肌氨酸氧化酶（sarcosine oxidase，SOX）属于黄素蛋白氧化酶类，在自然界中分布广泛。其是酶法测定肌酐中研究较多的一种酶，可催化肌氨酸中的N-甲基氧化，可偶联肌酐酶和肌酸酶降解肌酐。作为一种重要的诊断酶制剂，是测定血清或尿液中肌酐含量的关键酶之一，应用于肾脏的健康程度的诊断[1]。
为了满足工业用酶的需求，赵更锋等[2-9]已从肌氨酸氧化酶的分布、酶学性质以及分子生物学方面进行了大量研究。SUZUKIM[10]最早发现棒状杆菌属（Corynebacterium sp.）可以产肌氨酸氧化酶，随后相继发现假单胞菌（Pseudomonas）、链霉菌（Streptomyces）、芽孢杆菌（Bacillus）和节杆菌（Arthrobacter）等微生物均可产肌氨酸氧化酶[11-16]。但目前依然存在着许多不足之处，如热稳定性普遍较差，使其在一些领域的应用中受到限制。MORIN等[17]从土壤中筛选出一株产单聚体肌氨酸氧化酶的铵镨柱胞霉菌（Cylindrocarpon didymium）M-1，测得该单聚体肌氨酸氧化酶分子质量为48 kDa，最适pH值为7.5，最适温度为40℃，将该酶在45℃处理10 min，残余酶活力为75%。
本研究从渤海海泥中分离、筛选一株高产低温肌氨酸氧化酶菌株，采用形态观察、生理生化试验及分子生物学技术对其进行鉴定，并对其所产的肌氨酸氧化酶酶学性质进行初步研究，为肾脏疾病诊断试剂盒的研发提供优质的菌种资源。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品
海泥样品：辽宁省大连渤海湾（N：39°7′，S：121°41′）。
1.1.2 试剂
肌酸：大连凯美化工工程配套有限公司；脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）纯化试剂盒：大连宝生物有限公司；酵母膏、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碘化钾、淀粉、牛肉膏、胰蛋白胨、氯化钠：生工生物工程（上海）股份有限公司；所有试剂均为国产分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基[18]
富集培养基：肌酸5.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，海水1 L，pH 7.0。
分离培养基：肌酸5.0 g/L，酵母膏5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，碘化钾1.7 g/L，淀粉10 g/L，海水1 L，pH 7.0。
种子培养基：胰蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 10 g/L，海水1 L，pH 7.0。
发酵培养基：肌酸5.0 g/L，酵母膏5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，海水1 L，pH 7.0。
LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L。
以上固体培养基中加入20 g/L琼脂，培养基均在0.1 MPa、121℃条件下高压蒸汽灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
HZP-256全温振荡培养箱：上海智诚分析仪器制造有限公司；CX21FS3显微镜：日本OLYMPUS公司；NB-1630超净工作台、UV-H232可见紫外分光光度计：菲迪康乐（广州）科学仪器有限公司；LDFX-50BI立式压力蒸汽灭菌锅：兰州方盛生物科技有限公司；APL-204电子天平、pH-3G pH计：陕西鼎盛仪器设备有限公司；MBS聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：上海普迪生物技术有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 产肌氨酸氧化酶菌株的筛选
菌株初筛：取大连渤海海湾海泥10 g于100 mL富集培养基中，在20℃、150 r/min条件下振荡培养，每天测肌酸含量。待肌酸完全降解后，富集培养液经10倍梯度稀释至10-6，将稀释液涂布于固体分离培养基，25℃条件下倒置培养24 h，挑取变为蓝绿色的菌落进行分离、纯化。将分离得到的菌株接种到新鲜的分离培养基中，20℃、150 r/min条件下培养72 h，测定肌酸的降解情况。
菌株复筛：将可降解肌酸的菌株接种于发酵培养基中，20℃、150 r/min条件下培养48 h，测定其肌氨酸氧化酶活力。
1.3.2 肌酸降解率的测定[19]
在0.5 mL的样品中，加入1 mL含有1%α-萘酚的1.5 mol/L NaOH、0.5 mL 0.05%的双乙酰，显色30 min，再加入3 mL蒸馏水，于波长530 nm处测定吸光度值。计算肌酸降解率，计算公式如下：
1.3.3 肌氨酸氧化酶活力的测定[19]
将待测菌体进行超声破壁后，于4℃、8 000 r/min条件下离心15 min，取上清酶液0.1 mL于0.9 mL含有0.1 mol/L肌氨酸的焦磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中，37℃反应10 min，再加入0.25 mL 0.1 mol/L的醋酸终止反应，并加入1.5 mL含有0.04%乙酰丙酮的20%乙酸铵溶液，于37℃反应40 min后，在波长410 nm处测定吸光度值。
肌氨酸氧化酶活力定义：在37℃、pH 7.0条件下每分钟分解1μmol肌氨酸的酶量为一个酶活力单位（U）。
1.3.4 菌株的鉴定
形态观察：将试验菌株划线于固体LB平板上，20℃恒温培养24 h，观察菌株的菌落形态特征，并挑取单菌落，进行革兰氏染色，观察菌株的细胞形态。
生理生化试验[20]：对试验菌株进行V-P反应、接触酶反应、硝酸盐还原试验、产生吲哚试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、含碳化合物的利用等试验。
分子生物学鉴定：将试验菌株接种于富集培养基中，20 ℃、150 r/min条件下培养48 h，8 000 r/min离心15 min后弃上清，加入100μL无菌重蒸水（ddH2O）中，混匀，沸水处理10 min，12 000 r/min离心10 min，以上清液为模板对试验菌株的16S rDNA基因序列进行PCR扩增[19]。正向引物为BSF8/20（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）；反向引物为BSR1541/20（5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）。采用DNA纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化，并送至北京诺禾致源生物技术有限责任公司进行测序。将测序结果提交至美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库中，与已知菌种的16S rDNA序列进行BLAST同源性比对，选择若干条同源性较高的模式菌株的16S rDNA序列，采用MEGA 5.0软件中的邻接（neighbor joining，NJ）法构建系统发育树，确定其分类地位。
1.3.5 肌氨酸氧化酶酶学性质的初步研究
最适作用温度：按照肌氨酸氧化酶活力的测定方法，分别在不同作用温度条件下（5～70℃，梯度为5℃），测定肌氨酸氧化酶活力，确定酶的最适反应温度；将同组实验中最高酶活力设为100%，计算相对酶活。
热稳定性：将粗酶液分别在不同温度条件下（25℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）处理60 min，测定酶活力。
最适作用pH：分别在不同pH值条件下（4.0～11.0，梯度为0.5）测定肌氨酸氧化酶酶活力，确定酶的最适反应pH。其中pH 4.0～6.0为0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；pH 6.0～8.5为0.1 mol/L磷酸盐缓冲液；pH 8.5～9.5为0.05 mol/L硼砂-硼酸缓冲液；pH 9.5～11.0为0.05 mol/L硼砂-NaOH缓冲液。
pH稳定性：将粗酶液分别于不同pH值（4.0～11.0，梯度为0.5）的缓冲液中，37℃保温18 h，测定酶活力。
不同金属离子对肌氨酸氧化酶活性的影响：将粗酶液分别加入含有1 mmol/L或10 mmol/L不同金属离子（Co2+、Ca2+、K+、Fe2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+）的溶液中，37 ℃保温30 min，测定酶活力。将未加入金属离子的酶液活力设为100%，计算各组的相对酶活。
2 结果与分析
2.1 产肌氨酸氧化酶菌株的初筛
通过初筛发现，27个菌落周围变成蓝绿色，其中10株菌株（LYH03、LYH09、LYH18、LYH36、LYH44、LYH45、LYH83、LYH106、LYH186、LYH221）可降解肌酸（对照菌株肌酸降解率为4.5%），结果见表1。由表1可知，菌株LYH18降解肌酸的能力最强，培养72 h后，肌酸降解率达75%。
表1 菌株的肌酸降解率
Table 1 Creatine degradation rate of strains
菌株编号 肌酸降解率/% 菌株编号 肌酸降解率/%LYH03 LYH09 LYH18 LYH36 LYH044 54 44 75 58 62 LYH45 LYH83 LYH106 LYH186 LYH221 67 53 66 68 42
2.2 产肌氨酸氧化酶菌株的复筛
将初筛获得的10株菌进行摇瓶发酵，测定其肌氨酸氧化酶活力，结果如表2所示。
表2 菌株产肌氨酸氧化酶的酶活比较
Table 2 Comparison of enzyme activities of sarcosine oxidase produced by strains
菌株编号 LYH03 LYH09 LYH18 LYH36 LYH44 LYH45 LYH83 LYH106 LYH186 LYH221酶活/（U·mL-1）0.15 0.67 1.65 1.02 0.89 1.12 0.85 1.14 1.21 0.18
由表2可知，菌株LYH18的肌氨酸氧化酶活力最高，为1.65 U/mL，与肌酸降解情况一致。因此，选取菌株LYH18为目标菌株，对其进行菌种鉴定。
2.3 菌株的鉴定
2.3.1 形态观察
菌株LYH18的菌落与细胞形态见图1。由图1a可知，菌株LYH18在LB固体培养基上，菌落呈圆形，隆起，表面光滑，湿润，边缘整齐，无色，易挑取；由图1b可知，革兰氏染色呈阳性，在LB固体培养基上生长3 d后形成芽孢，芽孢形状为椭圆形，菌体呈杆状。这些特征表明，菌株LYH18呈现出典型的细菌特征。
图1 菌株LYH18的菌落（a）和细胞（b）形态
Fig.1 Colony(a)and cell(b)morphology of strain LYH18
2.3.2 生理生化鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》（第8版）[21]对菌株LYH18进行生理生化试验，生理生化特征结果见表3。
由表3可知，菌株LYH18在无氧条件下不能生长，接触酶试验呈阳性，V-P反应呈阴性，对氯化钠有较强的耐受性，在10%NaCI条件下能够生长；不能分解酪酛、明胶及淀粉；可将硝酸盐还原为亚硝酸盐；能利用多种碳水化合物，如D-半乳糖、L（+）-鼠李糖、纤维二糖、葡萄糖、蔗糖、松三糖，但不能利用D-木糖、棉子糖和D-甘露糖；不能产吲哚。结合形态观察，根据《常见细菌系统鉴定手册》（第8版）初步鉴定菌株LYH18为芽孢杆菌属（Bacillus）。
表3 菌株LYH18的生理生化特征
Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain LYH18
注：“＋”表示为阳性反应；“-”表示为阴性反应。
项目 结果 项目 结果接触酶V-P反应2%NaCI 5%NaCI 7%NaCI 10%NaCI酪酛水解明胶水解淀粉水解硝酸盐还原+ - + + + + - - - +D-半乳糖L（+）-鼠李糖纤维二糖葡萄糖蔗糖松三糖D-木糖棉子糖D-甘露糖吲哚+ + + + + + - - - -
2.3.3 分子生物学鉴定
为了进一步鉴定分离菌株LYH18，将其16S rDNA序列在GenBank数据库中进行同源性比对。结果表明，菌株LYH18与Bacillus的多个菌种的序列相似性＞97%，采用MEGA5.0软件中的NJ法构建系统发育树，结果如图2。由图2可知，菌株LYH18与海泥芽孢杆菌（Bacillus oceanisediminis）H2同源性（99%）较高，亲缘关系最近。结合形态观察及生理生化试验结果，将菌株LYH18鉴定为海泥芽胞杆菌（Bacillus oceanisediminis）。
图2 基于16S rDNA序列菌株LYH18的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of strain LYH18 based on 16S rDNA sequences
2.4 酶学性质研究
2.4.1 肌氨酸氧化酶的最适作用温度
不同作用温度条件下测定肌氨酸氧化酶活力，结果见图3。由图3可知，当作用温度在10～15℃时，肌氨酸氧化酶的活性随着作用温度的升高而急剧增大；当作用温度为25℃时，肌氨酸氧化酶活力最高；当作用温度在15～45℃时，相对酶活力基本保持在80%以上，说明在室温条件下，该酶即可保持较高酶活，这一特点可节省能源的消耗；当作用温度高于45℃后，酶活性急剧下降；当作用温度高于50℃后，相对酶活＜60%。结果表明，肌氨酸氧化酶的最适作用温度为25℃，该酶对高温条件比较敏感，更适合低温条件。
图3 肌氨酸氧化酶的最适反应温度
Fig.3 Optimal reaction temperature of sarcosine oxidase
2.4.2 肌氨酸氧化酶的热稳定性
肌氨酸氧化酶的热稳定性如图4所示。由图4可知，肌氨酸氧化酶在25～40℃条件下处理60 min后，相对酶活＞80%，保持高酶活性，说明该酶在室温条件下，较稳定；当处理温度高于40℃以后，相对酶活力逐渐下降，符合海洋低温酶的特性[23]；该酶在50℃处理60 min后，相对酶活力急速下降，仅保留30%的相对酶活力；在60℃、70℃处理60 min，相对酶活力均＜10%，说明该酶热稳定性较弱。
图4 肌氨酸氧化酶的热稳定性
Fig.4 Thermal stability of sarcosine oxidase
2.4.3 肌氨酸氧化酶的最适作用pH值
不同作用pH值条件下测定肌氨酸氧化酶活力，结果如图5所示。由图5可知，该肌氨酸氧化酶作用的最适作用pH为8.0，且pH值在7.5～9.0之间时，相对酶活性较高，可保持在80%以上；当pH值≤7.0或≥9.0时，相对酶活性较低。
图5 肌氨酸氧化酶的最适作用pH值
Fig.5 Optimal reaction p H of sarcosine oxidase
2.4.4 肌氨酸氧化酶的pH稳定性
肌氨酸氧化酶的pH稳定性结果如图6所示。由图6可知，该酶在pH值≤6.0时，相对酶活＜40%；在pH值7.0～10.0之间时，酶活可保持在80%以上，较稳定；由此可以得出，在中性至弱碱性条件下，肌氨酸氧化酶活性较高，较稳定，说明该酶耐弱碱性。
图6 肌氨酸氧化酶的pH稳定性
Fig.6 pH stability of sarcosine oxidase
2.4.5 不同金属离子对肌氨酸氧化酶活性的影响
不同金属离子对肌氨酸氧化酶活力的影响见图7。
图7 不同金属离子对肌氨酸氧化酶活性的影响
Fig.7 Effect of different metal ions on sarcosine oxidase activity
由图7可知，不同金属离子对酶的作用不同；同种金属离子在不同终浓度条件下对酶的作用也不同。其中Ca2+、Fe2+、Ni2+、Cu2+能使该酶失活，而K+对酶活性几乎没有影响；Co2+、Zn2+、Mg2+对酶活性有一定促进作用，其中Co2+对酶活性促进作用最强。
3 结论
本研究从渤海湾海泥样品中分离到一株高产肌氨酸氧化酶的菌株LYH18，肌氨酸氧化酶活力为1.65 U/mL。通过形态观察、生理生化分析和分子生物学技术鉴定菌株LYH18为海泥芽胞杆菌（Bacillus oceanisediminis）。经初步探索其产肌氨酸氧化酶的酶学性质，结果表明，该菌株所产的肌氨酸氧化酶的最适作用温度和pH值分别为25℃和8.0，在温度25～40℃和pH 7.0～10.0范围内，酶活性较稳定，该酶属于低温酶类。菌株LYH18作为一株产肌氨酸氧化酶的新菌源，具有潜在的开发价值。
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