氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一种广谱抗生素，价格低廉，应用效果较好，对细菌有很好的抑制作用，曾经在渔、牧业中应用广泛。由此导致相应的动物源性食品受到了氯霉素污染，通过食物链被人体摄入，可能引发多种疾病[1-5]。
国际食品学界将氯霉素列为禁药，欧盟、美国等均规定了氯霉素残留限量标准为不得检出。欧盟“2002/657/EC”标准规定，氯霉素在动物源性食物中的最大检出限是0.3 μg/kg[6]。我国农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》规定了氯霉素在所有食品动物的可食用组织中不得检出，并将其从《中国兽药典》中删除，列为禁药。我国规定氯霉素不得检出，目前，检测氯霉素的方法有物理化学法和免疫化学法等[7-10]，前者包括高效液相色谱法[11-13]、质谱法[14-16]等，后者主要为酶联免疫法[17]。化学发光免疫法[18]具有检测速度快、自动化程度高、特异性好、稳定可靠等优势[19-20]。与酶联免疫法和理化检测方法相比，检测限高几个数量级。化学发光检测方法具有明显的成本优势，更加适宜于基层实验室的大批量样本检测。因此，本研究通过制备出检测鱼肉和虾肉中氯霉素的化学发光检测试剂盒，为基层实验室提供选择。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
氯霉素标准品：北京标准物质研究中心；甲醇、钯炭催化剂、二甲基甲酰胺、氯甲酸异丁酯、尿素、淀粉碘化钾试纸、卵清蛋白、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、鲁米诺：北京百欣试剂公司；10kg草鱼肉和10 kg对虾肉：城北批发市场；发光底物液、复溶工作液、小鼠脾细胞：北京勤邦生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
HMC-D2全自动化学发光免疫分析仪：北京勤邦生物技术有限公司；MX-F涡旋仪：湖南湘立科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 抗原制备
（1）半抗原的制备
将30 mg氯霉素溶于甲醇中，加入5%的钯炭催化剂（Pd/C），通入氢气，保持一定压力，室温反应2 h，过滤（5 mL针筒中加棉花和滤纸，压滤）除去Pd/C，蒸干溶剂得到淡黄色黏稠液体，既得氯霉素半抗原。Pd/C与氯霉素的摩尔比为1∶10。将上述得到的目标物在0～5℃条件下，用1 mol/L盐酸调pH值为1～2，搅拌下滴加0.1～1 mol/L的NaNO2溶液，使淀粉碘化钾试纸变蓝，再滴加0.1～1 mol/L尿素溶液，使淀粉碘化钾试纸变浅蓝，再加0.1～1 mol/L的NaOH溶液调pH值为7～9，得到清液作为溶液A备用。
称取71.5 mg牛血清白蛋白（BSA）溶于5mL0.1mol/L的碳酸盐缓冲液中，4℃预冷。用1mol/LNaOH调BSA的pH至8。将配制好的溶液A液迅速加入BSA中，4℃搅拌反应4 h。氯霉素半抗原的合成路线见图1。
图1 氯霉素半抗原合成路线
Fig.1 Synthesis route of chloramphenicol hapten
（2）免疫原的制备
取氯霉素半抗原30 mg，用1.5 mL水溶解，得到（I）液；取50%的戊二醛（glutaraldehyde，GA）水溶液10 μL加入（I）中，室温下搅拌反应18 h，得到（II）液；用1.5 mL水稀释100 mg BSA，将其加至（II）液中；反应过夜，再加入24 mg NaBH4，反应3 h；最后用三蒸水透析48 h，即得免疫原。
1.3.2 单克隆抗体制备
将1.3.1得到的氯霉素免疫原免疫小鼠，制备氯霉素单克隆抗体[21]。
1.3.3 试剂盒检测方法
配制质量浓度依次为0、0.025 μg/L、0.1 μg/L、0.4 μg/L、1.6μg/L、6.4μg/L的氯霉素标准品，用全自动化学发光免疫分析仪绘制标准曲线，计算检测结果。
1.3.4 鱼肉和虾肉样本的前处理方法
用均质器均质样本；称取3.0±0.05g均质后的样本，加入6 mL乙酸乙酯，涡旋3 min，混匀；3 000×g，室温（20～25℃）离心5 min；取2 mL乙酸乙酯相至8 mL玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1 mL正己烷，涡旋30 s，再加入1 mL复溶液，涡旋1 min，混匀，3 000×g，室温（20～25 ℃）离心5 min；除去上层有机相，取下层水相用于分析。
1.3.5 检测性能
（1）检测限
测定20份鱼肉和虾肉空白样本，利用空白样本浓度的平均值加上3倍标准差，计算检测限（limit of detection，LOD）[22]。
（2）精密度和准确度
我国农业部发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》规定了氯霉素在动物性食品中禁止检出。参考《农残办技术材料要求及审查程序》规定，即对于禁用药物，添加浓度至少为1倍定量限和2倍定量限。因此，本研究分别对鱼肉样本添加氯霉素，使其质量浓度达到0.05 μg/kg、0.1 μg/kg和0.2μg/kg，测定回收率，用来评价准确度。另外，每个样本做4个平行，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），用来评价精密度。
（3）稳定性测定
将试剂盒放置于4℃保存，每月测定一次鱼肉样本的回收率和半抑制浓度（halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50），连续测定12个月。
（4）抗体特异性测定
选择氯霉素的结构类似物：棕榈氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考胺，检测氯霉素及其类似物的IC50，根据交叉反应率公式计算该试剂盒对于棕榈氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考胺的交叉反应率，计算公式如下：
2 结果与分析
2.1 半抗原鉴定
利用核磁共振氢谱法测定1.3.1制备的半抗原，化学位移δ=6.27 ppm的吸收峰为氯霉素硝基还原成氨基的氢吸收峰，如图2所示，该信号的出现说明半抗原合成成功。由于各个核磁仪器的场强不同，对同一样品测出的“绝对”频率位移也会不一样。
图2 氯霉素半抗原核磁共振氢谱
Fig.2 1H NMR of chloramphenicol hapten
2.2 标准曲线
配制质量浓度依次为0、0.025μg/L、0.10μg/L、0.40μg/L、1.6μg/L、6.4μg/L的氯霉素标准品，利用全自动化学发光免疫分析仪测定空白溶液吸光度值B0及各样品吸光度值B，结果见图3。
图3 氯霉素标准曲线
Fig.3 Standard curve of chloramphenicol
由图3可知，标准曲线的线性范围为0～6.4 μg/L，经回归拟合得到标准曲线方程为y=-1.9518x-1.4909，R2=0.9985，IC50为0.187 μg/L，检测灵敏度为0.025 μg/kg。
2.3 检测限
通过测定20个鱼肉空白样本中氯霉素质量浓度，根据1.3.5计算检测限，结果见表1～2。
表1 鱼肉空白样本检测限测定结果
Table 1 Detection limit results of blank sample of fish μg/kg
样本号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10测定值样本号0.011 11 0.021 12 0.009 13 0.029 14 0.006 15 0.012 16 0.017 17 0.029 18 0.029 19 0.029 20测定值平均值0.018 0.005 0.013 0.0070.022 0.030 0.001 0.0240.029 0.024 0.011标准偏差0.010检测限0.047
表2 虾肉空白样本检测限测定结果
Table 2 Detection limit results of blank sample of shrimp μg/kg
样本号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10测定值样本号0.024 11 0.020 12 0.032 13 0.019 14 0.027 15 0.029 16 0.025 17 0.024 18 0.026 19 0.006 20测定值平均值0.019 0.005 0.022 0.0100.012 0.005 0.026 0.0220.025 0.013 0.004标准偏差）0.009检测限0.045
由表1～表2可知，测定20个鱼肉样本中氯霉素平均值为0.018μg/kg，标准偏差为0.010μg/kg，检测限为0.047μg/kg；测定20个虾肉样本中氯霉素平均值为0.019 μg/kg，标准偏差为0.009 μg/kg，检测限为0.045 μg/kg。
2.4 精密度
根据1.3.5，测定添加0.05 μg/kg、0.1 μg/kg和0.2 μg/kg质量浓度的氯霉素鱼肉样本，用来评价精密度和准确度，试验结果见表3。
表3 鱼肉加标回收率及精密度试验
Table 3 Standard recovery and precision tests of fish sample
本底量 添加量/（μg·kg-1）回收率/%批内RSD（n=4）/%批间RSD（n=3）/%00.057.5 00.17.2 00.2 94.9 87.2 100.9 96.7 93.8 105.5 99.4 102.5 103.8 97.5 109.3 88.3 91.5 96.1 87.9 104.8 93.7 83.5 95.3 102.4 88.4 99.0 102.5 103.1 93.1 85.6 95.3 86.8 102.5 94.1 84.0 105.6 92.7 95.8 100.4 99.2 5.0 9.3 6.4 7.1 5.5 8.6 5.1 7.9 9.1 7.0
由表3可知，用试剂盒检测鱼肉中氯霉素的回收范围在83.5%～109.3%之间，批内相对标准偏差范围是5.0%～9.3%；批间相对标准偏差范围是7.0%～7.5%。批内批间相对标准偏差均＜10%，说明试剂盒准确度及精密度较好。
2.5 稳定性
4℃下储存试剂盒，每月检测一次IC50和回收率，用来评价试剂盒稳定性，结果见表4。
表4 试剂盒在4℃保存的稳定性
Table 4 Stability of the kit kept at 4℃
保存时间/月IC50/（μg·L-1）回收率/%1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 0.189 0.133 0.123 0.243 0.139 0.140 0.134 0.207 0.125 0.215 0.204 0.152 106.6 92.8 106.4 92.3 100.0 85.4 98.6 95.4 92.6 84.4 85.1 83.7
由表4可知，测定无添加氯霉素试剂盒的IC50范围是0.123～0.243 μg/L，回收率范围在83.7%～106.6%之间，两项指标均在正常范围之内。4℃条件下试剂盒能够保存12个月。
2.6 抗体特异性的测定
氯霉素抗体与棕榈氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考胺的交叉反应率见表5。
表5 交叉反应率试验
Table 5 Cross reaction rate tests
药物名称 氯霉素棕榈氯霉素 甲砜霉素 氟甲砜霉素 氟苯尼考胺交叉反应率/% 100 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1
由表5可知，氯霉素抗体与棕榈氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考胺的交叉反应率均＜1%，说明氯霉素抗体特异性较好。
2.7 讨论
通过酶联免疫方法检测氯霉素居多，而化学发光检测方法应用于快速检测行业尚不成熟，因此，本研究具有一定的研究价值。陈霞等[9]研究发现，高灵敏度酶联免疫法对动物源性产品中氯霉素的检测限在0.1 μg/kg以下，没有本研究的试剂盒灵敏。
3 结论
本研究通过制备抗氯霉素单克隆抗体，研发出检测水产品中氯霉素的化学发光试剂盒，试剂盒的标准曲线范围为0～6.4 μg/L，对鱼肉和虾肉的检测限分别为0.047 μg/kg和0.045 μg/kg；回收率（鱼肉）是83.5%～109.3%，批内相对标准偏差范围是5.0%～9.3%，批间相对标准偏差范围是7.0%～7.5%。特异性良好，氯霉素单克隆抗体与棕榈氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考胺的交叉反应率均＜1%。化学发光试剂盒在4℃下保存12个月，IC50和回收率指标均正常，稳定性较好。
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