柚子（Citrus maxima）又名文旦、香栾、朱栾、内紫等[1]。柚子含多种糖类、有机酸、维生素和各种无机盐，对人体十分有益[2-3]，可以在常温条件下放置几个月都不产生霉烂等变化，因此，人们称其为“天然水果罐头”[4]。从《本草纲目》可知，柚子对于化痰止咳、食欲不振、消化不良等均有疗效，且长时间吃柚子还可以美容养颜；柚子果肉及皮还含有生物活性物质生物苷[5]，可以降低血液黏稠度，减少血栓形成，对脑血管疾病如脑血栓、脑卒等也有较好的预防作用[6-8]。
柚子除了直接吃以外，还可以加工成生鲜面[9]、复合果汁[10]、果酱[11]、果脯[12]、果醋[13]和果酒[14]等，其果皮还可用来生产茶饮料[15]等。近年来，我国的柚子种植发展十分迅速，鲜果市场逐渐趋于饱和或过饱和状态，对其进行深加工寻求新途径以扩大柚果的产业链已成为亟待解决的问题[16]。
目前关于柚子酿酒、柚子酒发酵工艺条件优化的报道较少，因此，本研究以柚子为原料，在单因素试验的基础上，以酒精度为响应值，对柚子酒的发酵条件进行优化。为柚子酒的大规模生产提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
坪山柚：沃尔玛超市；安琪高活性酵母：湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；果胶酶（30万U/g）：江苏锐阳生物科技有限公司；亚硫酸、柠檬酸、硝酸铝、氢氧化钠、FeSO4·7H2O、水杨酸、碳酸钠（均为分析纯）、双氧水（30%）：成都科龙化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
FA2204B型电子天平：上海越平科学仪器有限公司；Q/GHSC型精密pH计：上海森信试验仪器有限公司；WYT-J型手持式糖度仪：成都豪创光电仪器有限公司；D2KW-4型电热恒温水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司；0-40型酒精计：国营河北省武强县仪表厂；722型可见光分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 柚子酒工艺流程与操作要点
原料预处理：柚子洗净，去皮、去籽，将去籽柚子果肉放入榨汁机破碎。
酶解：在用榨汁机破碎后的柚子果肉浆中加入50 mg/L SO2以防止杂菌污染，加入40 mg/L果胶酶酶解24 h。
过滤：用灭过菌的三层纱布进行过滤，以除去大颗粒的果肉或粗纤维等。
成分调整：加入白砂糖调节糖度为220 g/L，加入柠檬酸调节酸度为4.5 g/L。
发酵：接入酵母菌0.08%，在一定温度的恒温培养箱中发酵14 d。
陈酿：在15℃条件下进行陈酿。
澄清过滤：按照0.1 g/100 mL果酒的添加量称取皂土，将皂土在60℃的水中浸泡4 h，将浸泡后的皂土加入果酒中，澄清1 h，之后用硅藻土进行过滤，即得柚子酒成品。
1.3.2 柚子酒发酵条件优化单因素试验
在其他条件不变的情况下，分别考察水∶柚子汁（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3（V/V））、SO2添加量（30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L）、酵母菌接种量（0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）、发酵温度（20℃、24℃、28℃、32℃、36℃）对柚子酒酒精度的影响。
1.3.3 柚子酒发酵条件优化响应面试验
在单因素试验的基础上，根据Design-Expert软件中Box-Benhnken的设计原理，进行4因素3水平的响应面分析，以水∶柚子汁（X1）、SO2添加量（X2）、酵母菌接种量（X3）及发酵温度（X4）为自变量，以酒精度（Y）为响应值，确定各因素对响应值的影响，确定发酵的最佳条件。响应面试验因素与水平见表1。
表1 柚子酒发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology for pomelo wine fermentation conditions optimization
因素-1 0 1 X1水:柚子汁（V/V）X2SO2添加量/（mg·L-1）X3酵母菌接种量/%X4发酵温度/℃2:1 50 0.06 24 1:1 60 0.08 28 1:2 70 0.10 32
1.3.4 测定方法
可溶性固形物：用手持折光仪进行测定[17]；pH值：用pH计进行测定；比重：用比重计进行测定[18]；总酸：采用酸碱滴定法[19]；酒精度：采用蒸馏法[20]，用酒精计测量其酒精含量。
2 结果与分析
2.1 柚子酒发酵条件优化单因素试验
2.1.1 水与柚子汁体积比对柚子酒酒精度的影响
由图1可知，柚子酒酒精度随水与柚子汁体积比的变化呈先升高后降低的趋势，在水∶柚子汁为1∶1（V/V）时，酒精度达到最高值，为13%vol。可能是由于柚子汁中的某些物质的浓度会影响酵母菌的发酵，当浓度过低时使得发酵缓慢，而浓度过高时又会抑制酵母菌的生长代谢。因此，选择水∶柚子汁为1∶1（V/V）。
图1 水与柚子汁体积比对柚子酒酒精度的影响
Fig.1 Effect of water to pomelo juice ratio on the alcohol content of pomelo wine
2.1.2 SO2添加量对柚子酒酒精度的影响
二氧化硫有杀菌、增酸、抗氧化等作用，可以使果酒变得澄清，并且使得果酒中色素和单宁物质更容易溶解出来，优化果酒的口感和风味。由图2可知，随着SO2添加量的增加，酒精度随之增加，当SO2添加量为60 mg/L时，酒精度达到最大值，为12.0%vol，继续增加SO2添加量，酒精度开始降低。因此，选择SO2添加量60 mg/L。
图2 SO2添加量对柚子酒酒精度的影响
Fig.2 Effect of SO2addition on the alcohol content of pomelo wine
2.1.3 酵母菌接种量对柚子酒酒精度的影响
由图3可知，随着酵母菌接种量的增加，酒精度随之增加，当接种量为0.08%时，酒精度达到最大值，为11.8%vol，当接种量＞0.08%之后，酒精度反而开始降低。可能是因为酵母菌接种量较低时，发酵缓慢，酒精产生速率较低；随着接种量的增加，发酵加快，此时酒精度迅速上升，当继续增加接种量，酵母菌数量增加，酒中营养物质被大量消耗，代谢物堆积，不利于酵母菌生长，使发酵减慢，产酒精的速率减慢，所以随着酵母菌接种量的增加，反而会出现酒精度降低的情况。因此，选择酵母接种量为0.08%。
图3 酵母菌接种量对柚子酒酒精度的影响
Fig.3 Effect of yeast inoculum on the alcohol content of pomelo wine
2.1.4 不同发酵温度对柚子酒酒精度的影响
由图4可知，酒精度随着发酵温度的升高而逐渐增加，当发酵温度为28℃时，酒精度最高，为11.9%vol；当温度超过28℃之后，酒精度随温度升高开始下降。温度的高低会影响酵母菌的生理活性，温度过低，酵母菌生长代谢缓慢，发酵缓慢，造成发酵时间的延长；温度过高，不利于酵母菌的生长，影响发酵。因此，选择发酵温度为28℃。
图4 发酵温度对柚子酒酒精度的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on the alcohol content of pomelo wine
2.2 柚子酒发酵条件优化响应面试验
2.2.1 响应面试验结果与分析
表2 柚子酒发酵条件优化响应面试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of response surface methodology for pomelo wine fermentation conditions optimization
试验号 X1 X2 X3 X4 Y/%vol 1 2 3 4 5-1 1-1-1-1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 -1 12.2±0.17 12.0±0.10 11.8±0.06 12.7±0.15 11.3±0.10
续表
试验号 X1 X2 X3 X4 Y/%vol 6 7 8 9 1 0 0 0 0 -1-1 0 0 0 0 0 0 0 --11 1 -1-1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 1 1 -1 1 0 0 0 0 -1 1 -1 0 0 0 0 -1-1 1 1 -1 1 -1-1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 -1 1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 -1-1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 11.4±0.10 11.3±0.17 12.0±0.06 10.7±0.10 11.3±0.06 10.8±0.06 11.8±0.10 12.5±0.10 12.4±0.06 12.7±0.17 12.9±0.10 12.3±0.06 12.6±0.00 12.3±0.10 13.0±0.17 11.1±0.10 10.5±0.06 11.3±0.10 11.0±0.06 13.2±0.17 13.4±0.00 13.4±0.06
表3 回归模型的方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“**”表示差异极显著（P＜0.01）；“*”表示差异显著（P＜0.05）。
方差来源 自由度 平方和 均方 F值 P值 显著性X1 X2 X3 X4**X1X2******X1X3 X1X4 X2X3 X2X4 X3X4 X12 X22 X32 X42模型失拟项纯误差总和1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4*********10 4 28 0.910 0.021 0.300 0.300 0.300 0.040 0.040 0.022 0.022 0.090 2.050 2.430 0.170 18.450 21.720 0.400 0.032 22.15 0.910 0.021 0.300 0.300 0.300 0.040 0.040 0.022 0.022 0.090 2.050 2.430 0.170 18.450 1.550 0.040 0.008 0 29.52 0.68 9.79 9.79 9.84 1.30 1.30 0.73 0.73 2.93 66.57 78.95 5.52 600.33 50.46 4.98＜0.000 1 0.424 2 0.007 4 0.007 4 0.007 3 0.273 1 0.273 1 0.406 6 0.406 6 0.109 1＜0.000 1＜0.000 1 0.034 1＜0.000 1＜0.000 1 0.067 8
由表3可知，回归模型P＜0.000 1，表明模型方程极其显著，说明试验方法可靠可行；失拟项P=0.067 8＞0.05，不显著，说明回归方程拟合度很好，试验误差很小，模型选择恰当，能较好地反映出发酵工艺中各个因素和酒精度（Y）之间的真实关系，可用回归方程预测最佳的发酵参数；模型的回归决定系数R2=0.980 6，说明模型拟合程度很好，响应值的变化有98.06%来源于所选因素的变化，只有1.94%的变异不能用本模型解释。一次项X1、X3、X4对Y有极显著影响（P＜0.01），均为正效应；交互项X1X2对Y有极显著影响（P＜0.01），为正效应；二次项X12、X22、X42对Y的影响极显著（P＜0.01），均为负效应；X32对Y影响显著（P＜0.05）；其余变量的影响均不显著（P＞0.05）。
经回归拟合后，得到回归方程：
分别对二次回归方程的X1、X2、X3、X4求导，得到柚子酒最优发酵条件：水与柚子汁混合比例为1∶1.3386，SO2添加量为60.87mg/L，酵母菌接种量为0.093%，发酵温度为28.36℃。在此优化条件下，柚子酒酒精度理论值为13.45%vol。
2.2.2 柚子酒发酵工艺条件优化的响应面图
由图形的陡峭趋势比较可得出各因素参数对响应值影响的大小以及最优参数，图形曲面越陡峭，则说明其对响应值的影响越大。由图5可知，当水与柚子汁体积比为1∶1、SO2添加量为60 mg/L时，酒精度最高，且水与柚汁混合比对响应值的影响大于SO2添加量；当水与柚子汁体积比为1∶1、酵母菌接种量为0.08%时，酒精度最高，水与柚子汁混合比对响应值的影响大于酵母菌接种量；当水与柚子汁体积比为1∶1、发酵温度为28℃时，酒精度最高，可看出发酵温度对响应值的影响大于水与柚子汁体积比；当SO2添加量为60 mg/L、酵母菌接种量为0.08%时，酒精度最高，且SO2添加量对响应值的影响大于酵母菌接种量；当SO2添加量为60 mg/L、发酵温度为28℃时，酒精度最高，且发酵温度对响应值的影响大于SO2添加量；酵母菌接种量为0.08%、发酵温度为28℃时，酒精度最高，且发酵温度对响应值的影响大于酵母菌接种量。
图5 水与柚子汁体积比、SO2添加量、酵母菌接种量、发酵温度交互作用对柚子酒酒精度影响的响应曲面与等高线
Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interactions between water to pomelo juice ratio,SO2addition,yeast inoculum and fermentation temperature on the alcohol content of pomelo wine
2.2.3 验证试验
为方便实际操作，修改发酵条件为水与柚子汁混合比例为1.0∶1.3，SO2添加量60.9 mg/L，酵母菌接种量为0.09%，发酵温度为28℃。在上述最佳工艺条件下重复柚子酒发酵3次，测得的平均酒精度为13.4%vol，与二阶模型预测值13.45%vol基本一致，相对误差很小，可见模型可以较好地预测出实际柚子酒发酵完成后酒精度的情况，基于响应面分析法优化柚子酒发酵工艺条件参数是可靠的。
3 结论
本试验在单因素试验的基础上，以酒精度为响应值，进行4因素3水平响应面试验，确定发酵的最佳条件为水与柚子汁体积比为1.0∶1.3，SO2添加量60.9 mg/L，酵母菌接种量为0.09%，发酵温度为28℃，在此优化条件下，柚子酒发酵酒精度为13.4%vol。
[1]齐继成.保健品：柚子[J].保健食品与健康，2006（2）：44-45.
[2]郑淑娟.柚子的19种治理功效[J].世界热带农业信息，2014（5）：26.
[3]GENOVESE S,EPIFANO F,CARLUCCI G,et al.Quantification of 4-geranyloxyferulic acid a new natural colon cancer chemopreventive agent by HPLC-DAD in grapefruit skin extract[J].J Pharmaceut Biomed Anal,2010,53:212-214.
[4]张怡.福建特产柚子加工及综合利用技术的研究[D].福州：福建农林大学，2009.
[5]ROUSEFFRL.Flavor oilsand citrusqualityin citrusnutrition and quality[J].ACS Sympos Serie,1980,143:63-65.
[6]林蔚春，林顺昌.影响琯溪蜜柚品质的主要因素及提高品质的措施[J].柑橘与亚热带果树信息，2002（3）：11-14.
[7]陈孝，王鸿彪，李小强，等.柚子酒的研究进展[J].中国酿造，2018，37（8）：24-27.
[8]XU Q L,YANG H Y,YANG L L,et al.Inquiry of water-soluble polysaccharide extraction conditions from grapefruit skin[J].Engineering,2011,3:1090-1094.
[9]游新侠，郭楠楠，贾庆超.火龙果皮柚子皮复合保健生鲜面的研制[J].保鲜与加工，2018，18（2）：74-79.
[10]刘畅，冯建文，旷慧，等.红树莓柚子复合果汁配方优化[J].食品工业科技，2018，39（3）：143-147，152.
[11]袁利鹏，杨君.低糖柚子皮菠萝复合果酱的工艺研究[J].中国酿造，2009，28（6）：182-185.
[12]黄晓钮，堪国莲，李维文，等.袖子砂囊低糖果脯加工技术[J].广州食品工业科技，1998，14（1）：37-38.
[13]靳桂敏，贺银凤，钟震雄.柚子果醋及其饮料生产工艺研究[J].中国酿造，2007，26（2）：64-66.
[14]艾合麦提·艾尔肯，古丽柯子·艾尔肯，潘丽梅，等.柚子复合保健酒的研制[J].中国酿造，2013，32（7）：137-140.
[15]刘欣，郭梅，蔡联男，等.带果皮和果粒蜂蜜柚子茶饮料的研制[J].食品研究与开发，2016，37（23）：86-89.
[16]夏瑞，徐婧，曾继吾，等.柚类生产贸易现状及国内研究概况[J].广东农业科学，2009（7）：328-331.
[17]王琼雅，夏君霞，吴镇君，等.近红外光谱分析技术在植物蛋白饮料定量分析中的应用[J].中国酿造，2017，36（11）：143-148.
[18]苏龙，吕凤丹，王雪儒，等.响应面优化杨梅果酒发酵工艺及其抗氧化性[J].食品工业科技，2017，38（20）：146-151.
[19]李敏杰，熊亚.玛咖芒果酒发酵工艺条件的研究[J].食品工业，2017，38（2）：145-149.
[20]孙慧，亓洪斌.营养型复制酒中的酒精度与总糖的测定[J].酿酒，1998（1）：46-47.