随着人民生活水平的提高，人们对身体健康和营养的要求也越来越高。作为具有代表性的乳制品之一，酸奶种类繁多[1]。酸奶的品质受多方面因素影响（如原料、添加剂、发酵剂、发酵温度及时间、贮藏条件等），其中酸奶发酵剂是酸奶产品产酸和产香的基础和决定因素。复合酸奶发酵剂是由多种乳酸菌株共同组成的，这些菌株以不同比例共生在同一个微生态环境体系中，反复着互相促进和拮抗的关系，形成了酸奶的微生物菌群[2]。微生物菌群不同，其产生的代谢活性物质和抗菌物质也不同，直接影响酸奶的质地和风味。刘慧等[3]用复合开菲尔发酵剂制作的成品酸奶较市售酸奶凝乳时间短，组织凝固状态结实，风味较好且口感细腻，酸度适中，且有浓郁的酯香风味。苏敦等[4]用不同发酵特性的2株嗜热链球菌、1株保加利亚乳杆菌和1株嗜酸乳杆菌，通过对单菌和复配菌发酵乳的感官分析，得到了6组优化的含4株菌的发酵剂配方。
保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）是酸奶生产中最常用到的两种乳酸菌菌种[5]。保加利亚乳杆菌具备良好的耐酸性和蛋白质水解特性，可以发酵己糖产生乳酸和一些羰基化合物，如通过丙酮酸代谢产生乙醛，乙醛是酸奶中最具有代表性的芳香物质。保加利亚乳杆菌还可以水解蛋白质为嗜热链球菌提供肽类以供其生长[6]。随着研究不断深入，越来越多的酵母菌属被从以牦牛酸奶为首的各种乳制品中分离检测出来，如开菲尔酸奶[7]、中国酸马奶[8]、西藏曲拉[9]、川西北地区的牦牛酸奶[10]等。酵母菌可消耗对乳酸菌细胞生长有抑制作用的副产物乳酸盐，更利于乳酸菌生长[11-13]。保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的发酵过程对凝结芽孢杆菌有协同和促进成型的作用[14]。干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌是能够耐受有机体的防御机制的益生菌，因而备受关注，将这两种菌应用于酸奶发酵中，能调节肠内菌群平衡且促进人体吸收。
因此，本研究将不同发酵特性的优良菌株进行组合对酸奶进行发酵，以期提升发酵剂的整体性能，为新型酸奶的研究和生产提供理论参考并奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
本研究所用菌株：从自然发酵牦牛酸乳中分离纯化，本实验室保存；开菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefiri）700、酵母菌（Saccharomyces）Y18、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）N14、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）L16、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）GL2、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）GL6。
1.1.2 原料和试剂
纯牛奶：中国蒙牛乳业（集团）股份有限公司；邻苯二甲酸氢钾（分析纯）、L-谷氨酸钠、甲醇（色谱纯）：成都市科龙化工试剂厂；苹果酸标准品、乳酸标准品、乙酸标准品、柠檬酸标准品（均为色谱纯）：北京索莱宝科技有限公司；MRS液体培养基、MRS固体培养基：青岛高科园海博生物技术公司。
1.2 仪器与设备
H2050R台式高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；CT3 25K质构仪：美国Brookfield博勒飞公司；SWCJ-2F洁净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；LC-20A高效液相色谱仪：日本岛津公司；DGG-9140A电热恒温鼓风干燥箱：上海齐欣科学仪器有限公司；YXQ-LS-70A立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；FA2004电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株的活化与冻干粉的制备
将冷冻保存的菌株以6%的接种量接种至液体培养基传3代进行活化，将第3代的菌培养液4000r/min离心10min，弃上清液后，加入0.9%无菌生理盐水多次洗涤，弃上清液，按照菌悬液∶脱脂乳保护剂=10∶1（V/V）的比例向菌泥中加入适量经灭菌处理的脱脂乳保护剂，置于-80℃温度条件下预冷6h后，使用真空冷冻干燥机对其进行冷冻干燥20h，得到各个菌株的冻干菌粉，熔封，置于-20℃温度条件下保藏。
1.3.2 冻干菌粉的活菌计数
参考GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》[15]中菌落总数测定的方法加以调整后测定，对6种菌粉的菌落数进行计数，单位为CFU/g。
1.3.3 酸奶的制备
制作流程：50 mL配料（纯牛奶、8%白砂糖）经杀菌后（95℃、15 min）冷却至室温后倒入相应的菌粉，按照10%接种量进行接种。发酵至凝乳后（发酵温度37℃），放入4℃冰箱中进行后熟。所接菌种组合分别编号为组1（N14∶L16=1∶1）、组2（N14∶L16∶GL2=1∶1∶1）、组3（N14∶L16∶GL6=1∶1∶1）、组4（N14∶L16∶700=1∶1∶1）、组5（N14∶L16∶Y18=1∶1∶1）；用5组发酵剂组合所发酵的酸奶编号分别为组1（LS）、组2（LSGL2）、组3（LSGL6）、组4（LS700）、组5（LSY18），以市售酸奶（TY）为对照。
1.3.4 酸度测定
依照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准乳和乳制品酸度的测定》[16]中酸度测定的方法，每组酸奶测定3次，计算平均值，结果保留一位小数。
1.3.5 质构分析
采用CT3 25K型质构仪对酸奶进行质构分析（texture profileanalysis，TPA）。设定参数如下：探头型号TA25/1000；平端直径50 mm；测试前探头下降速度10.0 mm/s；测试速度1.0 mm/s；测试后探头回程速度1.0 mm/s；时间5.00 s；测试距离15.00 mm；触发力5 g。
测定指标：第一循环硬度、粘力、弹力、胶着力。每组酸奶均测定3个平行。
1.3.6 有机酸的测定
采用高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）对酸奶中的有机酸进行定量分析。色谱条件：Agilent XDB-C18柱（5μm，4.6mm×250mm）；检测温度：35℃；流动相：0.01 mol/L磷酸二氢铵缓冲溶液（pH=2.8）和甲醇（95∶5，V/V）；流速：0.6 mL/min；进样量：10 μL；最大柱压：1 500 Pa；可见光-紫外吸收检测器，检测波长：215 nm。
1.3.7 感官评价分析
建立感官评价小组：在感官分析实验室里，根据GB/T 16291.1—2012《感官分析选拔、培训与管理评价员一般导则》[17]中提到的方法开展感官能力、感官灵敏度和描述能力的测试，筛选人员后进行感官分析基础知识、识别及标度的使用等感官描述性分析专项培训。通过该培训具有合格资格的8名评价员组成酸奶的感官评价小组。
建立酸奶感官描述词：参考KOPPEL K等[18-19]建立感官描述词的方法，根据MARISSSA M D等[20-21]建立的酸奶感官描述词和参照物，整理出候选的酸奶感官描述词，并将其与参照物、样品一起呈送给感官评价小组。参照GB/T 10221—2012《感官分析术语》[22]选取适当的参照物，再由评价小组讨论达成一致的采用0～15（0.5增量）的标度法来表示参照物强度。感官评价指标相应参比见表1。
表1 酸奶感官描述词汇
Table 1 Sensory description vocabulary of yoghurt
感官评价指标 定义参比香气风味口感、质地酸甜发酵味黄油味果香谷物味纸板味蒸煮味氧化气味奶香甜味酸味奶味发酵味黄油味刺激果味涩味蚀牙细腻度分散性白垩质黏附性黏度干燥感酸性产品的酸味香气特征与甜相关的香气由奶制品发酵产生的特征香气，有乳酸的气味有奶香、油腻的感觉，有时有发酵和闷的感觉熟透水果所具有的典型而浓郁的香气谷物特有的气味，带有土香、泥香、干草香、甜香等潮湿的硬纸或者纸的气味将牛奶高温处理后产生的类似加热毛巾的气味被氧化的脂肪或者油的一般气味，可能包括腥味与牛奶相关的特征香气的总称一种基本味觉，典型代表为蔗糖溶液一种基本味觉，典型代表为柠檬酸溶液与牛奶相关的特征风味的总称由奶制品发酵产生的特征风味，有乳酸的风味有淡淡的奶味、脂香，有时有发酵味和闷的感觉与酸、涩相关的整体强烈的印象具有甜、花香的味道，往往与成熟的水果相关，如草莓、黄桃在舌头或口腔表面产生干燥的感觉牙齿表面有被磨损或者烘干的感觉样品中可感知到颗粒的大小和数量样品在口腔中不经咀嚼而分散开的程度嘴里有干，粉状的感觉，可感知颗粒形成薄膜在吞咽样品后，在牙齿上能感知到的残渣的数量将一定量的样品放在舌头上，将舌头慢慢移动到上颚，感知样品流过舌头的速度样品吞咽30s后，舌头、上颚、喉咙感到干燥的感觉君乐宝每日活菌乳酸菌饮料=7 0.2%香兰素=11百吉福小三角奶酪=11蒙牛黄油块=7伊利大果粒混合物=10浸乳麦片=8泡水纸板=7干纸板=3.5热牛奶=9玉米油=7.5伊利纯牛奶=10 80 g/L蔗糖溶液=8 1 g/L柠檬酸溶液=7伊利纯牛奶=12.5百吉福小三角奶酪=8蒙牛黄油块=11苹果醋=10伊利大果粒混合物=10 1 g/L明矾溶液=5苹果醋=7百吉福小三角奶酪=13酒易膳食纤维素植物固体饮料=12雀巢鹰唛炼奶=13百吉福小三角奶酪=7.5百吉福小三角奶酪=8.5酒易膳食纤维植物固体饮料=5酒易膳食纤维素植物固体饮料=7百吉福小三角奶酪=7.5
1.3.8 数据处理
采用Microsoft Excel（2010）版软件制作苹果酸、乙酸、柠檬酸、乳酸各自的标准回归曲线并得出相应曲线方程、R2、RSD。应用XLSTAT 2016软件对酸奶的感官特征进行主成分分析（principle component analysis，PCA）和聚类分析（agglomerative hierarchical clustering，AHC）。
2 结果与分析
2.1 冻干菌粉活菌数
测得6株冻干菌粉的活菌数均在106 CFU/g以上，符合GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》[23]对酸奶制作的要求。
2.2 酸度
各组酸奶凝乳时间及强度结果见表2。由表2可知，添加干酪乳杆菌（GL2）和开菲尔乳杆菌（700）菌株的酸奶凝乳时间最短，为10 h，基础菌株发酵的酸奶凝乳时间最长，为13 h，说明添加这4种菌株均能提高其凝乳速度。五组的酸奶酸度符合GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》的要求，均在70°T以上。相较于组1，在保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌双菌发酵的基础上添加酵母菌（Y18）、干酪乳杆菌（GL2）、副干酪乳杆菌（GL6）、开菲尔乳杆菌（700）均会提高酸奶的酸度，其中分别添加GL2和700的酸奶的酸度明显增加，这两种菌与酸奶体系中的基础菌种具有相互促进作用，使得这两种菌相较于GL6和Y18生长的更好。添加酵母菌Y18的酸奶的酸度没有明显增加。
表2 各组酸奶凝乳时间及酸度
Table 2 Curd time and acidity of each group of yoghurt
组别 凝乳时间/h酸度值/°T凝乳时 后酸化1 d后 后酸化2 d后12345 13 10 12 10 12 85.8±0.2 100.1±0.1 90.1±0.2 99.6±0.1 87.7±0.1 97.7±0.1 113.0±0.2 102.2±0.1 113.3±0.1 100.4±0.2 99.6±0.2 114.3±0.1 104.0±0.1 114.1±0.1 103.2±0.2
研究表明[24-25]，酸奶的最佳酸度范围是80～120°T，乙醛、丁二酮等风味物质要经过充分的后酸化过程才能达到发挥最佳效果的剂量，同时酸奶的组织状态也会因此变得更加粘稠和坚实。本试验中各组发酵乳凝乳时及后酸化的酸度均在80～120°T，说明这五种菌株添加不会引起不愉悦的口感。
2.3 质构
对发生后酸化1 d的酸奶进行质构分析，结果如表3所示。在基础酸奶发酵剂的基础上添加干酪乳杆菌（GL2）、副干酪乳杆菌（GL6）、开菲尔乳杆菌（700）会显著提高酸奶的第一循环硬度、弹性和胶着性（P＜0.05），其中组2样品第一循环硬度、弹性和胶着性最大，其次是组4，最后是组3。组5与组1的质构特征最为接近。五组酸奶的粘力都保持在20～25 g之间，差距并不明显，说明这几株菌的添加对酸奶的粘力影响是不大的。同时，酸化1d后酸奶的酸度与第一循环硬度、弹性、胶着性呈相同变化趋势，说明酸奶的酸度改变对酸奶的组织结构状态和黏稠度等会产生影响。
表3 酸奶质构分析结果
Table 3 Results of texture analysis of yoghurt
注：字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
组别 第一循环硬度/g 粘力/g 弹性/mm 胶着性/g 12345 110±2d 141±1ae 132±1be 136±2a 116±3c 22±1ac 23±3ac 25±3a 21±2bc 22±2ac 4.38±0.2d 9.82±0.1a 5.16±0.2c 7.33±0.1b 4.61±0.3d 64±2a 86±3ac 76±1bc 81±1ce 67±2de
2.4 有机酸含量
采用高效液相色谱仪对酸奶中的乳酸、乙酸、苹果酸、柠檬酸这4种代表性有机酸进行定性和定量的测定，目的是对比五组酸奶中存在的有机酸成分差异。将五组酸奶样品进行HPLC分析，再将测得的五组酸奶中这4种有机酸的峰面积代入4种有机酸的标准曲线回归方程中计算出各自的含量，结果如表4所示。
表4 五组酸奶中四种有机酸的含量
Table 4 Contents of four organic acids in five groups of yogurt
组别有机酸/（mg·g-1）乳酸 柠檬酸 乙酸 苹果酸1 2 3 4 5 14.11±0.43 15.66±1.32 15.48±0.89 15.81±1.21 13.62±0.73 17.89±1.43 17.10±2.01 17.95±1.07 18.72±0.53 13.40±1.51 0.38±0.12 0.55±0.09 1.12±0.33 0.90±0.43 1.44±0.58 6.53±0.93 4.16±1.63 7.42±0.56 5.45±1.83 6.57±0.47
乳酸是通过乳酸菌代谢生成的非挥发性风味物质，是发酵乳特有风味的主要来源。由表4可知，除了Y18，其他3种菌株的添加均增加了酸奶的乳酸含量。柠檬酸是通过丙酮酸生物合成而来，可以代谢生成某些醇类物质，是发酵乳中特征风味物质的前提物质。酵母菌Y18的添加明显降低了发酵乳中柠檬酸含量，其他四组样品柠檬酸含量差异不大。乙酸可以反应成酯或氨基化合物，用作酸度调节剂、增味剂、香料等，为发酵乳提供挥发性风味。乙酸在五组酸奶中的含量都很低，均＜2 mg/g。组5中，虽然乳酸和柠檬酸的含量都远远低于其他组，但是其乙酸含量最高，达到1.44 mg/g，这可能与酵母菌在缺氧条件下额外生成的乙醇发生氧化有关。干酪乳杆菌GL2和开菲尔乳杆菌700的添加降低了酸奶的苹果酸含量，副干酪乳杆菌GL6添加升高了酸奶的苹果酸含量。
2.5 感官评价
2.5.1 感官评分
由感官评价小组对5组酸奶样品和1组市售酸奶进行感官分析，最终的感官评分如表5所示。6组样品感官评价总分为79.00分～92.55分，其中组2感官评价总分最高为92.55分，其次是组5和组4，感官评价总分分别为89.67分和89.56分，组1的感官评价总分为86.52分，组3和市售酸奶的感官评价总分最为接近，分别为79.17分和79.00分。
表5 六组酸奶的感官评分
Table 5 Sensory scores of 6 groups of yogurt
香气组号 TY LS LSGL2 LSGL6 LS700 LSY18酸 甜发酵味黄油味果香谷物味纸板味蒸煮味氧化气味奶香3.17±0.29 3.50±0.00 3.50±0.00 2.50±0.50 0.83±0.29 0.83±0.29 1.00±0.00 1.50±0.50 0.83±0.29 2.83±0.29 2.83±0.29 2.83±0.29 4.50±0.50 2.50±0.50 0.17±0.29 0.00±0.00 0.83±0.29 0.83±0.29 0.17±0.29 3.17±0.29 3.33±0.58 3.83±0.29 4.00±2.00 3.83±0.76 1.83±0.76 1.00±0.00 1.83±0.76 1.83±1.26 1.67±1.26 3.17±0.29 3.50±0.50 2.50±1.00 3.00±0.50 2.50±0.00 0.83±0.29 0.83±0.29 0.83±0.29 2.00±1.00 1.17±0.76 3.00±0.50 3.92±0.14 3.33±1.44 3.83±0.29 2.58±0.72 0.50±0.50 0.92±0.72 1.25±0.43 1.17±0.29 1.17±0.76 2.17±0.29 3.50±0.50 2.17±0.29 3.83±0.29 4.17±0.29 2.00±0.50 0.83±0.29 1.50±0.50 1.83±0.29 0.83±0.29 3.50±0.50
续表
组号 TY LS LSGL2 LSGL6 LS700 LSY18风味口感、质地甜味酸味奶味发酵味黄油味刺激果味涩味蚀牙细腻度分散性白垩质黏附性干燥感4.00±0.50 5.00±0.50 6.50±0.50 4.50±0.00 3.83±0.29 3.17±0.29 1.17±0.29 3.50±0.50 3.17±0.29 9.50±0.50 2.17±0.29 4.00±0.00 4.17±0.29 3.83±0.29 3.83±0.29 5.17±0.29 7.50±0.50 4.17±0.29 2.17±0.29 5.00±1.00 0.17±0.29 3.17±0.29 3.50±0.50 8.50±0.50 7.17±0.29 4.17±0.29 4.17±0.29 5.00±0.00 4.83±0.76 3.17±0.76 6.33±0.29 3.33±0.29 3.58±1.13 3.83±0.29 2.92±0.88 2.83±0.29 4.33±4.04 8.83±0.29 9.17±0.76 4.08±0.14 5.17±0.76 3.83±0.29 3.17±0.76 4.17±0.29 4.17±0.29 4.00±1.00 2.50±0.50 3.00±0.00 1.00±0.50 3.50±0.50 2.83±0.29 10.50±0.50 8.17±0.29 4.17±0.29 4.00±0.50 3.83±0.29 3.83±0.29 5.83±0.29 5.50±1.80 4.67±1.53 3.83±0.29 6.83±0.29 0.83±0.29 2.83±0.29 4.58±3.64 10.08±0.88 5.00±1.00 4.08±1.13 6.83±0.29 4.00±0.00 5.17±0.29 3.50±0.50 6.00±0.00 4.50±0.50 5.17±0.29 3.50±0.50 0.50±0.50 3.17±0.29 2.83±0.29 10.00±0.00 8.17±0.29 3.17±0.29 5.00±0.00 4.83±0.29
2.5.2 主成分分析
通过XLSTAT2016软件对表5结果进行分析。酸奶样品和感官指标在F1/F2坐标中的分布情况如图1所示。LS700作为唯一一组在第二象限的酸奶样品，与其余5组酸奶样品感官特性差距较大。LSGL2位于第四象限X轴最右面，在果香、蒸煮味、纸板味方面表现突出，虽然LSGL2与LSY18在纸板味、谷物味方面表现相似，但是LSY18具有更突出的甜味和黄油味。尽管LS、TY和LSGL6均在第三象限，但是在Y轴上的LSGL6与市售酸奶TY的感官属性更为接近，尤其是在干燥感、奶味、涩味这三方面，LS则在口感质地方面略微蚀牙。
图1 酸奶样品与感官指标在F1/F2坐标中的分布图
Fig.1 Distribution diagrams of yoghurt samples and sensory evaluation indexes in F1/F2
2.5.3 聚类分析
对酸奶样品的感官特征强度进行聚类分析，得到的树形图如图2所示。由图2可知，6组酸奶样品可分为三类：第一类是LS700，具有突出的发酵味，且细腻度和黏附性表现突出，这与该组酸奶的TPA检测结果相符；第二类有LSGL2和LSY18，它们在果味、谷物味、纸板味、果香特征表现较显著，在分散性方面较相似；由于LS、LSGL6、TY这三组酸奶样品在蚀牙、干燥感、涩味、奶味方面表现较为突出且相似，故这三组被归为成第三类。
图2 酸奶的凝聚层次聚类树形图
Fig.2 A gglomerative hierarchical clustering dendrogram of yoghurt
3 结论
复合发酵剂可直接影响酸奶的品质特性。向基于保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为主要乳酸菌的牛乳中分别添加干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、酵母菌、开菲尔乳杆菌进行混合发酵，添加第3种菌种会增加酸奶体系的酸度，其中添加干酪乳杆菌（GL2）和开菲尔乳杆菌（700）的酸奶酸度变化较大，说明GL2和700在保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的酸奶系统中长势较佳。酸度的大小影响着酸奶的稠实和弹性，以添加干酪乳杆菌（GL2）的酸奶在弹性（9.82mm）、胶着性（86 g）方面最为突出。5组样品4种有机酸含量由高到低依次是：柠檬酸、乳酸、苹果酸、乙酸，添加GL2、700和GL6提高了酸奶中乳酸的含量。添加干酪乳杆菌（GL2）的酸奶感官评分最高，在果香、蒸煮味、纸板味方面表现突出，但添加副干酪乳杆菌（GL6）的酸奶的感官特征与市售酸奶最为接近。
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