞果酒感官评价分值均为91分，酒体呈琥珀色，澄清透亮，酯香浓郁，带有醇香。因此，选择发酵时间为7 d进行后续试验。
图3 发酵时间对枸杞果酒的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on gojifruit wine
2.1.4 酵母接种量对枸杞果酒品质的影响
由图4可知，枸杞果酒的感官评分随酵母接种量的增大呈先增大后减小的趋势；酿酒酵母接种量太高或太低均不利于枸杞果酒的发酵；接种量为0.1%时枸杞果酒感官评价分值最低，可能由于酵母菌接种量少，发酵能力差，产生酒精较少，感官评价分值较低，而接种量为0.9%时枸杞果酒感官评价分值也偏低，可能是酵母菌生长繁殖消耗大量糖，在酒精发酵阶段糖的不足导致发酵效果不佳，从而影响感官评价分值；酵母菌接种量为0.5%时枸杞果酒感官评分最高为92分，酒体呈红色调，澄清透明，有浓郁果香和酯香，口味微甜，酸度适合。因此，选择酵母接种量为0.5%进行后续试验。
图4 酵母接种量对枸杞果酒的影响
Fig.4 Effect of yeast inoculum on gojifruit wine
2.2 枸杞果酒发酵工艺条件优化正交试验分析
枸杞果酒发酵工艺条件优化正交试验结果与分析见表3。由表3可知，发酵的最大影响因素是初始糖度（D），其次依次是初始pH值（A）和发酵时间（C），酵母添加量（B）影响最小。最佳发酵工艺组合为A 3B3C3D3，即初始pH值为6.0，初始糖度为16%，发酵时间为8 d，酵母接种量为0.7%。在此条件下，枸杞果酒的感官评分为96分。
表3 枸杞果酒发酵工艺条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal test for fermentation conditions optimization of gojifruit wine
试验号 A B C D 感官评分/分123456789k1k2k3R 111222333 123123123 123231312 123312231 78 86 80 92 95 84 91 83 88 58.5 61.5 64.5 2.0 60.9 61.5 62.1 0.4 58.5 61.5 64.5 2.0 56.5 61.5 63.5 3.5
2.3 枸杞果酒中挥发性化合物分析
枸杞果酒中的挥发性物质与枸杞汁本身及酵母发酵产生的代谢物有关。酵母菌不同接种量和糖度及接种时间的差异都会导致代谢物的差异。所检测到的质谱数据经过NIST标准谱库检索后，获得样品挥发性化合物的种类及相对含量，结果见表4。
表4 枸杞果酒中挥发性化合物分析
Table 4 Analysis of volatile flavor components in gojifruit wine
种类 序号 化合物 相对含量/%醇酯酸1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23异戊醇苯乙醇正辛醇2-乙基-1-己醇十二烷醇乙酸庚酯辛酸乙酯三甲基甲硅烷基酯2-苯乙基酯癸酸异丙酯9-癸烯酸乙酯癸酸乙酯9-十六碳烯酸乙酯月桂酸乙酯庚酸乙酯异丙基丙酯棕榈酸乙酯己酸丁酸辛酸十八烷酸癸酸十三酸23.60 6.05 0.14 1.17 1.54 0.09 16.53 1.22 5.90 1.04 2.77 7.04 1.29 3.38 1.33 0.21 1.16 0.64 0.36 9.84 0.13 4.31 0.18
续表
种类 序号 化合物 相对含量/%醛酮萜类其他24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40乙酸肉豆蔻酸棕榈酸顺式-十八碳烯酸苯甲醛邻苯二甲醛2-己烯二乙缩醛4-羟基-3-甲基苯乙酮2-环戊烯-1-酮雄甾-5-烯-3,7-二酮氧化香芹酮橙花叔醇合金欢醇十六烷三甲基甲硅烷基醚α-d-6,3-呋喃糖α-d-吡喃葡萄糖苷2.05 0.16 0.06 0.07 0.09 1.04 0.04 1.06 0.04 0.07 1.33 1.14 0.96 0.74 0.07 1.08 0.04
由表4可知，对枸杞果酒的香气成分进行了定性分析，共鉴定出40种香气成分，其中酯类物质12种（40.59%），醇类物质5种（30.50%），酸类物质10种（17.80%），醛酮类物质7种（3.60%）；相对含量较高的为醇类和酯类，共占总挥发性成分的71.09%。相对含量较高的香气成分为异戊醇（23.60%）、辛酸乙酯（16.53%）、辛酸（9.84%）、苯乙醇（6.05%）、癸酸乙酯（7.04%）、2-苯乙基酯（5.90%）、癸酸（4.31%）[21-22]。
2.4 枸杞果酒质量指标
2.4.1 理化指标
表5 枸杞果酒理化指标
Table 5 Physical and chemical indicators of gojifruit wine
指标 酒精度/%vol干浸出物/（g·L-1）含量 6.28±0.21 8.33±0.32 5.31±0.14 8.0±0.09 33.22±0.52残糖（葡萄糖计）/（g·L-1）总酸（柠檬酸计）/（g·L-1）可溶性固形物/%
由表5可知，枸杞果酒理化指标符合国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。
2.4.2 微生物指标
枸杞果酒细菌总数≤50 CFU/mL；大肠菌群＜3 MPN/100 mL；致病菌：未检出。
3 结论
本研究通过单因素和正交试验，确定了最佳枸杞果酒发酵条件为酵母添加量0.7%，初始糖度16%，初始pH值6.0，18℃条件下静置发酵8 d，在此优化条件下，枸杞果酒的感官评分为96分，酒精度为6.28%vol，残糖量为8.33 g/L；此时酒体呈金黄色，带有红色调，有淡淡的枸杞果香，酸甜可口，经检测分析，产品符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。同时通过HS-SPME-GC-MS技术分析枸杞果酒中挥发性风味物质，枸杞果酒中相对含量较高的为醇类和酯类，共占总挥发性成分的71.09%，在发酵过程中醇类和酯类对枸杞果酒的香味有一定的积极作用。
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