葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一种应用广泛的工业用酶，如畜牧、食品、医疗等行业[1-2]。GOD在分子氧的存在下，可专一催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸内酯[3]，葡萄糖酸内酯在非酶促条件下自发与水结合生成葡萄糖酸与过氧化氢[4]。
目前产葡萄糖氧化酶的菌株主要为陆地来源的霉菌及其工程菌[5-6]，也有少数细菌[7-8]，而产葡萄糖氧化酶的野生型酵母菌暂未见报道。提高酶活的方法有菌株诱变、基因定点突变、利用工程菌表达等[9-10]。霉菌发酵过程中产生的过氧化氢酶、纤维素酶、淀粉酶等其他多种副产物，对后期的分离纯化工作带来很大的困难，大大增加了生产成本[11]。酵母相对于霉菌具有易培养、副产物少等优势，有扩大生产的潜力[12]。
筛选及改良遗传性状获得新的高产菌株对提高工业生产效率和经济效益非常重要[13-15]。朱运平等[16]运用常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）对黑曲霉（Aspergillus niger）进行诱变使酶活达到180.74 U/mL。刘晓筱[17]用ARTP处理重组菌，结合高通量筛选方法，筛选得到产量明显提高的正向突变株T2，其摇瓶酶活达到15.8 U/mL，酶活比出发菌株提高了44%。但目前还未有关于产葡萄糖氧化酶的酵母菌的诱变研究。
本研究采用海洋源野生酵母菌株担子菌（Basidioascus sp.）WYQ 23为出发菌株，通过紫外诱变、化学诱变及复合诱变的方法对其进行诱变处理，旨在获得产活性高、稳定性好的低温葡萄糖氧化酶酵母突变菌株，并通过对突变菌株产的低温葡萄糖氧化酶的酶学性质进行研究，为该酶的工业化生产提供了潜在的优良的菌种资源。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
海洋源担子菌（Basidioascus sp.）WYQ23：保藏于辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，GenBank号为SUB4615397 Seq1 MK038973。
1.1.2 化学试剂
邻联茴香胺（分析纯）、硫酸二乙酯（分析纯）：美国Sigma公司；辣根过氧化物酶（60 U/mL）：生工生物工程（上海）股份有限公司。乙醇（纯度95%）、硫代硫酸钠：国药集团化学试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
显色筛选固体培养基：葡萄糖80 g/L，蛋白胨3 g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.7g/L，KCl 0.5g/L，NaNO3 4g/L，CaCO3 3.5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，脱氧胆酸钠0.2 g/L，海水配制，pH自然，121℃灭菌20 min。
种子液培养基：葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，海水配制，pH自然，121℃灭菌20 min。
发酵培养基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨3 g/L，CaCO3 6 g/L，MgSO4 0.7 g/L，KCl 0.3 g/L，KH2PO4 3 g/L，NaNO3 3 g/L，海水配制，pH自然，121℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
YXQ-LS-100SII立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司；HD-1360超净工作台：北京悦泰行科技发展有限公司；THZ-312台式恒温振荡培养箱：上海精胜科学仪器设备有限公司；Multiskan FC酶标仪：美国THERMO FISHER公司；pHB-4p酸度计：上海升隆公司。
1.3 实验方法
1.3.1 葡萄糖氧化酶粗酶液的制备
挑取一环平板上的菌株接种在种子液培养基中，25℃、160 r/min培养24 h后，以1%接种量转接于发酵培养基中，25℃、160 r/min培养38 h；将发酵液4℃、8 000 r/min离心20 min，取上清液即为粗酶液。
1.3.2 GOD酶活测定方法
将反应体系为5%葡萄糖溶液100 μL、0.07 g/L邻联茴香胺溶液200 μL、0.1 g/L辣根过氧化物酶溶液10μL的混合溶液与10 μL葡萄糖氧化酶标准样品或粗酶液[18-19]分别于25℃温育10 min后，将反应体系及标准样品或粗酶液迅速混匀，在波长500nm处测其0～5min吸光度值的变化（ΔA），每隔1min测一次[20-21]。GOD酶活（EAGOD）计算公式如下：
GOD酶活的定义：在上述实验条件下，每分钟催化氧化1 μmol/L的葡萄糖的酶量定义为一个酶活单位（1 U/mL）。
1.3.3 菌悬液制备
将保藏的海洋担子菌（Basidioascus sp.）WYQ 23接种至显色筛选固体培养基进行活化，将活化后的菌接种于种子液培养基中，25℃、160 r/min培养36 h，4 000 r/min离心10 min，得到菌体。用无菌海水稀释菌体至104 CFU/mL。
1.3.4 产低温GOD菌株的紫外诱变
吸取10 mL菌悬液于磁力搅拌器上的无菌培养皿中，用无菌转子不断搅拌。将紫外诱变仪（紫外线波长254 nm）置于平板上方18cm处，分别照射2min、4min、6min、8 min、10 min、12 min、14 min、16 min、18 min。以未照射的菌悬液作空白对照，吸取100 μL不同照射时间的菌悬液均匀涂布至显色筛选固体培养基上，25℃培养4 d，统计诱变前后的菌落数量变化，计算致死率，选择致死率80%～90%的平板挑取显色圈较大的菌株进行纯化及发酵培养，测其GOD酶活。致死率计算公式如下：
1.3.5 产低温GOD菌株的化学诱变
将1 mL的硫酸二乙酯与0.5 mL的无水乙醇混合均匀，加入到3.5 mL菌悬液中诱变，分别在5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min加入0.5 mL 25%硫代硫酸钠终止反应。以加入无菌海水处理的菌悬液做空白对照，吸取100 μL不同诱变时间的菌悬液均匀涂布至显色筛选固体培养基上，25℃静置培养4 d，统计诱变前后的菌落数量变化，计算致死率。选择致死率80%～90%的平板挑取显色圈较大的菌株进行纯化及发酵培养，测其GOD酶活。
1.3.6 产低温GOD菌株的复合诱变
以方法1.3.4节中紫外诱变所得产GOD酶活最高的菌株作为出发菌株，接种于种子液培养基中，25℃、160 r/min振荡培养36 h，4 000 r/min离心10 min，得到菌体。用无菌海水稀释菌体至104 CFU/mL。将1 mL的硫酸二乙酯与0.5 mL的无水乙醇混合均匀，加入3.5 mL菌悬液中诱变，分别在10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min加入0.5 mL 25%硫代硫酸钠终止反应。以加入无菌海水处理的菌悬液做空白对照，吸取100 μL不同诱变时间的菌悬液均匀涂布至显色筛选固体培养基上，25℃培养4d，统计诱变前后的菌落数量变化，计算致死率。选择致死率80%～90%的平板挑取显色圈较大的菌株进行纯化及发酵培养，测其GOD酶活。
1.3.7 遗传稳定性
将经筛选的高产GOD诱变菌株按斜面传代的方法连续传代8次，测量每次传代菌株的GOD酶活，考察其遗传稳定性。
1.3.8 酶学性质研究
（1）温度对酶活的影响
酶的最适温度：将酶液分别置于0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃孵育10 min后测其GOD酶活。以最高的酶活为100%，计算各温度条件下的相对酶活。
酶的温度稳定性：将酶液分别置于10℃、20℃、30℃、40 ℃、50 ℃孵育15 min、30 min、45 min、60 min后测其GOD酶活。以各温度最开始的酶活为100%，计算孵育后不同时间条件下相对酶活。
（2）pH值对酶活的影响
酶的最适pH：将酶液分别与pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液1∶1混合，在最适温度下孵育10 min后测其GOD酶活。以最高的酶活为100%，计算各pH条件下的相对酶活。
酶的pH稳定性：将酶液分别与pH值为3.0、4.0、5.0、7.0、8.0的磷酸缓冲液1∶1混合，在最适温度条件下孵育15 min、30 min、45 min、60 min后测其酶活。以各pH最开始的酶活为100%，计算孵育后不同时间条件下相对酶活。
（3）金属离子对酶活的影响
将酶液分别与0.035 mol/L的Ag+、Zn2+、Mg2+、Na+、Cu2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、K+、Ca2+溶液1∶1混合，在最适温度条件下孵育10 min后测其GOD酶活。
2 结果与分析
2.1 紫外诱变
对海洋担子菌（Basidioascus sp.）WYQ 23进行紫外诱变，其紫外照射致死率结果如图1所示。由图1可知，随着紫外诱变时间的增加，致死率也逐渐增大，在照射12 min时致死率为84.9%。通常情况下致死率在80%～90%时正突变率较高。因此，选择12 min为最佳紫外诱变时间。
图1 菌株紫外诱变致死率
Fig.1 Lethality rate of strains induced by ultraviolet mutation
在紫外诱变12 min对应的平板上筛选得到显色圈较大的8株菌进行发酵培养，每组实验3个平行，其GOD酶活测定结果如表1所示。
表1 紫外诱变菌株的葡萄糖氧化酶酶活
Table 1 Glucose oxidase activity of strain by UV mutation
菌株GOD酶活/（U·mL-1）菌株GOD酶活/（U·mL-1）WYQ 23-1-1 WYQ 23-1-2 WYQ 23-1-3 WYQ 23-1-4原始菌株2.16 1.72 2.10 2.09 1.67 WYQ 23-1-5 WYQ 23-1-6 WYQ 23-1-7 WYQ 23-1-8 1.88 2.25 2.20 1.82
由表1可知，紫外诱变后大部分菌株与原始菌株WYQ 23相比，产GOD性能均有所提高，其中菌株编号为WYQ 23-1-6的GOD酶活最高，为2.25 U/mL。
2.2 化学诱变
对海洋担子菌（Basidioascus sp.）WYQ 23进行化学诱变，其化学诱变致死率结果如图2所示。
图2 菌株化学诱变致死率
Fig.2 Lethality rate of strains induced by chemical mutation
由图2可知，随着化学诱变时间的延长，致死率也随着增加。在化学诱变25min时其致死率达到86.0%。
在致死率86.0%对应的平板上挑取显色圈较大的8株菌株进行纯化及发酵培养，其GOD酶活测定结果如表2所示。
表2 化学诱变菌株的葡萄糖氧化酶酶活
Table 2 Glucose oxidase activity of strain by chemical mutation
菌株GOD酶活/（U·mL-1）菌株GOD酶活/（U·mL-1）WYQ 23-2-1 WYQ 23-2-2 WYQ 23-2-3 WYQ 23-2-4原始菌株2.10 1.71 1.91 2.09 1.67 WYQ 23-2-5 WYQ 23-2-6 WYQ 23-2-7 WYQ 23-2-8 1.66 1.83 2.31 1.81
由表2可知，紫外诱变后大部分菌株与原始菌株WYQ 23相比，产GOD性能均有所提高，其中菌株编号为WYQ 23-2-7的GOD酶活最高，为2.31 U/mL。
2.3 复合诱变
对经过紫外诱变的菌株WYQ 23-1-6进行化学诱变，挑取显色圈较大的8株菌株进行纯化及发酵培养，其GOD酶活测定结果如表3所示。
表3 复合诱变菌株的葡萄糖氧化酶酶活
Table 3 Glucose oxidase activity of strain by compound mutation
菌株GOD酶活/（U·mL-1）菌株GOD酶活/（U·mL-1）WYQ 23-3-1 WYQ 23-3-2 WYQ 23-3-3 WYQ 23-3-4原始菌株2.30 1.77 2.04 2.33 1.67 WYQ 23-3-5 WYQ 23-3-6 WYQ 23-3-7 WYQ 23-3-8 2.14 1.82 1.95 2.16
由表3可知，复合诱变后大部分菌株与原始菌株WYQ 23相比，产GOD性能均有所提高，其中菌株编号为WYQ 23-3-4的GOD酶活最高，为2.33 U/mL。说明复合诱变与紫外、化学单一诱变相比较，正突变的效果相对较好。
2.4 遗传稳定性
将诱变之后酶活最高的诱变菌株WYQ 23-3-4进行8次传代培养，每传一代测其GOD酶活，结果如图3所示。
图3 菌株WYQ 23-3-4遗传稳定性
Fig.3 Genetic stability of strain WYQ 23-3-4
由图3可知，诱变株WYQ 23-3-4在1～8代范围内产GOD酶活较稳定，均维持在2.33 U/mL左右，说明诱变菌株WYQ 23-3-4具有较好的遗传稳定性。
2.5 酶学性质
2.5.1 温度对酶活影响
葡萄糖氧化酶的最适温度及及其稳定性见图4。由图4A可知，葡萄糖氧化酶活力在0～20℃范围内，随温度提高而上升；葡萄糖氧化酶活力在20℃时达到最高；葡萄糖氧化酶活力在温度＞20℃之后，随温度提高而下降。在0～40℃时酶活均高于80%。由图4B可知，当温度为10℃时其稳定性最好，处理1 h后其相对酶活仍＞85%。在50℃处理1 h，相对酶活降约80%。
图4 温度对葡萄糖氧化酶酶活的影响
Fig.4 Effect of temperature on glucose oxidase activity
2.5.2 pH值对酶活影响
葡萄糖氧化酶的最适pH及在20℃不同pH条件下测定纯化后的葡萄糖氧化酶活力，结果见图5。
图5 pH值对葡萄糖氧化酶酶活的影响
Fig.5 Effect of pH on glucose oxidase activity
由图5A可知，该酶的最适作用pH值范围在pH5.0～6.0，最适pH为5.5。由图5B可知，在pH 5.0处理1 h后其酶活仍保留88%左右。
2.5.3 金属离子对酶活的影响
在20℃、pH 5.5条件下在酶液中加入不同种类的金属离子，测定纯化后的葡萄糖氧化酶活力，结果见表4。由表4可知，金属离子Ag+、Zn2+、Fe2+中对酶活抑制作用较强，其酶活分别下降到原来的30.07%、36.18%、38.04%；Mg2+、K+对酶有激活作用，酶活分别提高到原来的104.31%及115.79%。
表4 金属离子对葡萄糖氧化酶酶活的影响
Table 4 Effect of metal ions on glucose oxidase activity
金属离子 空白 Ag+ Zn2+ Mg2+ Na+ Cu2+相对酶活/%金属离子相对酶活/%100 Ni2+67.12 30.07 Fe2+38.04 36.18 Fe3+96.83 104.31 Mn2+90.31 77.03 K+115.79 100.64 Ca2+88.01
3 结论
利用紫外诱变、化学诱变及紫外-化学复合诱变技术对一株海洋来源的产低温葡萄糖氧化酶担子菌（Basidioascus sp.）WYQ 23进行诱变育种，获得一株高产低温葡萄糖氧化酶的突变菌株Basidioascus sp.WYQ 23-3-4。该突变菌株GOD酶活为2.33 U/mL，是原始菌株的1.40倍。经8代传代培养实验表明，突变菌株WYQ 23-3-4产葡萄糖氧化酶能力稳定。该酶最适温度为20℃，在10～30℃可保持较高酶活；最适pH值为5.5，在pH5.0～6.0可保持较高酶活；金属离子Ag+、Zn2+、Fe2+中对酶活抑制作用较强，Mg2+、K+对酶有激活作用。综上，通过复合诱变可明显提高担子菌产低温葡萄糖氧化酶的能力，为对现有不足的有效解决方法之一。
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