纳豆是一种传统的发酵食品，由纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）发酵而成[1]。其具有独特的风味和粘性，含有丰富的营养成分，如蛋白质、氨基酸、纤维素、维生素等。它还包括多种功能成分，如纳豆激酶、异黄酮、超氧化物歧化酶、磷脂、皂甙、亚油酸和亚麻酸等[2-4]，具有降血压、抗血栓和抗肿瘤活性的作用[5-6]。到目前为止，关于纳豆的研究，国外主要集中在菌株的筛选、发酵条件的优化、纳豆香气以及纳豆激酶化学结构和生物活性的改善方面[7-14]。国内主要集中于对纳豆的制作原料[15]、菌种培育[16-17]等方面进行较深入的研究。而关于纳豆芽孢杆菌和其他菌种联合发酵纳豆，改善纳豆风味方面的研究较少[18-21]。
与豆腐和豆浆等其他大豆食品相比，纳豆市场相对较小。此外，纳豆的香气、味道和质地也使它无法成为一种受欢迎的国际大豆食品[22]。纳豆发酵过程由于酶和细菌的作用，大豆中的蛋白质被分解，产生带有氨腥气味的碱性化合物，使得纳豆氨腥气味浓郁，不被我国消费者接受。因此，本研究以市售大豆为原料，采用纳豆发酵粉和乳酸菌粉混合发酵纳豆，并以感官评分、挥发性盐基氮含量和纳豆激酶活力为评价指标，采用正交试验对纳豆发酵工艺进行优化。通过乳酸菌产酸中和纳豆发酵产生的碱性化合物来减弱纳豆的氨腥味（氨腥味以挥发性盐基氮含量表示），对于改善纳豆风味，并促进纳豆在我国的发展具有一定的意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验材料
黄豆：保定人人超市；纳豆发酵粉和乳酸菌粉：北京川秀科技有限公司；商品纳豆（燕京纳豆）：保定市保百超市。
1.1.2 主要试剂
三氯乙酸（分析纯）：南京邦诺生物科技有限公司；硼酸（分析纯）：青岛捷世康生物科技有限公司；氧化镁（分析纯）：上海联迈生物工程有限公司；F8060福林酚（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；酪氨酸（纯度≥99%）、干酪素（纯度92%）：上海源叶生物科技有限公司；无水碳酸钠（分析纯）：上海沪试实验室器材股份有限公司；磷酸二氢钠和磷酸二氢钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；乙醇（分析纯）：南京中淳生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
MBMJ-78A高压蒸汽灭菌锅：北京东西分析仪器科技有限公司；HH2电热恒温水浴锅、Neofuge 15R高速冷冻离心机：上海力申科学仪器有限公司；DHP-9052电热恒温培养箱、DHP-9052电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；752紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 纳豆发酵工艺流程及操作要点
挑选→清洗→室温浸泡→高温高压灭菌→冷却→接种发酵→后熟→成熟纳豆
操作要点：选取无虫害、无霉变、颗粒饱满的黄豆，用清水清洗并充分浸泡，然后在121℃条件下保持20 min，冷却至40℃，按照黄豆质量加入0.2%的纳豆发酵粉和乳酸菌粉，搅拌均匀，置于恒温培养箱发酵24 h，发酵结束后于4℃条件下后熟24 h。
1.3.3 纳豆发酵工艺优化单因素试验
分别研究纳豆芽孢杆菌和乳酸菌菌粉比例（1.0∶0、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、1.0∶4.0、1.0∶6.0）、发酵温度（38 ℃、40℃、42℃、44℃、46℃）、发酵时间（18 h、21 h、24 h、27 h、30 h）对挥发性盐基氮含量、纳豆激酶酶活力和感官评价的影响。每个处理重复3次。
1.3.4 纳豆发酵工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，以菌粉比例（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）为考察指标，感官评分（Y1）、挥发性盐基氮含量（Y 2）和纳豆激酶活力（Y 3）为评价指标，选用正交表L9（34）进行3因素3水平正交试验，确定纳豆发酵条件的适宜组合。正交试验因素与水平如表1所示。
表1 纳豆发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for natto fermentation process optimization
水平 A菌粉比例 B发酵温度/℃ C发酵时间/h 1 2 3 1.0∶1.0 1.0∶1.5 1.0∶2.0 40 42 44 21 24 27
1.3.5 测定方法
挥发性盐基氮：挥发性盐基氮可用来衡量纳豆的氨腥气味，挥发性盐基氮含量越少，氨腥气味越小。参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》进行测定。
感官评价：选择10位经过专业培训的感官鉴评人员，采取盲评模式，从色泽、香气、口感和组织状态4个方面依次对纳豆进行评分，每位评价人员独立完成，试验设计者不参与评分。以豆粒金黄有光泽，几乎无氨腥味且有淡淡清香味，入口湿润且无苦涩味，粘液多，拉丝状态好为最高分（满分10分），总分为各项指标得分之和。最终取10人评分的平均值。为保证评分的准确性，每个试验水平之间需用清水漱口，且每两个试验水平之间需暂停1 min，以避免味觉疲劳。纳豆感官评分标准如表2所示。
表2 纳豆感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standard of natto
感官评分/分 色泽 香气 口感 组织状态2.0～2.5几乎无氨腥味，有淡淡的香味1.5～2.0氨腥味较淡1.0～1.5氨腥味较重0～1.0豆粒呈金黄色，有光泽豆粒呈浅黄色，有光泽豆粒呈暗黄色，无光泽豆粒呈茶褐色，无光泽 有强烈氨腥味无苦涩味，湿润略有苦涩味，较湿润有轻微异味，苦涩味有较重异味，苦涩味粘液多，拉丝状态好粘液较多，拉丝较长粘液较少，拉丝短几乎无粘液，有异物
纳豆激酶活力的测定：参照GB/T 28715—2012《饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定分光光度法》中的Folin-酚法测定纳豆激酶活力。
1.3.6 统计分析方法
分别采用SPSS Statistics 17.0和Origin 8.6对试验结果进行统计分析和作图。
2 结果与分析
2.1 菌粉比例对纳豆品质的影响
菌粉比例对纳豆品质的影响见图1。由图1A可知，当菌粉比例为1.0∶1.5时，纳豆感官评分较高（7.6分），仅比最高分（8.0分）低5.0%。此时，豆粒呈淡黄色，几乎没有氨腥味，粘液丰富，拉丝状态良好。由图1B可知，当菌粉比例为1.0∶1.5时，挥发性盐基氮含量达到最低（12.826 mg/100 g），比单菌发酵所产生的挥发性盐基氮含量降低约58.10%。由图1C可知，当菌粉比例由1.0∶1.0增加至1.0∶4.0时，纳豆激酶活力均比纳豆芽孢杆菌单独发酵时高，其中，在菌粉比例为1.0∶1.5时，纳豆激酶活力达到最高（393.912 U/g），是纳豆芽孢杆菌单独发酵时活力的1.47倍；当菌粉比例为1.0∶6.0时，纳豆激酶活力比单菌发酵略低。这可能是由于在某个比例范围内，乳酸菌对纳豆激酶的表达有促进作用。各指标的组间差异均显著（P＜0.05）。综合上述结果，当菌粉比例为1.0∶1.5时，纳豆激酶活力最高，挥发性盐基氮含量最低，感官评分也相对较高，所以菌粉比例选择1.0∶1.5。
图1 菌粉比例对感官评分（A）、挥发性盐基氮含量（B）及纳豆激酶活力（C）的影响
Fig.1 Effect of bacteria powder ratio on sensory score(A)and volatile basic nitrogen content(B)and nattokinase activity(C)
2.2 发酵温度对纳豆品质的影响
发酵温度对纳豆品质的影响见图2。由图2可知，随着发酵温度的升高，纳豆的感官评分和纳豆激酶活力均呈先上升后下降的趋势，当发酵温度为42℃时，感官评分（7.7分）和纳豆激酶活力（379.602 U/g）最高，挥发性盐基氮含量达到最低值13.358 mg/100 g。各指标的组间差异均显著（P＜0.05）。在一定温度范围内，温度升高会使菌体的代谢速率变快，生长旺盛，各种物质合成迅速。而温度过高时，由于温度不适宜，菌体生长缓慢，合成纳豆激酶量少且酶活被抑制，而且菌体发酵也会产生热量，造成中心温度过高，从而使酶部分失活。综合上述结果，当发酵温度为42℃时，感官评分和纳豆激酶活力都最高，挥发性盐基氮含量最低。所以发酵温度选择42℃。
图2 发酵温度对感官评分（A）、挥发性盐基氮含量（B）及纳豆激酶活力（C）的影响
Fig.2 Effects of fermentation temperature on sensory score(A),volatile basic nitrogen content(B)and nattokinase activity(C)
2.3 发酵时间对纳豆品质的影响
发酵时间对纳豆品质的影响见图3。由图3可知，随着发酵时间的延长，纳豆的感官评分和纳豆激酶活力均呈先上升后下降的趋势，而发酵产物挥发性盐基氮含量越来越多，氨味也越来越重。当发酵时间为24 h时，感官评分及纳豆激酶活力均达到最大，分别为7.8分、379.404 U/g，挥发性盐基氮含量相对较低，为24.036 mg/100 g。各指标的组间差异均显著（P＜0.05）。结果表明，当发酵时间过短时，纳豆芽孢杆菌和乳酸菌可能刚进入稳定期，发酵还未到达最高点；发酵时间过长时，外界环境如pH、氧化还原电势等越来越不适宜，营养物质减少，菌体进入衰亡期，菌体内部酶促反应速率降低。综合上述结果，当发酵时间为24 h时，感官评分和纳豆激酶活力都最高，挥发性盐基氮含量也相对较低。所以发酵时间选择24 h。
图3 发酵时间对感官评分（A）、挥发性盐基氮含量（B）及纳豆激酶活力（C）的影响
Fig.3 Effects of fermentation time on sensory score(A),volatile basic nitrogen content(B)and nattokinase activity(C)
2.4 纳豆发酵工艺优化正交试验
选用正交试验表L9（34）研究菌粉比例（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C）对纳豆品质的影响。正交试验结果与分析见表3，方差分析见表4～6。
表3 纳豆发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for natto fermentation process optimization
试验号 A B C D感官评分/分挥发性盐基氮含量/（mg·100 g-1）纳豆激酶活力/（U·g-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 1 2 3 3 1 2 2 3 1 6.3 7.3 7.5 7.6 7.9 7.2 6.5 6.2 7.1 14.490 17.626 11.902 21.078 11.384 14.912 21.708 18.610 24.836 132.854 244.835 384.196 354.760 394.029 350.135 304.349 280.504 360.286感官评分K1K2K3R挥发性盐基氮K1K2K3R纳豆激酶活力K1K2K3R 21.1 22.7 19.8 0.97 44.018 47.374 65.154 7.045 761.885 1 098.924 945.139 112.346 20.4 21.4 21.8 0.47 57.276 47.620 51.650 3.219 791.963 919.368 1 094.617 100.885 19.7 22.0 21.9 0.77 48.012 63.540 44.994 6.182 763.493 959.881 1 082.574 106.360 21.3 21.0 21.3 0.10 50.710 54.246 51.590 1.179 887.169 899.319 1 019.460 44.097
由表3极差分析可知，考察因素对3个评价指标的影响主次顺序均为A＞C＞B，即菌粉比例＞发酵时间＞发酵温度。以感官评分为评价指标时，最优组合条件为A 2B3C2，即菌粉比例1.0∶1.5、发酵温度44℃、发酵时间24 h；以挥发性盐基氮含量为评价指标时，最优组合条件为A 1B2C3，即菌粉比例1.0∶1.0、发酵温度42℃、发酵时间27 h；以纳豆激酶活力为评价指标时，最优组合条件为A 2B3C3，即菌粉比例1.0∶1.5、发酵温度44℃、发酵时间27 h。
由表4方差分析可知，菌粉比例和发酵时间对感官评分影响均显著（P＜0.05），发酵温度对纳豆感官评分影响不显著（P＞0.05）；由于C2与C3无差异（P＞0.05）。因此，以纳豆感官评分为评价指标，最优组合条件可调整为A 2B y C z（y=1，2，3；z=2，3）。
表4 以感官评分为评价指标的正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis using sensory score as evaluation index
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值校正模型ABC误差0.480 0.703 0.173 0.563 0.010 48.000 70.333 17.333 56.333 0.021 0.014 0.055 0.017总和修正总和2.880 1.407 0.347 1.127 0.020 452.340 2.900 6 2 2 2 2 9 8
表5 以挥发性盐基氮含量为评价指标的正交试验结果方差分析
Table 5 Variance analysis using volatile basic nitrogen content as evaluation index
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值校正模型ABC误差27.952 43.007 7.841 33.010 1.130 24.746 38.074 6.941 29.224 0.039 0.026 0.126 0.033总和修正总和167.715 86.014 15.681 66.020 2.259 2 892.935 169.974 6 2 2 2 2 9 8
由表5方差分析可知，菌粉比例和发酵时间对挥发性盐基氮含量的影响均显著（P＜0.05），发酵温度影响不显著（P＞0.05）；由于A 1与A 2无差异，C1与C3无差异（P＞0.05）。因此，以纳豆挥发性盐基氮含量为评价指标时，最优组合条件可调为整A x B y C z（x=1，2；y=1，2，3；z=1，3）。
表6 以纳豆激酶活力为评价指标的正交试验结果方差分析
Table 6 Variance analysis using nattokinase activity as evaluation index
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值校正模型ABC误差8 607.506 9 490.397 7 696.872 8 635.250 1 782.355 4.829 5.325 4.318 4.845 0.181 0.158 0.188 0.171总和修正总和51 645.037 18 980.794 15 393.743 17 270.500 3 564.710 930 025.767 55 209.747 6 2 2 2 2 9 8
由表6方差分析可知，菌粉比例、发酵温度和发酵时间对纳豆激酶活力影响均不显著（P＞0.05）。因此，以纳豆激酶活力为评价指标时，最优组合条件可调整为A x B y C z（x=1，2，3；y=1，2，3；z=1，2，3）。
综合考虑纳豆感官评分、挥发性盐基氮含量、纳豆激酶活力以及生产成本，本研究确定较适宜的混菌发酵纳豆组合条件为A 2B1C3，即菌粉比例1.0∶1.5，发酵温度40℃，发酵时间27 h。该组合没有在正交试验的9个组合中出现，因此，进行3次平行验证试验，结果表明，在此条件下发酵得到纳豆，其感官评分9.0分，挥发性盐基氮含量为11.022 mg/100 g，纳豆激酶活力为438.90 U/g，此时，纳豆色泽鲜亮，氨臭味明显降低，拉丝状态好。
2.5 对比试验结果
为检测试验效果，从感官评分、挥发性盐基氮含量及纳豆激酶活力3个方面，将混菌发酵纳豆与商品纳豆进行了对比，结果见表7。
表7 混菌发酵纳豆与商品纳豆的比较
Table 7 Comparison between natto fermented with mixed startersand commercially available natto
纳豆激酶活力/（U·g-1）商品纳豆混菌发酵纳豆纳豆种类 感官评分/分挥发性盐基氮/（mg·100 g-1）7.9 9.0 15.352 11.022 327.452 438.900
由表7可知，混菌发酵纳豆的感官评分比市售纳豆高13.92%，挥发性盐基氮含量低28.20%，纳豆激酶活力高34.03%。结果表明，混菌发酵纳豆品质明显优于市售纳豆。
3 结论
通过单因素及正交试验得出，混菌发酵纳豆的最优工艺为：菌粉比例（乳酸菌∶纳豆芽孢杆菌）1.0∶1.5，发酵温度40℃，发酵时间27 h。在此优化条件下，纳豆感官评分为9.0分，挥发性盐基氮含量为11.022 mg/100 g，纳豆激酶活力为438.90 U/g。此时，纳豆色泽光亮，氨臭味明显降低，拉丝状态好，纳豆品质明显优于市售纳豆。本试验在保证纳豆仍有良好保健功能的基础上改善了纳豆的风味，为纳豆在我国的消费起到了积极的推动作用。
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