发酵辣椒是一种颇具特色的调味品，既保留了鲜辣椒原有的色泽、脆度、辣味和形态，又具有发酵制品[1]特有的浓郁香气[2]、风味，同时有促进食欲、帮助消化、抗氧化、抑菌、抗动脉粥样化[3]以及预防支气管炎等功能[4]。但如今发酵辣椒产业受到产品质量不稳定及后续保藏技术的限制，使用抽真空、热杀菌或添加防腐剂等某一种方法单独处理发酵辣椒时，虽然可以达到保藏的目的，但强度较大，会导致发酵辣椒特有的风味及口感变差，而使用栅栏技术（hurdle technology，HT）就可以在保藏发酵辣椒的同时保证其品质。
栅栏技术这个概念最初是由德国肉类研究中心专家LEISTNER提出，是一套科学的、系统的将多种技术结合在一起的提高产品货架期的综合保藏方法[5]。造成食品发生腐败变质的重要原因是由食品中的微生物（包含腐败菌和致病菌）的生长繁殖、酶促和非酶促等生化反应引起的，将对食品品质有影响的栅栏因子单独或者联合后形成特殊的栅栏应用到食品中，不但对微生物生长起到控制作用，而且能使引起食品发生氧化变质的酶类物质失活，从而防止了食品的腐败变质，降低了对食品的危害性，提高了食品的稳定性和卫生安全性，即栅栏技术。国内外有关研究多集中在肉及肉制品、水产品、果蔬等方面[6]，而有关栅栏技术在发酵辣椒保藏方面的研究却鲜见报道。本试验将栅栏技术应用到发酵辣椒的保藏中，通过控制食品保藏中的关键栅栏因子以及多因子的综合控制来解决发酵辣椒的保藏问题，同时保证其品质。
1 材料与方法
1.1.1 材料与菌种
新鲜辣椒、大蒜、生姜：市售；食盐（食品级）：四川久大制盐有限公司；白酒（食品级）：北京红星股份有限公司；复合菌剂（植物乳杆菌乳杆菌属亚种（Lactobacillus plantarum subsp.lactobacillus）R-2，植物乳杆菌片球菌属亚种（Lactobacillus plantarum subsp.pediococcus）R-4，菌种比例为R-2∶R-4=2∶1）：贵州大学发酵工程与生物制药省级重点实验室。
1.1.2 培养基
（1）MRS培养基：蛋白胨10.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸钠5.0 g，酵母膏5.0 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，牛肉膏10.0 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，K 2HPO4 2.0 g，吐温80 1.0 mL，柠檬酸氢二铵2.0 g，蒸馏水1 000 mL，调节pH值至6.2～6.4，固体培养基需加琼脂18.0 g，121℃灭菌15～20 min。
（2）平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基：酵母浸膏2.5 g，琼脂15.0 g，胰蛋白胨5.0 g，葡萄糖1.0 g，蒸馏水1 000 mL，调节pH值至7.0±0.2，121℃灭菌15 min，灭完菌后可放于（46±1）℃恒温水浴箱中保温。
1.1.3 试剂
Nisin：河南安锐生物科技有限公司；脱氢乙酸钠（食品级）：大伟生物工程有限公司；0.1 mol/L NaOH标准滴定溶液：国家标准溶液中心。
1.2 仪器与设备
DZ（Q）400真空（充气）包装机：上海兆发机械有限公司；XK97-A菌落计数器：姜堰市新康医疗器械有限公司；DZKW-4电子恒温水浴锅：上海科析试验仪器厂；FA2004B电子天平：上海越平科学仪器有限公司；LS-1F型净化工作台：上海索普仪器有限公司；XFS-280A手提式蒸汽灭菌器：浙江新丰医疗器械有限公司；SPX-250B-G型光照培养箱：上海博讯实业有限公司。
1.3 方法
1.3.1 发酵辣椒的制作
将鲜辣椒、姜和蒜洗净、切分、装坛，辣椒与盐水的比例为1∶2，盐水浓度为4%，在发酵温度28℃，复合发酵菌剂配比为R-2∶R-4=2∶1，接种量为4%，发酵时间48 h的发酵工艺条件下将辣椒发酵成熟后，用复合袋盛装100 g辣椒。
1.3.2 模拟加速试验
通常在食品中运用的加速方法主要有：温度的提高、光照和湿度的增加等。本试验主要通过提高样品的保藏温度，将样品包装后放置于37℃的恒温光照培养箱中培养，从而加快样品中的反应速度和腐败速度[8]。
1.3.3 单因子栅栏对发酵辣椒保藏性影响的研究
（1）真空度对发酵辣椒保藏性影响的研究
分别在真空度0.04 MPa、0.06 MPa、0.08 MPa、0.09 MPa、0.092 MPa（抽真空时间分别为3 s、5 s、10 s、30 s、50 s）条件下密封发酵辣椒，在37℃保温7 d进行加速试验，加速试验后测定菌落总数、总酸度并结合感官确定最佳真空度。
（2）脱氢乙酸钠对发酵辣椒保藏性影响的研究[9-10]
选取脱氢乙酸钠的添加量分别为0.005%、0.010%、0.020%、0.030%。在1.3.3确定的真空度条件下抽真空包装，加速试验后测定菌落总数、总酸度并结合感官确定脱氢乙酸钠的最适添加量。
（3）Nisin对发酵辣椒保藏性影响的研究
选取Nisin添加量分别为0.005%、0.010%、0.015%、0.020%。在1.3.3确定的真空度条件下抽真空包装，加速试验后测定菌落总数、总酸度并结合感官确定Nisin的最适添加量[11]。
（4）巴氏杀菌对发酵辣椒保藏性影响的研究
在1.3.3确定的真空度条件下抽真空包装后，分别在水浴70 ℃、80 ℃条件下进行5 min、10 min、15 min、20 min的巴氏杀菌处理，加速试验后测定菌落总数、总酸度并结合感官来确定辣椒的最佳杀菌条件。
1.3.4 栅栏因子的正交优化试验
在单因素试验的基础上，以脱氢乙酸钠添加量（A）、Nisin添加量（B）、杀菌温度（C）和杀菌时间（D）栅栏因子为试验因素，采用L9（34）正交表对影响发酵辣椒保藏的栅栏因子进行优化，因素与水平表见表1。
表1 发酵辣椒保藏条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for preservation conditions optimization of fermented chilli
水平 A脱氢乙酸钠添加量/%D杀菌时间/min-1 B Nisin添加量/%C杀菌温度/℃0 1 0.010 0.020 0.030 0.010 0.015 0.020 75 80 85 10 15 20
1.3.5 测定方法
菌落总数：按照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》规定的平板计数法测定[12]，试验结果以菌落总数（CFU/g）表示。
总酸度的测定：根据GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》[13]，选用pH电位法测定辣椒中总酸的含量。根据酸碱中和的原理，用标定好的NaOH溶液滴定试样中的酸，当溶液的电位发生突跃时，即是滴定终点，以NaOH的消耗量计算出试样中的总酸含量。总酸度计算公式如下：
式中：总酸度以乳酸计，g/100 g；C为已知NaOH标准溶液的浓度，mol/L；V为滴定时消耗NaOH标准溶液的用量，mL；K为换算系数，其中乳酸的换算系数为0.09；F为试液的稀释倍数；M为试样的质量，g。
感官评分标准：乳酸发酵辣椒在保藏期间的感官评分标准见表2。
表2 发酵辣椒的感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standard of fermented chili
评价项目 评价标准 分值/分色泽（25分）香气（25分）滋味（25分）外观（25分）具有发酵辣椒的正常色泽，没有变暗变褐现象色泽不鲜亮，暗红色，没有变褐现象有变色现象，发生褐变具有发酵辣椒特有的香气，气味正常发酵辣椒特有的香气不明显，气味正常气味不正常味道纯正，和保藏前没有差异，无异味和保藏前有轻微差别，但无异味和保藏前有较大差别，有异味袋形紧缩，辣椒紧贴包装袋，无胀袋现象袋形有轻微松散，辣椒紧贴包装袋，无胀袋现象有胀袋现象，包装袋鼓起21～25 11～20 0～10 21～25 11～20 0～10 21～25 11～20 0～10 21～25 11～20 0～10
2 结果与分析
2.1 单因子栅栏对发酵辣椒保藏性的影响
2.1.1 真空度对发酵辣椒保藏性的影响
真空度对发酵辣椒保藏性的影响结果见表3。
表3 真空度对发酵辣椒保藏性的影响
Table 3 Effect of vacuum degree on the preservability of fermented chilli
项目 真空度/MPa 0.04 0.06 0.08 0.09 0.092菌落总数对数值（lg CFU·g-1）感官评分/分总酸度/%5.72±0.054 5.52±0.03 5.04±0.055 4.77±0.064 4.64±0.028 15±0.43 1.2±0.006 7 18±0.36 1.2±0.005 8 41±0.87 1.2±0.007 3 57±0.96 1.2±0.005 9 58±0.92 1.2±0.006 1
由表3可知，随着真空度的不断增加，氧气含量不断减少，菌落总数逐渐下降，这说明在氧气含量低的条件下，微生物的生长繁殖受到一定的抑制作用，在较高真空度条件下的包装有利于抑制样品中微生物的生长繁殖。当真空度≤0.06 MPa时，产品发生严重的褐变，真空度为0.08 MPa时发生轻微的褐变，当真空度≥0.09 MPa时，没有发生褐变。发生褐变的原因是在较低的真空度条件下，由于环境中的氧化还原电势较高而使辣椒中的多酚类物质发生褐变，抽真空能减少包装袋中氧气含量而降低氧化还原电势以及减缓氧化反应的速度，从而可以有效的防止辣椒发生褐变。由表3可知，不同的真空度对辣椒的后发酵并没有达到有效的控制，使酸度从发酵成熟后的0.82%增加至1.2%。由于在0.09 MPa和0.092 MPa时不仅菌落总数相差不大，都在一个数量级，而且在感官评定上相差也不大，且缩短了包装所用的时间，提高了效率，故选择0.09 MPa的真空度进行包装。
2.1.2 脱氢乙酸钠对发酵辣椒保藏性的影响
脱氢乙酸钠添加量对发酵辣椒保藏性的影响结果见表4。
表4 脱氢乙酸钠添加量对发酵辣椒保藏性的影响
Table 4 Effect of sodium dehydroacetate addition on the preservability of fermented chilli
项目 脱氢乙酸钠添加量/%0 0.005 0.010 0.020 0.030菌落总数对数值（lg CFU·g-1）总酸度/%感官评分/分4.77±0.054 4.63±0.051 3.98±0.057 3.36±0.043 3.10±0.043 1.21±0.0067 57±0.91 1.20±0.0052 60±1.38 1.10±0.0061 69±1.21 1.03±0.005 76±1.47 0.97±0.0049 78±1.12
由表4可知，脱氢乙酸钠对产品的后发酵有一定的控制作用，随着添加量的增加，可以比较明显的抑制酵母菌、霉菌、细菌等微生物的继续发酵，但是仍不能完全有效的控制；随着脱氢乙酸钠添加量的增加，菌落总数呈下降的趋势，脱氢乙酸钠在一定程度上可以抑制微生物的生长繁殖。当脱氢乙酸钠的添加量＞0.02%后，抑菌效果、感官评分增加不明显，因此，选择脱氢乙酸钠的添加量为0.02%。
2.1.3 Nisin对发酵辣椒保藏性的影响
Nisin添加量对发酵辣椒保藏性的影响结果见表5。
表5 Nisin添加量对发酵辣椒保藏性的影响
Table 5 Effect of nisin addition on the preservability of fermented chilli
项目 Nisin添加量/%0 0.005 0.010 0.015 0.020菌落总数对数值（lg CFU·g-1）总酸度/%感官评分/分4.77±0.054 1.21±0.006 57±0.91 4.26±0.031 1.10±0.005 65±0.92 3.62±0.052 1.05±0.005 70±1.32 3.3±0.046 1.02±0.004 74±0.54 3.12±0.038 0.97±0.004 77±0.66
由表5可知，结合酸度和感官可以看出，Nisin对后发酵有一定的抑制作用，随着添加量的增加，可以比较明显的抑制细菌等微生物的继续发酵，但是还不能完全有效的控制；随着Nisin添加量的增加，菌落总数呈下降的趋势，Nisin在一定程度上可以抑制微生物的生长和繁殖。当Nisin的添加量＞0.015%后，抑菌效果、感官评分增加的不明显，因此，选择Nisin的添加量为0.015%。
2.1.4 巴氏杀菌对发酵辣椒保藏性的影响
巴氏杀菌对发酵辣椒保藏性的影响结果见表6。
由表6可知，相同杀菌时间下，80℃的菌落总数均＜70℃的菌落总数，可以看出杀菌温度越高、杀菌时间越长，产品菌落总数越低，杀菌效果越好。其中在70℃加热15 min后，菌落总数都没有明显的下降趋势，当在80℃处理15 min时，菌落总数下降趋势较大，杀菌效果明显。
表6 杀菌温度和时间对发酵辣椒保藏性的影响
Table 6 Effects of sterilization temperature and time on the preservability of fermented chilli
项目温度/℃70 80时间/min菌落总数对数值（lg CFU·g-1）酸度/%感官评分/分5 4.54±0.054 1.21±0.005 4 42±0.9 10 4.41±0.029 1.2±0.006 2 47±0.83 15 3.92±0.038 1.17±0.006 7 48±0.86 20 3.6±0.051 1.08±0.003 7 62±0.12 5 4.08±0.025 1.19±0.005 5 48±0.75 10 3.59±0.055 1.12±0.003 9 63±0.12 15 2.52±0.019 0.98±0.006 3 79±1.25 20 1.86±0.012 0.89±0.003 6 73±1.32
从酸度变化来看，在70℃和80℃条件下处理时，酸度随杀菌的时间延长逐渐降低，但在80℃处理时酸度降低较多，对后发酵有较好的抑制，但是由于高温和长时间的处理对辣椒的风味又有影响，导致80℃处理20 min时其感官评分降低，因此在能控制微生物生长的同时，应尽量降低巴氏杀菌的温度和缩短处理的时间。综合菌落总数、总酸度并结合感官，选择在80℃条件下处理15 min。
2.2 多个栅栏因子的交互作用对发酵辣椒保藏性的影响
表7 发酵辣椒保藏条件优化正交试验结果与分析
Table 7 Results and analysis of orthogonal tests for preservation conditions optimization of fermented chilli
试验号 A B C D菌落总数对数值（lgCFU·g-1）感官评分/分123456789 111222333 123123123 123231312 123312231 2.76 1.48 1.00 1.30 1.54 2.20 1.25 2.00 1.81 93 80 64 69 84 86 73 74 89菌落总数 感官评分k11 k12 k13 R较优水平因素主次1.747 1.680 1.687 0.067 A2 1.770 1.673 1.670 0.100 B3 2.320 1.530 1.263 1.057 C3 2.037 1.643 1.433 0.604 D3 k21 k22 k23 R较优水平因素主次D＞C＞B＞A 79.000 79.667 78.667 1.000 A2 D＞C＞B＞A 78.333 79.333 79.667 1.334 B3 84.667 81.333 76.000 10.666 C1 90.333 80.667 71.000 19.667 D1
从表7和表8可以看出，以菌落总数为评价指标时，最佳方案为A 2B3C3D3，即脱氢乙酸钠的添加量为0.02%，Nisin的添加量为0.02%，杀菌的温度为85℃，杀菌时间为20 min。影响菌落总数的主次因素为C＞D＞B＞A，即杀菌温度对菌落总数的影响最大，其次是杀菌时间和Nisin，影响最小的是脱氢乙酸钠，其中杀菌温度影响非常显著，处理时间影响显著，说明杀菌温度越高，处理时间越长，菌落数越少，对微生物的生长抑制作用越强。
表8 正交试验结果方差分析
Table 8 Variance analysis of orthogonal tests results
注：“*”表示差异显著，P＜0.05；“**”表示差异极显著，P＜0.01。
指标 方差来源 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性菌落总数ABCD总1.000 2.375 226.500 70.375 F0.05=19.000 F0.01=99.000***感官评分和ABCD总和0.008 0.019 1.812 0.563 2.402 1.556 2.889 170.889 581.556 756.89 2 2 2 2 8 2 2 2 2 8 1.000 1.856 109.825 373.750 F0.05=19.000 F0.01=99.000****
当以感官为评价指标时，最佳方案为A 2B3C1D1，即脱氢乙酸钠的添加量为0.02%，Nisin的添加量为0.02%，杀菌温度和时间分别为75℃和10 min，影响感官评分的主次因素为D＞C＞B＞A，即处理时间对感官的影响最大，杀菌温度和Nisin次之，影响最小的是脱氢乙酸钠，其中杀菌温度和时间影响非常显著，说明杀菌温度越高，处理时间越长，对辣椒的风味等感官指标产生了比较严重的影响，使感官评分降低。
根据GB 5009.54—2003《酱腌菜卫生标准》[14]，规定大肠杆菌≤30 MPN/100 g，本试验对大肠杆菌进行检测，没有发现大肠杆菌，而国标并未对菌落总数做出规定，参照其他产品的卫生标准，一般要求菌落总数≤1×103 CFU/g，由于杀菌温度和时间对产品的感官有比较严重的影响，所以在既能抑制微生物生长和控制后发酵的同时，又能保证产品的感官品质，最终将A 2B3C1D1作为最佳栅栏组合，由于在正交试验中没有A 2B3C1D1这项组合，所以补做这组试验，在此条件下做了3次重复试验，取平均值，其试验结果为菌落总数的对数值（lgCFU/g）为2.30，感官评分为95分，总酸度为0.85%。经过该栅栏因子的组合处理后，不仅能抑制微生物的生长，没有胀袋的发生，控制产品的继续发酵，而且能使产品保持较好的感官品质，所以将该组合作为发酵辣椒保藏的最优方案。
3 结论
应用栅栏保藏技术可以很好的解决发酵辣椒的保藏问题，既达到发酵辣椒保藏的目的，又保证了其风味和品质。通过对真空度、脱氢乙酸钠的添加量、Nisin的添加量、杀菌温度和时间进行单因素试验和正交试验，以菌落总数和感官评分为指标，利用极差和方差方法确定了辣椒保藏的优化栅栏因子组合为添加0.02%的脱氢乙酸钠和0.02%的Nisin，抽真空度为0.09 MPa密封后，在75℃的杀菌温度下处理10 min，在此优化条件下，菌落总数的对数值为2.30，感官评分为95分，总酸度为0.85%。经过该栅栏因子组合处理的产品不仅可以抑制保藏期间微生物的生长，控制产品的继续发酵，而且还有利于保证辣椒的感官。
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